Da Veloce imaging di fluorescenza di Molecular legge Diffusione su membrane cellulare dal vivo in un microscopio commerciale

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la legge di diffusione dei lipidi e delle proteine nelle membrane cellulari vive per fare ciò. In primo luogo, la funzione di diffusione del punto del microscopio viene calibrata mediante imaging di sfere fluorescenti nanoscopiche. Successivamente, i vettori basati sui liposomi, tra cui una molecola di interesse marcata in fluorescenza, vengono preparati e introdotti in cellule vive mediante trasfezione o incorporazione diretta.

L'imaging rapido della membrana plasmatica delle cellule vive viene eseguito mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Infine, viene calcolata la funzione di correlazione e la legge di diffusione molecolare viene estratta mediante fitting gaussiano. I dati risultanti.

Identificare la modalità di movimento del lipide o della proteina oggetto di indagine. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al recupero convenzionale della fluorescenza dopo l'approccio del fotosbiancamento o la classica spettroscopia di correlazione della fluorescenza a punto singolo è che consente di misurare la legge di diffusione molecolare. Conosciamo una conoscenza prioritaria del sistema.

Anche in contrasto con le classiche metodologie di tracciamento delle singole particelle. Qui, gli spostamenti mulari vengono misurati senza la necessità di estrarre le traiettorie delle particelle. Di conseguenza, questo metallo può essere facilmente utilizzato in combinazione con molecole relativamente ritenute e dense come, ad esempio, proteine fluorescenti geneticamente codificate.

Nel complesso, questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia molecolare cellulare, come ad esempio come il movimento delle proteine o dei lipidi regola la struttura della membrana plasmatica e l'organizzazione funzionale risposta a queste e domande correlate saranno rese disponibili a tutti e utilizzando solo un microscopio commerciale, la dimostrazione della procedura complessiva sarà eseguita da zo, uno studente di dottorato del laboratorio. Iniziare questo protocollo calibrando la funzione di diffusione dei punti del sistema di imaging. Iniziare diluendo 10 microlitri di una soluzione di perle fluorescenti in 90 microlitri di acqua distillata precedentemente aggiunta a una provetta da centrifuga da 500 microlitri.

Sonicare la soluzione per 20 minuti in un bagno di sauna con un bisturi, tagliare un pezzo quadrato di un centimetro di gel di rosa AGA al 3% e metterlo in una capsula di Petri. Depositare 10 microlitri della soluzione di perline fluorescenti diluite sulla parte superiore del gel. Quindi, usando una pinza, capovolgere il pezzo di gel in una capsula di Petri di vetro di due centimetri.

Ancora una volta, usando il forcipe. Spingere verso il basso il pezzo di gel per disperdere la goccia. Successivamente, attiva la configurazione di acquisizione, che consiste in un microscopio commerciale a fluorescenza a riflessione interna totale.

Dotato di un'incubatrice e di una veloce telecamera E-M-C-C-D collegata a un computer che esegue una suite di applicazioni, un software fluorescente avanzato e/o un software di acquisizione immagini Solis. Posizionare il campione nel supporto sul tavolino del microscopio utilizzando il raccordo a I e la luce trasmessa. Concentrati sul bordo del gel.

Quindi centrare il gel sull'obiettivo e regolare la messa a fuoco per avviare la procedura di allineamento laser nella suite di applicazioni Leica, il software fluorescente avanzato seleziona l'allineamento automatico e segui la procedura di allineamento automatico. Dopo che il laser è stato allineato nel software di acquisizione and o Solis, fare clic sul pulsante delle impostazioni. Si aprirà una finestra.

Imposta l'esposizione della fotocamera su 100 millisecondi, l'EM guadagnato a 1000, la ripetizione a 100 e seleziona la casella di controllo di trasferimento fotogrammi. Quindi fare clic sulla finestra di salvataggio automatico e inserire il nome dell'esperimento. Trova un campo visivo con singoli punti isolati.

Concentrati su un punto luminoso, che di solito rappresenta un aggregato di perline. Quindi acquisisci 100 fotogrammi. Ripetere questo passaggio cinque o sei volte per acquisire immagini di diversi punti singoli.

Importa le serie acquisite in un programma di elaborazione dati come MATLAB e calcola la media dello stack nel tempo. Quindi visualizzare l'immagine dell'intensità media misurata. Ingrandisci un punto fluorescente piccolo e luminoso e identifica approssimativamente il centro come il pixel più luminoso del punto.

Infine, seleziona la dimensione della regione di interesse che desideri disegnare attorno alla particella, in genere un micron accanto per adattare la distribuzione di intensità selezionata con una funzione gaussiana. Selezionare il comando gause fit. Ispezionare i residui ottenuti per verificare la bontà dell'adattamento.

Infine, calibrare la fotocamera come descritto nel documento allegato. Una volta calibrato il sistema, è il momento di etichettare le celle per l'acquisizione dell'immagine. Iniziare a preparare i liposomi necessari per l'incorporazione dei lipidi sciogliendo un milligrammo di DOPE, un milligrammo di D-O-T-A-P e un milligrammo di DPE ADO 4 88 ciascuno in una provetta da microcentrifuga separata contenente un millilitro di cloroformio.

Successivamente, combinare 0,5 millilitri di ciascuna delle soluzioni DOPE e D-O-T-A-P con 25 microlitri di soluzione PPE ATO 4 88. Mettere la provetta in un evaporatore centrifugo e iniziare la centrifuga a 280 gs. Avviare la pompa del vuoto e lasciarla girare per 24 ore.

Il giorno successivo, aggiungere 0,5 millilitri di tampone heis da 20 millimolari al tubo e agitarlo per 15 minuti. Quindi posizionare il tubo in un bagno sonico e sonicare per 15 minuti a 40 gradi Celsius. Per preparare le cellule, lavare una piastra P 100 di ovaio di criceto cinese confluente o CHOK, una cellula tre volte con 10 millilitri di PBS.

Quindi aggiungere un millilitro di tripsina e incubare a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica per cinque minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere nove millilitri di D-M-E-M-F 12 integrato con il 10% di FBS per sospendere le cellule che seminano 150 microlitri di questa soluzione contenente cellule. In una capsula di Petri con fondo di vetro da 22 millimetri contenente 800 microlitri dello stesso mezzo.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 24 ore. Per l'incorporazione dei lipidi, sostituire il terreno cellulare con 500 microlitri di terreno privo di siero e incubare per 30 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere due microlitri di soluzione liposomica e incubare per altri 15 minuti.

Quindi lavare le celle con PBS e aggiungere nuovo DM EMF 12. Prima dell'imaging almeno 12 ore prima dell'esperimento, accendere l'incubatrice del microscopio per portare il tavolino del microscopio e i componenti ottici alla temperatura sperimentale. Il passo più difficile di questa procedura è l'acquisizione.

Per garantire il successo, assicurarsi di ottimizzare ogni parametro di acquisizione per il sistema. In fase di studio. Il giorno dell'esperimento, accendere il microscopio, attendere che le telecamere raggiungano la temperatura di lavoro.

Per eseguire l'esperimento, utilizzeremo due telecamere. La fotocamera uno verrà utilizzata per l'imaging e la fotocamera due verrà utilizzata per selezionare la cella. Questa configurazione consentirà il tempo di acquisizione più veloce raggiungibile nel software.

Per impostare i parametri per l'imaging a luce trasmessa. Immettere 20 millisecondi per il tempo di esposizione, immettere uno per il guadagno EM per entrambe le fotocamere. Quindi apri la finestra della modalità di contrasto nel software e lasciala.

Fare clic su BF per selezionare l'opzione del campo chiaro. Mettere i campioni nel supporto mentre si osserva il campione attraverso gli occhi. Metti a fuoco il campione.

Quindi invia manualmente la luce alla telecamera uno e spingi delicatamente le fessure in modo che venga illuminata solo la ROI da riprendere. Quindi, sposta una cella nella regione selezionata e, utilizzando il software, invia la luce alla fotocamera due. Quindi, nel software, disegna un ROI per generare un riferimento.

Innanzitutto, per allineare il laser tramite software, selezionare l'allineamento automatico. Quindi, per avviare la procedura di allineamento automatico, selezionare abilita collimatore. Quindi aprire l'incubatrice sulla parte superiore e collimare il raggio laser.

Quando il laser è allineato nell'angolo in basso a sinistra della finestra del software, fare clic sul pulsante 70 per impostare la profondità di penetrazione a 70 nanometri. Questo corrisponderà a un angolo di incidenza del laser sul vetro inferiore di circa 70 gradi nella suite di applicazioni Leica. Casella di testo del tempo di esposizione del software fluorescente avanzato.

Immettere 70 millisecondi nella casella di testo Guadagno EM. Immettere 1000 per eseguire la stessa operazione sulla fotocamera due. Apri la finestra delle impostazioni e inserisci gli stessi numeri nelle caselle di testo corrispondenti.

Quindi, fai clic sul pulsante live. La fluorescenza verrà inviata alla fotocamera uno e sullo schermo apparirà un'immagine del campione. Spostare il campione fino a quando una cella fluorescente non raggiunge la regione di riferimento di interesse.

Quindi premere il pulsante sulla parte anteriore del corpo del microscopio per inviare la luce alla fotocamera due e spostare la rotella di posizione Z con precisione per mettere a fuoco la membrana cellulare nel software e o nell'unico software. Aprire la finestra delle impostazioni e impostare il tempo di esposizione minimo raggiungibile 1000 EM guadagno sensore ritagliato modalità 10 alla quinta ripetizione, e impostare l'opzione di salvataggio automatico per avviare l'acquisizione della serie di immagini. Fare clic sull'icona della fotocamera del software e attendere il completamento dell'acquisizione.

Quindi apri la finestra delle impostazioni, disabilita il guadagno EM e rimuovi il segno di spunta dall'opzione della modalità ritagliata. Durante l'acquisizione, la temperatura della fotocamera di solito aumenta di circa due o tre gradi. Pertanto, prima di acquisire immagini da una nuova cella, attendere che venga raggiunta la temperatura di lavoro ottimale.

Anche in questo caso, una volta completato l'imaging, seguire le istruzioni nel documento di accompagnamento per calcolare lo spostamento quadratico medio dall'imaging per ottenere una variante marcata in fluorescenza della molecola di interesse. Le cellule CHOK one sono state marcate con ADO 4 88 PPE o trasfettate con un recettore di trasferimento o T-F-R-G-F-P e riprodotte da TIRF come descritto in questo video. Come si può vedere qui, la legge di diffusione misurata per ADO 4 88 PPE è piatta, indicando una diffusione per lo più libera come precedentemente dimostrato dalla fluorescenza di deplezione dell'emissione stimolata, dalla spettroscopia di correlazione o dalle misure FCS stead a seguito di trasfezione con il T-F-R-G-F-P, la legge di diffusione misurata per T-F-R-G-F-P è inizialmente piatta rimanendo al di sotto di 100 nanometri di spostamento molecolare medio con un coefficiente di diffusione apparente medio di circa 0,7 micron quadrati al secondo.

Questo è seguito da una rapida diminuzione della diffusività apparente fino a 0,2 micron quadrati al secondo. Il valore tipicamente misurato da FCS limitato dalla diffrazione. È interessante notare che, come mostrato da quest'ultimo esempio, il presente approccio può facilmente misurare lo spostamento molecolare medio con una risoluzione di poche decine di nanometri anche utilizzando etichette relativamente deboli e dense come la GFP.

Inoltre, la scala spaziale alla quale il coefficiente di diffusione apparente inizia a diminuire pone la dimensione caratteristica del confinamento parziale delle proteine da parte dello scheletro di membrana a circa 120 nanometri, in linea con le stime precedenti. Una volta padroneggiata la procedura di analisi dei dati e tale acquisizione può essere eseguita in pochi minuti. Riteniamo che questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare e molecolare per esplorare facilmente e quantitativamente la regolazione spazio-temporale della diffusione di proteine e lipidi in campioni di vita.