Trasferimento efficiente Gene in Chick retine per cellulari primarie Cultura Studies: An Ex-ovo Elettroporazione Approach
2 novembre 2015
Pulcino colture di cellule della retina embrionali costituiscono validi strumenti per lo studio della biologia dei fotorecettori. Abbiamo sviluppato una tecnica di trasferimento genico efficace sulla base di ex ovo plasmide elettroporazione delle retine precedenti alla cultura. Questa tecnica aumenta considerevolmente l'efficienza di transfezione su protocolli attualmente disponibili, rendendo la manipolazione genetica fattibile per questo sistema.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere un'elevata efficienza di trasfezione plasmidico delle cellule retiniche per consentire studi genetici funzionali in colture retiniche primarie. Ciò si ottiene raccogliendo prima gli embrioni di pollo allo stadio 27 del sistema hamburger e Hamilton. Una messa in scena appropriata è fondamentale per ottenere un'efficienza ottimale.
Il secondo passo consiste nel sezionare gli occhi embrionali e rimuovere l'epitelio pigmentato retinico che espone la retina neurale. Successivamente, la coppa retinica viene posta in una camera riempita con soluzione plasmidica. Viene quindi sottoposto a elettroporazione in condizioni ottimizzate utilizzando elettrodi su misura di facile costruzione.
Le fasi finali consistono nella rimozione del corpo vitreo e del cristallino e nella dissociazione della retina neurale in singole cellule per la coltura primaria a bassa densità. In definitiva, le cellule trasfettate possono essere visualizzate mediante l'espressione di geni reporter o immunoistochimica e l'efficace manipolazione genetica può essere valutata valutando l'espressione di geni a valle e/o cambiamenti cellulari fenotipici. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la lipofezione o la trasfezione chimica, è che aumenta il tasso di trasfezione delle cellule retiniche di cinque volte, producendo efficienze dal 22 al 25% della popolazione cellulare totale.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dei fotorecettori, poiché consente la manipolazione dell'espressione genica nelle colture retiniche primarie a un livello di efficienza in grado di fornire intuizioni biologicamente significative. Le implicazioni di questa tecnica vanno oltre la ricerca di base, in quanto possono essere facilmente adattate a tecnologie ad alto rendimento per lo sviluppo di farmaci. Inizia incubando uova di gallina fecondate di corna di coscia bianca a 37,5 gradi Celsius e 60% di umidità relativa per cinque giorni in un'incubatrice per uova.
Prima dell'esperimento, procurarsi un filamento a scatola normalmente utilizzato nei tiri di micro pipette. Usa una pinza per svitare la scatola quadrata e raddrizzare il filamento in una lunga striscia. Quindi, utilizzando un righello come guida, piegare il filamento in una forma quadrata a forma di U, lunga tre millimetri alla base e alta due millimetri da un lato con l'altro lato, la lunghezza rimanente del filamento utilizzare una pinza per immergere l'elettrodo in etanolo al 96% e fiammeggiare brevemente l'elettrodo per sterilizzarlo.
Quindi collegare un cavo elettrico con una piccola clip a coccodrillo al braccio lungo dell'elettrodo. Successivamente, pulire l'elettrodo spesso con punta dorata utilizzando etanolo al 70%. Quindi preparare la camera di elettroporazione tagliando il coperchio di una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 millilitri utilizzando forbici sterilizzate e fissandola con il lato piatto verso il basso su una piastra di Petri da 100 millimetri utilizzando del nastro adesivo.
Quindi, sterilizzare gli strumenti di microdiseccitazione immergendo le punte degli strumenti in etanolo al 96% e fiammandole brevemente. Inoltre, pulire l'endoscopio di dissezione utilizzando etanolo al 70%. Scaldare una bottiglia di soluzione sterile di sale dell'equilibrio Hanks senza calcio e magnesio in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.
Una volta caldo, usalo per riempire una capsula di Petri sterile da 100 millimetri per tre quarti. Quindi posizionare la camera di elettroporazione sotto un microscopio a dissezione pulita. Quindi collegare gli elettrodi all'apparecchio di elettroporazione, assicurandosi che l'elettrodo su misura sia collegato al polo negativo e che l'elettrodo con punta in oro sia collegato al polo positivo della macchina.
Pulire le uova strofinando l'esterno dei gusci con etanolo al 70%. Prestare attenzione e mantenere la sterilità per tutto il resto del protocollo. Per evitare di trasportare la contaminazione nelle colture utilizzando grandi pinze Maloney ricurve, aprire con cautela un foro nel guscio d'uovo picchiettando delicatamente sulla punta arrotondata di un uovo direttamente sopra la camera d'aria.
Estrarre tutti i pezzi del guscio con un altro paio di pinze. Rimuovi le membrane e raccogli l'embrione estraendolo con cura dall'uovo. Mettere l'embrione in una capsula di Petri con la soluzione salina di Hanks Balance priva di calcio e magnesio.
Quando è stato raccolto un numero adeguato di embrioni, assicurati che siano tutti allo stadio corretto. Secondo il sistema di stadiazione Hamburger e Hamilton per un'efficienza ottimale, gli embrioni devono essere allo stadio 27. Eutanasia degli embrioni mediante decapitazione con una pinza Maloney, quindi utilizzare una pinzetta Dumont per isolare e nucleare gli occhi.
Trasferisci gli occhi in una nuova capsula di Petri con HBSS privo di calcio e magnesio. Inizia dalla parte posteriore di ciascun occhio vicino alla testa del nervo ottico, quindi introduci una punta di ciascun paio di pinzette Dumont tra la retina neurale e l'epitelio pigmentato retinico. Lavorando dalla parte posteriore dell'occhio verso la parte anteriore, utilizzare le pinzette per sezionare con cura l'epitelio pigmentato retinico.
Attenzione a non danneggiare la retina neurale. Impostare l'elettro perter in modo che fornisca cinque impulsi quadrati di 15 volt con una durata di 50 millisecondi e un intervallo di 950 millisecondi. Successivamente, riempire la camera di elettroporazione con 120 microlitri di soluzione plasmidica a una concentrazione di 1,5 microgrammi per microlitro in PBS.
Quindi posizionare l'elettrodo negativo a forma di U all'interno della camera di elettroporazione del coperchio della microcentrifuga. Utilizzando un paio di pinzette dumont curve. Trasferire una coppa retinica nella camera di elettroporazione e posizionarla all'interno dell'elettrodo a forma di U.
Posizionare la retina in modo che la parte posteriore sia rivolta verso la parte inferiore dell'elettrodo e la lente sia rivolta verso l'alto. Quindi, posizionare l'anodo in modo che tocchi la parte anteriore dell'occhio accanto alla lente. Quindi usa il pedale dell'electro raider per erogare cinque impulsi elettrici.
Al termine, trasferire la coppa retinica elettroporata in una nuova capsula di Petri riempita con HBSS privo di calcio e magnesio. Ripetere la procedura di elettroporazione con ogni coppetta retinica aggiuntiva. È possibile elettroporare fino a sei coppette retiniche con la stessa soluzione plasmidica senza una significativa diminuzione dell'efficienza di trasfezione.
Successivamente, utilizzare una pinza dentata per rimuovere delicatamente il cristallino e il corpo vitreo da ciascun campione elettroporato, tenendo l'occhio in posizione con la parte posteriore delle pinzette dumont curve, una volta rimossa, procedere alla dissociazione e alla coltura delle cellule retiniche elettroporate utilizzando tecniche standard. Le cellule retiniche mostrate qui sono state elettroporate con un'espressione di GFP, plasmidi, dissociate e coltivate per quattro giorni. Le micrografie fluorescenti hanno mostrato nuclei di macchie dappy e cellule retiniche che esprimono GFP.
La colorazione anticorpale anti-visina è stata eseguita per identificare le cellule fotorecettori. I parametri descritti in questo protocollo sono stati ottimizzati per ottenere efficienze di trasfettazione che sono in media del 22% rispetto alla popolazione totale dopo quattro giorni. In coltura, questa misura aumenta a una media del 25% di efficienza quando solo la popolazione di fotorecettori è considerata una volta padroneggiata.
Questa tecnica, dalla raccolta degli embrioni all'elettrooperazione, può essere eseguita in meno di 30 minuti per sei occhi se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che non devono trascorrere più di tre ore tra la raccolta degli embrioni e la deposizione dissociata delle cellule per ottenere una coltura di buona qualità. Questa tecnica può essere applicata alla sovraespressione o alla correlazione genica, ad esempio, utilizzando un sistema RNAi.
Inoltre, la retina che è stata trasfettata a seguito di questa procedura può essere utilizzata per colture retiniche organotipiche.
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Panoramica
Questo articolo presenta una nuova tecnica per il trasferimento genico ad alta efficienza in colture cellulari retiniche di embrioni di pollo, migliorando lo studio della biologia dei fotorecettori. Il metodo prevede l'elettroporazione di plasmidi ex ovo, migliorando significativamente i tassi di trasfezione rispetto ai protocolli esistenti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Ingegneria genetica
Sfondo
- Le colture cellulari retiniche di embrione di pollo sono importanti per la ricerca sui fotorecettori.
- Le tecniche di trasferimento genico sono essenziali per studi funzionali in queste cellule.
- I metodi attuali presentano limitazioni nell'efficienza di trasfezione.
- L'ottimizzazione delle condizioni di stadio ed elettroporazione può migliorare i risultati.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per il trasferimento genico in cellule retiniche.
- Permettere studi genetici funzionali in colture primarie di retina.
- Migliorare l'efficienza di trasfezione rispetto ai protocolli esistenti.
Metodi Utilizzati
- Prelevamento di embrioni di pollo allo stadio 27 del sistema di Hamburger e Hamilton.
- Dissezione degli occhi embrionali e rimozione dell'epitelio pigmentato retinico.
- Posizionamento della coppa retinica in una camera contenente soluzione di plasmidi.
- Applicazione dell'elettroporazione mediante elettrodi su misura in condizioni ottimizzate.
Risultati principali
- Elevata efficienza di trasfezione ottenuta mediante il nuovo metodo.
- Dimostrata manipolazione genetica di cellule retiniche.
- Sono state stabilite condizioni ottimizzate per l'elettroporazione.
- La tecnica è applicabile a vari studi funzionali in biologia della retina.
Conclusioni
- La tecnica di trasferimento genico sviluppata migliora in modo significativo le capacità di ricerca nella biologia cellulare della retina.
- Questo metodo può facilitare studi avanzati sulla funzione dei fotorecettori.
- Applicazioni future potrebbero includere l'esplorazione dei fattori genetici nelle malattie retiniche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il trasferimento genico efficiente in colture retiniche primarie affronta un collo di bottiglia fondamentale nella validazione degli obiettivi nei fotorecettori, consentendo l'analisi funzionale di geni rilevanti per le malattie. Il metodo di elettroporazione ex ovo raggiunge un'efficienza di trasfezione del 22-25%, favorendo lo sviluppo di saggi scalabili per lo screening ad alto rendimento di terapie retiniche. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nell'identificazione dei composti promettenti fornendo informazioni biologicamente significative sulla funzione genica all'interno di un sistema rilevante per la malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante l'overespressione guidata da plasmidi o l'abbattimento mediato da RNAi in colture primarie di fotorecettori.
- Valore operativo: Fornisce un sistema riproducibile per la validazione funzionale di bersagli, con espressione del transgene quantificabile fino al 25% della popolazione di fotorecettori.
- Valore strategico: Favorisce una maggiore previsione nell'identificazione dei bersagli, collegando la manipolazione genetica a modifiche fenotipiche cellulari o all'espressione genica a valle.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera efficienze di trasfezione adeguate per misurazioni quantitative di variabili dipendenti in campagne di screening di composti.
- Valore operativo: Utilizza condizioni standardizzate di elettroporazione ed elettrodi su misura per garantire la riproducibilità del saggio su più cupole retiniche.
- Valore strategico: Consente il riutilizzo della piattaforma per adattamenti ad alto rendimento, poiché le colture retiniche trasfettate possono essere integrate in flussi di lavoro organotipici o in colture primarie a bassa densità.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita la riduzione del rischio meccanicistico consentendo la manipolazione genetica in un sistema rilevante per la malattia che modella la biologia retinica umana.
- Valore operativo: Mantiene una continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione preclinica, utilizzando procedure di coltura e dissociazione costanti.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento con valutazione del rischio consentendo la valutazione della funzione genica prima di studi in vivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione, sostenendo la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi nella biologia dei fotorecettori.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo l'overespressione o l'abbassamento dell'espressione di geni bersaglio in colture retiniche primarie.
- Screening: Garantisce prontezza per saggi grazie a una concentrazione standardizzata della soluzione plasmidica (1,5 µg/µL) e parametri di elettroporazione ottimizzati (5 impulsi, 15 V, 50 ms).
- Analisi: Fornisce letture quantitative mediante l'espressione di geni reporter (ad esempio GFP) o immunohistochimica per confrontare l'efficienza di trasfezione tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica grazie all'applicabilità in colture retiniche organotipiche ottenute da retine elettroporate.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile, poiché fino a sei coppette retiniche possono essere elettroporate con la stessa soluzione plasmidica senza una perdita significativa di efficienza.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva raggiungendo tassi di trasfezione cinque volte superiori rispetto alla lipofezione o ai metodi chimici.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione attraverso protocolli dettagliati di costruzione ed sterilizzazione degli elettrodi mediante fiammatura con etanolo al 96%.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale riducendo il rumore biologico negli studi funzionali, consentendo decisioni più accurate su prosegui/non prosegui.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta rispetto al rischio fornendo dati funzionali sul ruolo del gene nella sopravvivenza o differenziazione dei fotoricettori.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella stadiazione dell'embrione di pollo (stadio 27 di Hamburger e Hamilton) e nelle tecniche di dissezione microchirurgica.
- Necessita di strumentazione per la somministrazione di elettroporazione mediante cinque impulsi quadrati e della preparazione di elettrodi personalizzati a forma di U realizzati con filamento di platino.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro nella preparazione della soluzione plasmidica (a base di PBS, 1,5 µg/µL) e nell'allestimento della camera utilizzando tubi microcentrifuga modificati.
- Comporta considerazioni di adattamento in caso di diverse concentrazioni di plasmide o costrutti di RNAi quando si passa a studi di downregolazione.
- Include limitazioni pratiche, come la finestra temporale di tre ore tra il prelievo dell'embrione e la semina cellulare, necessaria per mantenere la qualità della coltura.
