Misurare Anafilassi locali nei topi

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare i cambiamenti nella permeabilità vascolare, per quantificare le risposte allergiche localizzate. Ciò si ottiene sensibilizzando prima gli animali a un allergene, come l'albumina O. Il secondo passo consiste nel sfidare le orecchie con un'iniezione intradermica dell'allergene.

Quindi il colorante blu di Evan viene iniettato nella vena della coda. Il passaggio finale consiste nell'estrarre il colorante dalle orecchie sfidate incubandole durante la notte. Nella forma, l'ammide e la spettrofotometria vengono utilizzate per quantificare la quantità di colorante che è entrata nell'orecchio.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che lo stravaso del colorante viene misurato mediante spettrometria. Ciò significa che il test non è facilmente soggetto a distorsioni dell'osservatore. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché le iniezioni intradermiche e della vena caudale sono tecnicamente impegnative e richiedono molta pratica per raggiungere la competenza.

Iniziare portando un'aliquota di soluzione madre di ovuli a temperatura ambiente per l'uso. A temperatura ambiente, diluire il brodo di ovuli a una concentrazione di un milligrammo per millilitro in un XPBS. Utilizzare un tubo inferiore rotondo in polistirene da cinque millilitri.

Agitare il tubo a velocità media e aggiungere con cura un volume uguale di omogeneizzato a fondo. Iniettare l'allume nella soluzione di ovuli goccia a goccia. Parallelamente, preparare una soluzione di controllo negativo di allume miscelato in PBS in un rapporto uno a uno utilizzando la stessa tecnica.

Quindi tappare i tubi e fissarli al vortice. Far funzionare il vortice al minimo per mezz'ora con i tubi collegati. Quando le soluzioni sono pronte, procedere immediatamente con la sensibilizzazione dei topi BAB.

Caricare la miscela di allume di ovuli in una siringa da un millilitro. Quindi, con un ago calibro 27, iniettare 100 microlitri nel peritoneo di ciascun topo. Ripetere l'operazione per i topi di controllo negativi utilizzando la soluzione di allume senza ovuli nelle prossime tre settimane.

Ripetere questo processo per un totale di tre iniezioni per topo dopo l'ultima iniezione, attendere almeno due settimane prima di eseguire il test di anafilassi locale da ovuli congelati. Inizia con la preparazione di una soluzione di lavoro da cinque milligrammi per millilitro in PBS. Agitare brevemente, utilizzando il 5% di fluoro ISO.

Anestetizzare un topo sensibilizzato e, quando diventa immobile, ridurre l'isofluoro al 3%Ora caricare una siringa da tre 10 insulina con 10 microlitri del preparato di ovuli, e tapparla con un ago calibro 31 e caricare una seconda siringa con 10 microlitri di un XPBS. Quindi avvolgere un tubo conico da 15 millilitri con nastro adesivo trasparente con il lato adesivo rivolto verso l'esterno sotto un microscopio da dissezione, fissare il lato dorsale dell'orecchio sinistro di un topo anestetizzato al tubo. Inserire l'ago della siringa PBS con il lato smussato rivolto verso l'alto tra le due foglie dell'orecchio e iniettare lentamente tutti i 10 microlitri.

Evita di colpire i vasi sanguigni. Un'iniezione riuscita si tradurrà in un evidente blip intradermico. È fondamentale iniettare l'intero volume nell'orecchio.

Se del liquido fuoriesce dal sito di iniezione, l'animale non può essere utilizzato nell'analisi. Inoltre, se l'ago attraversa completamente l'orecchio o graffia la superficie dell'orecchio, il test non è valido perché questi traumi confonderanno i risultati nell'orecchio destro. Utilizzare lo stesso metodo per iniettare gli ovuli durante il periodo di tre minuti.

Trasferisci il mouse su un sistema di ritenuta e posizionalo sotto una lampada termica. Quindi iniettare lentamente 200 microlitri di colorante blu Evans allo 0,5% nella vena della coda. Utilizzando un ago calibro 27, l'iniezione rapida può essere dannosa se il recipiente viene distrutto prima che tutto il colorante venga iniettato.

Continuare a iniettare sul lato opposto della coda. Ora attendi 10 minuti e poi sopprimi il topo con anidride carbonica, seguita da lussazione cervicale. Una volta che l'animale è stato soppresso, usa pinze e forbici per rimuovere le orecchie.

Afferrare il bordo dell'orecchio con la pinza senza esercitare pressione sul sito di iniezione. Quindi tagliare vicino, ma non attraverso la cresta cartilaginea alla base delle orecchie. Raccogli quanto più tessuto possibile.

Ora, prendendo le dovute precauzioni, aliquotare 700 microlitri di forma ammidica per ciascun orecchio in una provetta per microcentrifuga. Trasferisci un orecchio in ogni tubo e incubali per una notte a 63 gradi Celsius in un blocco di calore secco, il giorno successivo la maggior parte del colorante verrà estratta, ma le orecchie potrebbero apparire leggermente blu. Aggiungere 300 microlitri di ciascun campione in duplicato a una piastra da 96 pozzetti.

Evitare di trasferire la pelliccia e non formare bolle per gli spazi vuoti. Caricare due pozzetti con 300 microlitri di ammide di forma. Quindi misurare l'assorbanza a 620 nanometri.

Sottrai i valori dallo sfondo e analizza i risultati. Gli animali sensibilizzati alla PBS non hanno reagito alla sfida degli ovuli o alla sfida della PBS. Come previsto, entrambe le orecchie sono rimaste bianche.

L'anno in cui ha ricevuto la sfida PBS negli animali sensibilizzati agli OAV era completamente bianco o leggermente blu, localizzato nel sito di iniezione dove le sue orecchie che ricevevano la sfida degli ovuli sono diventate progressivamente più scure per 10 minuti dopo la somministrazione del colorante, il tessuto dell'orecchio trattato con IDE degli animali sensibilizzati alla PBS aveva letture di assorbanza trascurabili dopo sia la prova PBS che OVA. Mentre per gli animali sensibilizzati agli ovuli, l'iniezione di PBS ha generalmente portato a una lettura media dell'assorbanza di 0,13. Al contrario, una provocazione di ovuli da 50 microgrammi ha portato a una lettura media dell'assorbanza di 0,58.

La quantità di ovuli utilizzata per la sfida può essere regolata entro certi limiti. Ad esempio, un 20 microgrammi di una provocazione ha portato a un'assorbanza media di 0,30. Tuttavia, una provocazione inferiore a 20 microgrammi non ha dato risultati affidabili.

Sebbene sia impegnativo una volta che una persona è esperta nelle iniezioni intradermiche ed endovenose, questa tecnica può essere eseguita su un animale in circa 15 minuti con due persone che lavorano insieme, una che esegue le iniezioni all'orecchio e l'altra che esegue le iniezioni della vena caudale. La procedura può essere eseguita su 10 animali in circa un'ora. Questo test è estremamente versatile in quanto può essere utilizzato sia per l'anafilassi cutanea attiva che passiva.

Può essere utilizzato anche per un'ampia varietà di allergeni. Non dimenticare che il fluoro può avere effetti negativi sul sistema riproduttivo umano. Usalo solo in una stanza ben ventilata e tieni un contenitore di pulizia attaccato alla camera di induzione per neutralizzare i gas di scarico in caso di gravidanza.

Durante l'utilizzo di isof fluoro, indossare una maschera con filtro a carbone per ridurre al minimo l'esposizione.