Name: Generazione efficiente delle cellule iPS da Blood Utilizzando episomi e HDAC inibitori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Scopri come generare cellule iPS senza integrazione da sangue periferico utilizzando plasmidi episomali e inibitori di HDAC. Questo metodo sicuro migliora l'efficienza della riprogrammazione per applicazioni terapeutiche.

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Gli autori desiderano ringraziare le seguenti finanziamenti del NIH per sostenere questa ricerca: K08DK082783 (AR), P30DK56465 (BTS), U01HL099993 (BTS), T32HL00715036 (SKS), e K12HL0806406 (SKS); e McCarthy Fondazione JP (AR).

Scritto consenso informato, come approvato dai Institutional Review Boards del Fred Hutchinson Cancer Research Center e il Children &quot;s Hospital di Filadelfia, è stato ottenuto da pazienti prima di raccogliere campioni di sangue periferico. Sono state rispettate tutte le linee guida istituzionali. Tutti gli esperimenti sugli animali, tra cui la generazione MEF e formazione di teratoma è stato approvato dal Comitato di cura e l&#39;uso degli animali istituzionale. 1. Ficoll Separazione dei PBMC ed espansione degli eritroblasti - Giorno 0 <ol><li> Diluire sangue periferico 1: 1 con Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS). In un tubo da 15 ml in polistirolo a fondo rotondo, strato attentamente 7 ml di sangue diluito su 3 ml di temperatura ambiente Ficoll-Hypaque. </li><li> Centrifugare il campione a 400 xg per 30 min. </li><li> Le PBMC si sono insediati all&#39;interfaccia tra il plasma e il Ficoll-Hypaque, visto come uno strato bianco nuvoloso. Usando una pipetta sterile per il trasferimento, raccogliere il PBMC in un tubo da 15 ml. Portare il volume a 10 ml con DPBS. </li><li> Utilizzando un emocitometro, contare le PBMC. </li><li> Pipettare 2 × 10 6 PBMC in un tubo da 15 ml separata e centrifugare a 300 xg per 5 min. Centrifugare le restanti cellule e congelare ad una concentrazione di 2 x 10 6 PBMC / ml nel siero fetale bovino al 90% (FBS) / 10% di dimetilsolfossido (DMSO). </li><li> Preparare media espansione: terreno privo QBSF-60 nel siero (protegge dalla luce) + penicillina / streptomicina (1%) + acido ascorbico (50 ng / ml) + fattore della cellula staminale (SCF, 50 ng / ml) + interleuchina 3 (IL- 3, 10 ng / ml) + eritropoietina (EPO, 2 U / ml) + insulin-like growth factor 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + desametasone (1 mM; riparo dalla luce, scongelare una nuova aliquota ciascun supporto cambiare). </li><li> Risospendere 2 × 10 6 PBMC in 2 ml di appena fatto medio di espansione e riporre in un pozzetto di una piastra di coltura 12 tessuti bene e incubare a 37 ° C incubatore umidificato con un clima di 5% O 2, 5% di CO 2, e 90% N 2. </li><li> Il giorno 3 e il giorno 6, sostituire il supporto. <ol><li> Raccogliere le cellule e lavare il bene con 2 ml di QBSF-60 per raccogliere tutte le cellule rimanenti. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 300 xg per 5 min e aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 2 ml di nuovi media espansione e ritornare allo stesso 12 pozzetti. </li></ol></li></ol> 2. riprogrammazione delle cellule di Nucleofection - Day 9 <ol><li> Pipettare i plasmidi riprogrammazione in una sterile 1,5 ml provetta Eppendorf (Tabella 1). </li><li> Mescolare la soluzione nucleofection con supplemento (fornita dal produttore) e trasferirli in una provetta sterile da 1,5 ml provetta Eppendorf. </li><li> Pipettare 2 ml di espansione medio in un pozzetto di una piastra ben 12 e posto in un umidificata 37 ° C incubatore (5% O 2, 5% di CO 2, e 90% N 2) di equilibramento prima di aggiungere le cellule. </li><li> Raccogliere ilcellule in coltura e lavare il bene con 2 ml di QBSF-60 per raccogliere le cellule rimanenti. </li><li> Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 min e aspirare il surnatante. </li><li> Lavare le cellule da risospendere in 5 ml di DPBS e centrifugazione a 300 xg per 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 100 ml di soluzione di nucleofection + Supplemento, avendo cura di evitare bolle di generazione. </li><li> Pipettare la sospensione cellulare nella provetta contenente i plasmidi riprogrammazione, pipettare su e giù una volta, e dispensare il campione nella parte inferiore della cuvetta nucleofection. </li><li> Posizionare la cuvetta nella macchina nucleofection ed eseguire il programma T-019. </li><li> Trasferire 100 ml di espansione preriscaldata Media (dalla piastra equilibrante al punto 2.3) nella cuvetta nucleofection. </li><li> Raccogliere immediatamente l&#39;intero campione e deposito nel pozzetto di pre-riscaldato medio di espansione. Evitare di raccogliere il bianco, detriti cellulari morti galleggianti. </li&gt; <li> Porre la piastra in un umidificata 37 ° C incubatore (5% O 2, 5% di CO 2, e 90% N 2) per la crescita. </li></ol> 3. Placcatura cellule di alimentazione - Giorno 10 o 11 <ol><li> Il 10 Giorno, cellule di alimentazione piastra. <ol><li> Cappotto uno 6 e piastra di coltura tissutale con gelatina. <ol><li> Pipettare 1 m di 0,1% di gelatina in soluzione salina tamponata di Hank (HBSS) in ciascun pozzetto della piastra. </li><li> Porre la piastra in un umidificata 37 ° C incubatore per almeno 5 minuti. </li><li> Immediatamente prima dell&#39;uso, aspirare la soluzione di gelatina dalla piastra. </li></ol></li><li> Scongelare una fiala di 2 × 10 6 fibroblasti embrionali di topo irradiati a 3.000 cGy in 10 ml di preriscaldata MEF media (Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + FBS (10%) + di penicillina / streptomicina (1%)). </li><li> Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 min e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 12 ml di MEF Media e pipetta 2 ml into ciascun pozzetto della piastra ben 6 gelatina rivestita. Porre la piastra in un umidificata 37 ° C incubatore (5% O 2, 5% di CO 2, e 90% N 2) fino al giorno 12. </li></ol></li></ol> 4. Placcatura Celle Celle a Feeder e modifica Medium - Giorno 12 <ol><li> Raccogliere le cellule nucleofected in un tubo da 15 ml e raccogliere tutte le cellule residue lavando i ben con 2 ml di QBSF-60. Centrifugare il campione a 300 xg per 5 min. </li><li> Preparare Riprogrammazione Media: Iscove Modified Dulbecco Medium (IMDM) + FBS (10%) + non animale L-glutammina (1 mM) + aminoacidi non essenziali (NEAA, 1%) + di penicillina / streptomicina (1%) + β -mercaptoethanol (0.1 mM) + fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF, aggiunte fresca al seno, 10 ng / ml) + acido ascorbico (aggiunte fresca al seno, 50 mg / ml). </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 12 ml di riprogrammazione Media. Pipettare 2 ml per pozzetto di sospensione cellulare inla piastra 6 e di cellule di alimentazione (come preparato al punto 3). Centrifugare la piastra a 50 xg per 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Porre la piastra in un umidificata 37 ° C incubatore (5% O 2, 5% di CO 2, e 90% N 2) per la crescita. Cambiare la riprogrammazione medio a giorni alterni fino a quando le colonie IPSC iniziano apparire (1-2 settimane). </li><li> Preparare hESC Media: DMEM / F12 1: 1 + Knockout siero sostituzione (20%) + di penicillina / streptomicina (1%) + NEAA (1%) + non animale L-glutammina (1 mM) + piruvato di sodio (1%) + bicarbonato di sodio (0,12%) + β-mercaptoetanolo (0,1 mM) + bFGF (aggiunte fresca al seno, 10 ng / ml) </li><li> Preparare inibitori HDAC: butirrato di sodio (aggiunto a fresco di alimentazione, 100 micron), acido suberanilohydroxamic (SAHA, ha aggiunto fresca al seno, 200 nm). Una volta che appaiono colonie IPSC, iniziare a nutrire le cellule con inibitori HDAC hESC Medium +, cambiando mezzo di tutti i giorni. NOTA: butirrato di sodio è una piccola molecola che viene adsorbito in provette di plastica, therefore conservarlo in una provetta di vetro borosilicato a 4 ° C. </li></ol> 5. Cloni isolamento IPSC <ol><li> Una volta colonie IPSC sono abbastanza grandi da essere isolato (20-25 cellule), raccoglierli con una pipetta P20. </li><li> Preparare inibitori HDAC: butirrato di sodio (aggiunto a fresco di alimentazione, 100 micron), SAHA (aggiunto a fresco di alimentazione, 200 nm) </li><li> Mettere le colonie isolate su iMEFs nei singoli piatti 35 mm contenenti inibitori HDAC hESC Medium + + Clonazione &amp; Recovery supplemento. </li><li> Il giorno dopo la raccolta delle colonie, cambiare il medio-inibitori hESC Media + HDAC. </li><li> Cambiare la media tutti i giorni fino a quando le colonie IPSC sono pronti per passaging. </li><li> Rimuovere gli inibitori HDAC dal mezzo una volta colonie stabilizzano a passaggio 2-3. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Koche, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+expression+initiates+widespread+targeted+chromatin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 96-105 (2011).</li>
<li>Baum, C., Kustikova, O., Modlich, U., Li, Z., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+and+oncogenesis+by+chromosomal+insertion+of+gene+transfer+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors.</a> Human Gene Therapy. 17 (3), 253-263 (2006).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324 (5928), 797-801 (2009).</li>
<li>Hong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+induced+pluripotent+stem+cell+generation+by+the+p53-p21+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway.</a> Nature. 460 (7259), 1132-1135 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Yates, J. L., Warren, N., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+replication+of+plasmids+derived+from+Epstein-Barr+virus+in+various+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells.</a> Nature. 313 (6005), 812-815 (1985).</li>
<li>Ware, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibition+elicits+an+evolutionarily+conserved+self-renewal+program+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (4), 359-369 (2009).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butyrate+greatly+enhances+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+promoting+epigenetic+remodeling+and+the+expression+of+pluripotency-associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes.</a> Stem Cells. 28 (4), 713-720 (2010).</li>
<li>Azuara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+signatures+of+pluripotent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin signatures of pluripotent cell lines.</a> Nature Cell Biology. 8 (5), 532-538 (2006).</li>
<li>Sommer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+peripheral+blood+using+the+STEMCCA+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector.</a> J. Vis. Exp. (68), e4327(2012).</li>
<li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).</li>
<li>Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Embryonic+Stem+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Derivation of Embryonic Stem Cell Lines.</a> Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).</li>
<li>Kim, H. J., Bae, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors%3A+molecular+mechanisms+of+action+and+clinical+trials+as+anti-cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs.</a> American Journal of Translational Research. 3 (2), 166-179 (2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Per successo generazione IPSC quando si utilizza questo protocollo, ci sono diversi avvertimenti importanti che devono essere considerati. Durante la fase di espansione eritroblasti, il programma di cambiamento dei media deve essere rigorosamente rispettata, come deviazioni possono portare alla stimolazione inefficiente della popolazione di cellule progenitrici bersaglio e una minore efficienza di generazione IPSC. È importante fare nuovo mezzo di espansione con desametasone fresca ad ogni cambio di supporto; e il mezzo...

iPSCs sono derivati ​​da tessuti somatici attraverso l&#39;espressione ectopica di un insieme minimo di geni pluripotenza. Questa tecnica è stata inizialmente dimostrata dalla trasduzione retrovirale di fibroblasti umani con OCT4, SOX2, Klf4, e cMyc, che sono altamente espressi nello stato pluripotenti 1. Questi transitoriamente espressi &quot;fattori di riprogrammazione epigenetica&quot; alterano il paesaggio e profilo di espressione genica della cellula bersaglio analogo alle cellule staminali embrionali umane 2. Una volta creato, iPSCs potenzialmente può essere differenziato in qualsiasi tipo di tessuto per ulteriori indagini. Così, essi promettenti per l&#39;uso in medicina rigenerativa, modelli di malattia, e applicazioni di terapia genica. Tuttavia, interrompendo il genoma di virus che integrano ha il potenziale per alterare l&#39;espressione del gene endogeno, influenza fenotipo cellulare, e in ultima analisi polarizzare risultati scientifici. Inoltre, integrazioni virali casuali possono portare a deleterio cellulare eFFETTI, compresa la possibilità di trasformazione maligna 3 o ri-espressione dei transgeni oncogeni 4. Applicazioni cliniche future richiederanno-integrazione non generazione IPSC. Episomi, che sono cromosomiche circolare in più molecole di DNA, offrono una strategia per generare efficaci, iPSCs senza integrazione dei costi 5. La combinazione di vettori episomiale di cui alla tabella 1 esprime la riprogrammazione fattori OCT4, SOX2, Klf4, MYCL, e LIN28A. Il plasmide pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F contiene anche un p53 shRNA per la soppressione temporanea di TP53 per migliorare la riprogrammazione cellulare 6. La replica carente pCXWB-EBNA1 vettore promuove l&#39;amplificazione dei fattori di riprogrammazione e di una maggiore efficienza riprogrammazione, fornendo un aumento transitorio della espressione EBNA1 7. Il plasmide pCXLE_EGFP può essere aggiunto alla miscela nucleofection ai fini della determining l&#39;efficienza di trasfezione o per applicazioni di separazione delle cellule. Con l&#39;eccezione di p CXWB-EBNA1, i plasmidi episomiale utilizzati in questo protocollo contengono l&#39;origine virus di Epstein-Barr della replicazione virale e geni EBNA1, che mediano la replicazione e la partizione del episoma durante la divisione della cellula ospite 8. I episomi sono spontaneamente persi con l&#39;espansione successiva IPSC 7. Subclonaggio e caratterizzazione di iPSCs con episomiale perdita vettore, che può essere dedotta dalla perdita di espressione eGFP, può portare a completamente di integrazione iPSCs gratuiti per future applicazioni cliniche. Inerente al processo di generazione IPSC è soppressione di geni specifici lignaggio e la riattivazione di geni pluripotenza associati. Regolazione dell&#39;espressione genica avviene a più livelli all&#39;interno del nucleo, comprese le modifiche al DNA e della cromatina per consentire fattori di trascrizione, elementi di DNA di regolazione, e RNA polimerasi accesso per indirizzaregeni. Rimodellamento del paesaggio epigenetico tramite modificazioni della cromatina a livello mondiale è un componente chiave di ri-espressione del programma genetico pluripotenza. Una modifica della cromatina specifico che è importante nella regolazione dell&#39;espressione genica è l&#39;acetilazione degli istoni in particolare i residui di lisina, che consente l&#39;accesso a bersaglio geni attraverso la diminuzione della tensione della bobina istone-DNA. Gli inibitori HDAC sono piccole molecole che hanno dimostrato di migliorare IPSC riprogrammazione e hESC auto-rinnovamento 9,10, probabilmente dovuto a sostenere lo stato acetilato 11. Il protocollo descritto di seguito, tratto da una pubblicazione preventiva utilizzando lentivirus che integrano 12, fornisce un metodo step-by-step per la generazione IPSC ottimizzata dal sangue periferico mediante episomi e inibitori HDAC. Le concentrazioni di inibitori HDAC utilizzate qui sono la metà di quelli descritti da Ware, et hanno regolarmente portato a un aumento di 2 volte completamente riprogrammati colonie IPSC oltre al normale. 9, eprotocolli di riprogrammazione episomiale senza inibitori HDAC. Questo livello di riprogrammazione è alla pari con l&#39;efficienza che osserviamo con i metodi lentivirali. Usando questo protocollo, abbiamo generato in modo efficiente IPSC da individui vecchi come 87 anni di età.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-750</td><td>Conservare a 4 °C. Riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td>Negozio a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Negozio a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>siero fetale bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10437028</td><td>Store a -20 &deg; C fino al momento del bisogno. Scongelare, aliquotare, conservare a 4 °C.</td></tr><tr><td>dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>154938</td><td>Conservare a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>QBSF-60 terreno senza siero</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-983-234</td><td>Negozio a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>penicillina/streptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>Store a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Kit Nucleofector Linea Cellulare V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>Conservare a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Soluzione di gelatina al 2%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td>Conservare a 4 gradi C, liquefare in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Saline Solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td>Negozio a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Negozio a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>12440-061</td><td>Negozio a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>L-glutammina, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Aliquota, congelare a -20 °C.</td></tr><tr><td>aminoacidi non essenziali (NEAA), 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Conservare a 4 gradi C, al riparo dalla luce.</td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12, 1:1</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30023.02</td><td>Store a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>KnockOut siero di ricambio</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Aliquota, congelare a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>piruvato di sodio, 100 mM</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>Conservare a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>bicarbonato di sodio, 7,5%</td> <td>Life Technologies</td><td>25080094</td><td>conservare a 4 °C.</td></tr><tr><td>fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF)</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0263</td><td>Produrre 10 mg/ml di stock in DPBS, aliquotare, congelare a -20 °C. Una volta scongelato, conservare a 4 °C.</td></tr><tr><td>butirrato di sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887-1G</td><td>Fare 2000x stock (400 mM) in DPBS, aliquota, congelare a -20 &deg;C. Una volta scongelato, conservare a 4 °C.</td></tr><tr><td>hES Clonazione e clonazione cellulare Integratore per il recupero</td><td>Stemgent</td><td>01-0014-500</td><td>Conservare a -20 &deg; C fino al momento del bisogno. Una volta scongelato, conservare a 4 °C.</td></tr><tr><td>Matrigel BD BD</td><td>Biosciences</td><td>35-4277</td><td>Scongelamento notturno sul ghiaccio a 4 ° deg; C, aliquotare in provette pre-raffreddate utilizzando puntali per pipette pre-raffreddati. Conservare a -20 &deg; C fino al momento del bisogno. Scongelare a 4 gradi C, utilizzare immediatamente.</td></tr><tr><td>StemSpan SFEM&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9650</td><td>Aliquota, congelare a -20 °C.</td></tr><tr><td>acido ascorbico, in polvere</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403-100MG</td><td>Produrre 5 mg/ml in DPBS, filtro sterile, conservare a 4 °C.</td></tr><tr><td>fattore di cellule staminali umane ricombinanti (SCF)</td><td>R & D Systems</td><td>255-SC-010</td><td>Marca 100 &mu; g/m di stock in SFEM, aliquota, congelamento a -20 &deg;C. Una volta scongelato, conservare a 4 °C.</td></tr><tr><td>interleuchina umana ricombinante 3 (IL-3)</td><td>R & D Systems</td><td>203-IL-010</td><td>Marca 100 &mu; g/ml di stock in SFEM, aliquota, congelamento a -20 &deg;C. Una volta scongelato, conservare a 4 °C.</td></tr><tr><td>eritropoietina (EPO)</td><td>R & D Systems</td><td>287-TC-500</td><td>Produce 1000 U/ml di stock in SFEM, aliquota, congelare a -20 &deg;C. Una volta scongelato, conservare a 4 °C.</td></tr><tr><td>fattore di crescita insulino-simile umano ricombinante 1 (IGF-1)</td><td>R & D Systems</td><td>291-G1-200</td><td>Marca 100 &mu; g/ml di stock in SFEM, aliquota, congelamento a -20 &deg;C. Una volta scongelato, conservare a 4 °C.</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td>Produce 1000x stock (100 mM) in DPBS.</td></tr><tr><td>desametasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902-25MG</td><td>Fare 50x stock (50 &mu; M) in DPBS, filtro sterile, conservare a 4 °C.</td></tr><tr><td>SAHA (vorinostat)</td><td>Cayman Chemical</td><td>149647-78-9</td><td>Produce 2.000x stock (400 mM) in DPBS, aliquota, congelare a -20 &deg;C. Una volta scongelato, conservare a 4 °C.</td></tr><tr><td>piastra per coltura tissutale a 12 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>provetta conica da 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62553002</td><td></td></tr><tr><td>provetta Eppendorf da 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>piastra per coltura tissutale a 6 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>piastre per coltura a pozzetti da 35 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche monouso da 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche monouso da 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-22</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche monouso da 2 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-17</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l puntali per pipette, puntali barriera</td><td>Genessee</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>pipette in vetro Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>pipetta ausiliaria</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-15</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-EGFP</td><td>Addgene</td><td>27082</td><td></td></tr><tr><td>pCXWB-EBNA1</td><td>Addgene</td><td>37624</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione efficiente delle cellule ips da blood utilizzando episomi e hdac inibitori

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

Questo manoscritto illustra un protocollo per la creazione efficiente umani indotti cellule senza integrazione staminali pluripotenti (iPSCs) da sangue periferico mediante plasmidi episomiale e istone deacetilasi (HDAC). I vantaggi di questo approccio includono: (1) l&#39;uso di una quantità minima di sangue periferico come materiale di base; (2) nonintegrating vettori di riprogrammazione; (3) un metodo conveniente per la generazione di vettori iPSCs liberi; (4) un singolo trasfezione; e (5) l&#39;uso di piccole molecole per facilitare riprogrammazione epigenetica. In breve, le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono isolati da campioni salasso di routine e poi coltivate in fattori di crescita definiti per produrre una popolazione di cellule progenitrici degli eritrociti altamente proliferativo che è notevolmente suscettibile di riprogrammazione. Nonintegrating, plasmidi episomiale nontransmissible esprimono OCT4, SOX2, Klf4, MYCL, LIN28A, e un p53 breve tornante (sh) RNA sono Introdced negli eritroblasti ottenuti tramite un singolo nucleofection. Cotrasfezione di un episoma che esprime migliorato proteina fluorescente verde (eGFP) permette una facile identificazione delle cellule trasfettate. Un plasmide replica carenti separata esprimono Epstein-Barr antigene nucleare 1 (EBNA1) viene anche aggiunto alla miscela di reazione per l&#39;aumentata espressione di proteine ​​episomiale. Le cellule trasfettate sono poi piastrate su uno strato di fibroblasti embrionali di topo irradiati (iMEFs) per continuare la riprogrammazione. Appena colonie IPSC-simili vengono ordinate circa dodici giorni dopo nucleofection, inibitori HDAC vengono aggiunti al mezzo per facilitare rimodellamento epigenetica. Abbiamo trovato che l&#39;inclusione di inibitori HDAC aumenta regolarmente la generazione di colonie IPSC completamente riprogrammato per 2 volte. Una volta che le colonie IPSC presentano tipico di cellule staminali embrionali umane (hESC) morfologia, sono gentilmente trasferiti in piastre di coltura singoli Imef-rivestite di tessuto per la continua crescita ed espansione.

Tre giorni dopo nucleofection e prima placcatura cellule nucleofected sul iMEFs, l'efficienza del nucleofection successo dovrebbe essere stimata mediante microscopia a fluorescenza per eGFP. La Figura 1 mostra un tipico esperimento nucleofection con circa il 5-10% della popolazione totale di cellule che esprimono eGFP. Colonie riprogrammato IPSC cominceranno ad apparire circa due settimane dopo nucleofection. Le colonie sono generalmente circolare con bordi ben definiti e po...

Qui si descrive un protocollo per la generazione di cellule staminali umane pluripotenti indotte dal sangue periferico mediante una strategia di riprogrammazione episoma based e inibitori delle istone deacetilasi.

Generazione efficiente delle cellule iPS da Blood Utilizzando episomi e HDAC inibitori

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di generare cellule staminali pluripotenti indotte libere da integrazione da una piccola quantità di sangue periferico. Ciò si ottiene coltivando cellule mononucleate isolate del sangue periferico in fattori di crescita definiti per produrre una popolazione progenitrice di eritrociti molto reattiva alla riprogrammazione. Come secondo passo, i plasmidi episomiali non integranti portatori di geni di riprogrammazione vengono introdotti negli eritroblasti dall'affezione del nucleo per avviare il processo di riprogrammazione.Successivamente, le cellule colpite dal nucleo vengono piastrate su uno strato di fibroblasti embrionali di topo irradiati per consentire una riprogrammazione continua con successo. Le colonie di cellule staminali pluripotenti indotte riprogrammate possono essere identificate in base alle loro caratteristiche morfologiche, all'attività della fosfatasi alcalina, all'immunochimica positiva per i marcatori di pluripotenza e all'espressione di geni della pluripotenza endogena. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la riprogrammazione basata su virus, è che questo protocollo garantisce una generazione coerente di IPSC senza integrazione A dimostrare la procedura oggi saranno Jesse, io e Gretchen Johnson.Un tecnico in laboratorio Inizia diluendo il sangue periferico con un rapporto uno a uno in DPBS. Quindi, in una provetta di polistirene a fondo tondo da 15 millilitri, sovrapporre con cura sette millilitri di sangue diluito su tre millilitri di impacco a temperatura ambiente. Dopo aver separato il campione per 30 minuti a 400 GS e temperatura ambiente, il pbmc si sarà depositato nello strato di interfaccia bianco torbido tra il plasma e l'high pack fial.Utilizzando una pipetta di trasferimento sterile, trasferire i P BMC in una provetta conica da 15 millilitri e portare il volume fino a 10 millilitri con DPBS fresco. Quindi, dopo aver contato le cellule, trasferire due volte 10 ai sei BMC P in un nuovo tubo conico da 15 millilitri e far girare le cellule rimanenti, congelare le cellule pellettate a una concentrazione di pbmc per millilitro due volte 10 a sei pbmc in siero bovino fetale al 90% con il 10% di dimetilsolfossido. Quindi, dopo aver fatto girare i BMC P che sono stati messi da parte, sospendiamo il pellet in due millilitri di terreno di espansione appena preparato e li pieghiamo in un pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti, incubiamo le cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con un'atmosfera di 5% di ossigeno, 5% di anidride carbonica e 90% di azoto.Quindi, il terzo e il sesto giorno, sostituire il terreno raccogliendo le cellule dal pozzo. Lavaggio del pozzetto con due millilitri di QBSF 60 per raccogliere eventuali celle rimanenti, pellettatura delle celle mediante centrifugazione e quindi sospensione del pellet in due millilitri di terreno di espansione fresco. Quindi rimettere le cellule nella stessa piastra a 12 pozzetti e continuare l'incubazione Il nono giorno, pipettare i plasmidi di riprogrammazione in una provetta sterile da 1,5 millilitri come indicato nella tabella.Successivamente, mescolare la soluzione di nucleo affetto con gli integratori forniti dal produttore e trasferire la miscela in un tubo DPH sterile da 1,5 millilitri. Quindi erogare due millilitri di terreno di espansione in un pozzetto di una nuova piastra a 12 pozzetti ed equilibrare il terreno nell'incubatore umidificato a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule non sono pronte. Raccogliere le cellule, lavare bene la coltura cellulare come appena dimostrato e lavare le cellule in cinque millilitri di DPBS.Quindi risalire, sospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di soluzione Nucle affection più integratore avendo cura di evitare di generare bolle e trasferire la sospensione cellulare nel tubo contenente il plasmide di riprogrammazione. Mescolare le cellule pipettando su e giù una volta e trasferire l'intera soluzione sul fondo di un nucleo di affezione vete. Quindi posizionare il vete nella macchina dell'affetto Nucle ed eseguire il programma T 0 1 9.Ora aggiungere 100 microlitri del mezzo di espansione EQUILIBRATED al nucleo affettivo vete, e raccogliere immediatamente l'intero campione evitando qualsiasi detrito bianco di cellule morte galleggianti e depositarlo nel pozzetto del mezzo di preriscaldamento. Quindi riposizionare le cellule nell'incubatore umidificato il giorno 10 o 11. Rivestire ogni pozzetto di una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti con gelatina con un millilitro di gelatina allo 0,1% in HBSS, quindi posizionare la piastra nell'incubatore umidificato o almeno cinque minuti durante l'incubazione trasferire una fiala di disgelo, due volte 10 ai sei topolini irradiati a 3000 gradi centigradi, embrionali, fibroblasti o mes in 10 millilitri di terreno di metanfetamina preriscaldato, e poi centrifugare le cellule mentre le cellule stanno ruotando verso il basso.Aspirare la soluzione di gelatina dalla piastra a sei pozzetti, quindi risospendere il mes in 12 millilitri di metanfetamina fresca. Erogare immediatamente due millilitri di OFM in ogni pozzetto della gelatina rivestita. Sei. Impiattare bene e riposizionare la piastra nell'incubatrice umidificata fino al giorno 12.Il giorno 12, raccogliere le cellule nucleate interessate dal pozzetto in un tubo conico da 15 millilitri, lavando il pozzetto come dimostrato per raccogliere le cellule rimanenti. Dopo aver centrifugato le cellule, sospendiamo il pellet in 12 millilitri di terreno di riprogrammazione appena preparato e distribuiamo due millilitri di cellule in ciascun pozzetto di celle di alimentazione. Nella piastra a sei pozzetti, centrifugare la piastra per 30 minuti a 75 GS e temperatura ambiente, quindi riposizionare la piastra nell'incubatore umidificato, cambiando il mezzo a giorni alterni per una o due settimane.Una volta che compaiono le colonie di cellule pluripotenti inducibili, iniziare a nutrire le cellule con un terreno di cellule staminali embrionali umane appena preparato contenente inibitori dell'istone deacetilasi tre giorni dopo l'affezione del nucleo e prima della placcatura, le cellule colpite dal nucleo sulla metanfetamina inducibile. L'efficienza di un'affezione nucleare NU di successo dovrebbe essere stimata mediante microscopia a fluorescenza Per l'EGFP, ad esempio, viene mostrato qui un tipico esperimento di affezione dei nuclei con circa il 5-10% della popolazione cellulare totale che esprime EGFP, le colonie di cellule staminali pluripotenti inducibili riprogrammate inizieranno a comparire circa due settimane dopo l'affezione nucleare di NU. Le colonie sono generalmente circolari con bordi ben definiti e possono essere identificate dalla loro caratteristica morfologia delle cellule staminali embrionali umane, comprese le piccole cellule strettamente impacchettate con un alto rapporto nucleare/citoplasmatico e i nucleoli visibili delle linee rappresentative che sono state completamente caratterizzate.Tutti i test positivi per l'attività della fosfatasi alcalina esprimono i marcatori di pluripotenza standard e riattivano i geni della pluripotenza endogena Una volta padroneggiati. Questa tecnica può generare costantemente IPSC senza integrazione in quattro settimane se viene eseguita correttamente. A seguito di questa procedura, è possibile eseguire studi di differenziazione per rispondere a domande su qualsiasi tipo di tessuto.

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Generazione indotte pluripotenti cellule staminali (IPSC) linee produce linee di diverso potenziale di sviluppo, anche quando passano i test standard per la pluripotenza. Qui si descrive un protocollo per la produzione di topi ottenute interamente da iPSCs, che definisce le linee IPSC come in possesso di pluripotenza...

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

Qui mostriamo un protocollo semplice ed efficace per la generazione di iPSCs umani da 3-4 ml di sangue periferico utilizzando un singolo vettore lentivirale riprogrammazione. La riprogrammazione delle cellule del sangue prontamente disponibili promette di accelerare l'utilizzo della tecnologia iPSC rendendola accessibile ad una comunità di ricerca più ampio.

Generazione di cellule pluripotenti indotte umane staminali da sangue periferico mediante il STEMCCA lentivirale Vector

Qui vi presentiamo il nostro metodo stabilito per riprogrammare cellule somatiche umane in libera-transgene iPSCs umane con virus di Sendai, che mostra esito coerente e una maggiore efficienza.

Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) rappresentano una fonte di tessuti paziente-specifici per le applicazioni cliniche e di ricerca di base. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per riprogrammare le cellule umane mononucleari di sangue periferico (PBMNCs) ottenute da buffy coats congelati in iPSCs-virali gratuito utilizzando non integrano plasmidi episomiale.

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da congelata Buffy cappotti con non-integrazione episomiale Plasmidi

Proponiamo un protocollo per la riprogrammazione delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Placcando le cellule del sangue trasdotte su piastre rivestite di matrice con centrifugazione, le iPSC vengono indotte con successo da cellule galleggianti. Questa tecnica suggerisce un protocollo di riprogrammazione semplice ed efficace per cellule come PBMC e CBMC.

Pluripotenti indotte generazione di cellule staminali da cellule del sangue Utilizzando Sendai Virus e centrifugazione

Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per la generazione efficiente di iPSC prive di integrazione da cellule del sangue periferico adulto umano. Con l'uso di quattro vettori episomiali basati su oriP/EBNA per esprimere i fattori di riprogrammazione, KLF4, MYC, BCL-XL o OCT4 e SOX2, è possibile ottenere migliaia di colonie di iPSC da 1 mL di sangue periferico.

Generazione di integrazione-liberi cellule staminali pluripotenti indotte dalle cellule mononucleari di sangue periferico umano Utilizzando episomiale Vettori

Questo protocollo descrive in dettaglio la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte privo di impronta (iPSCs) da cellule pancreatiche umane in condizioni prive di alimentatore, seguito da editing con CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine e caratterizzazione del modificati cloni unicellulari.

Efficiente generazione e la modifica di IPSCs privo di alimentatore da cellule pancreatiche umane utilizzando il sistema di CRISPR-Cas9

Questo protocollo dimostra l'induzione di un programma emogenico nei fibroblasti dermici umani mediante l'espressione forzata dei fattori di trascrizione GATA2, GFI1B e FOS per generare cellule staminali e progenitrici ematopoietiche.

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La riprogrammazione cellulare richiede l'introduzione di geni chiave, che regolano e mantengono lo stato cellulare pluripotente. Il protocollo descritto consente la formazione di colonie di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da fibroblasti dermici umani senza metodi virali/integranti, ma utilizzando RNA non modificati (NM-RNA) combinati con fattori di evasione immunitaria che riducono i meccanismi di difesa cellulare.

Isolamento di fibroblasti dermici umani adulti dalla pelle addominale e generazione di cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un metodo non integrato

L'attuale protocollo dettaglia i passaggi per la risoluzione di problemi della derivazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) di campioni di pazienti che sono state difficili da riprogrammare seguendo le istruzioni del produttore. Questo protocollo è specifico per campioni di buffy coat congelato, ma può essere applicato anche alla riprogrammazione di PBMC purificati.

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Scopri come generare cellule iPS senza integrazione da sangue periferico utilizzando plasmidi episomali e inibitori di HDAC. Questo metodo sicuro migliora l'efficienza della riprogrammazione per applicazioni terapeutiche.

Generazione efficiente delle cellule iPS da Blood Utilizzando episomi e HDAC inibitori

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