Generazione efficiente delle cellule iPS da Blood Utilizzando episomi e HDAC inibitori

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di generare cellule staminali pluripotenti indotte libere da integrazione da una piccola quantità di sangue periferico. Ciò si ottiene coltivando cellule mononucleate isolate del sangue periferico in fattori di crescita definiti per produrre una popolazione progenitrice di eritrociti molto reattiva alla riprogrammazione. Come secondo passo, i plasmidi episomiali non integranti portatori di geni di riprogrammazione vengono introdotti negli eritroblasti dall'affezione del nucleo per avviare il processo di riprogrammazione.

Successivamente, le cellule colpite dal nucleo vengono piastrate su uno strato di fibroblasti embrionali di topo irradiati per consentire una riprogrammazione continua con successo. Le colonie di cellule staminali pluripotenti indotte riprogrammate possono essere identificate in base alle loro caratteristiche morfologiche, all'attività della fosfatasi alcalina, all'immunochimica positiva per i marcatori di pluripotenza e all'espressione di geni della pluripotenza endogena. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la riprogrammazione basata su virus, è che questo protocollo garantisce una generazione coerente di IPSC senza integrazione A dimostrare la procedura oggi saranno Jesse, io e Gretchen Johnson.

Un tecnico in laboratorio Inizia diluendo il sangue periferico con un rapporto uno a uno in DPBS. Quindi, in una provetta di polistirene a fondo tondo da 15 millilitri, sovrapporre con cura sette millilitri di sangue diluito su tre millilitri di impacco a temperatura ambiente. Dopo aver separato il campione per 30 minuti a 400 GS e temperatura ambiente, il pbmc si sarà depositato nello strato di interfaccia bianco torbido tra il plasma e l'high pack fial.

Utilizzando una pipetta di trasferimento sterile, trasferire i P BMC in una provetta conica da 15 millilitri e portare il volume fino a 10 millilitri con DPBS fresco. Quindi, dopo aver contato le cellule, trasferire due volte 10 ai sei BMC P in un nuovo tubo conico da 15 millilitri e far girare le cellule rimanenti, congelare le cellule pellettate a una concentrazione di pbmc per millilitro due volte 10 a sei pbmc in siero bovino fetale al 90% con il 10% di dimetilsolfossido. Quindi, dopo aver fatto girare i BMC P che sono stati messi da parte, sospendiamo il pellet in due millilitri di terreno di espansione appena preparato e li pieghiamo in un pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti, incubiamo le cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con un'atmosfera di 5% di ossigeno, 5% di anidride carbonica e 90% di azoto.

Quindi, il terzo e il sesto giorno, sostituire il terreno raccogliendo le cellule dal pozzo. Lavaggio del pozzetto con due millilitri di QBSF 60 per raccogliere eventuali celle rimanenti, pellettatura delle celle mediante centrifugazione e quindi sospensione del pellet in due millilitri di terreno di espansione fresco. Quindi rimettere le cellule nella stessa piastra a 12 pozzetti e continuare l'incubazione Il nono giorno, pipettare i plasmidi di riprogrammazione in una provetta sterile da 1,5 millilitri come indicato nella tabella.

Successivamente, mescolare la soluzione di nucleo affetto con gli integratori forniti dal produttore e trasferire la miscela in un tubo DPH sterile da 1,5 millilitri. Quindi erogare due millilitri di terreno di espansione in un pozzetto di una nuova piastra a 12 pozzetti ed equilibrare il terreno nell'incubatore umidificato a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule non sono pronte. Raccogliere le cellule, lavare bene la coltura cellulare come appena dimostrato e lavare le cellule in cinque millilitri di DPBS.

Quindi risalire, sospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di soluzione Nucle affection più integratore avendo cura di evitare di generare bolle e trasferire la sospensione cellulare nel tubo contenente il plasmide di riprogrammazione. Mescolare le cellule pipettando su e giù una volta e trasferire l'intera soluzione sul fondo di un nucleo di affezione vete. Quindi posizionare il vete nella macchina dell'affetto Nucle ed eseguire il programma T 0 1 9.

Ora aggiungere 100 microlitri del mezzo di espansione EQUILIBRATED al nucleo affettivo vete, e raccogliere immediatamente l'intero campione evitando qualsiasi detrito bianco di cellule morte galleggianti e depositarlo nel pozzetto del mezzo di preriscaldamento. Quindi riposizionare le cellule nell'incubatore umidificato il giorno 10 o 11. Rivestire ogni pozzetto di una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti con gelatina con un millilitro di gelatina allo 0,1% in HBSS, quindi posizionare la piastra nell'incubatore umidificato o almeno cinque minuti durante l'incubazione trasferire una fiala di disgelo, due volte 10 ai sei topolini irradiati a 3000 gradi centigradi, embrionali, fibroblasti o mes in 10 millilitri di terreno di metanfetamina preriscaldato, e poi centrifugare le cellule mentre le cellule stanno ruotando verso il basso.

Aspirare la soluzione di gelatina dalla piastra a sei pozzetti, quindi risospendere il mes in 12 millilitri di metanfetamina fresca. Erogare immediatamente due millilitri di OFM in ogni pozzetto della gelatina rivestita. Sei. Impiattare bene e riposizionare la piastra nell'incubatrice umidificata fino al giorno 12.

Il giorno 12, raccogliere le cellule nucleate interessate dal pozzetto in un tubo conico da 15 millilitri, lavando il pozzetto come dimostrato per raccogliere le cellule rimanenti. Dopo aver centrifugato le cellule, sospendiamo il pellet in 12 millilitri di terreno di riprogrammazione appena preparato e distribuiamo due millilitri di cellule in ciascun pozzetto di celle di alimentazione. Nella piastra a sei pozzetti, centrifugare la piastra per 30 minuti a 75 GS e temperatura ambiente, quindi riposizionare la piastra nell'incubatore umidificato, cambiando il mezzo a giorni alterni per una o due settimane.

Una volta che compaiono le colonie di cellule pluripotenti inducibili, iniziare a nutrire le cellule con un terreno di cellule staminali embrionali umane appena preparato contenente inibitori dell'istone deacetilasi tre giorni dopo l'affezione del nucleo e prima della placcatura, le cellule colpite dal nucleo sulla metanfetamina inducibile. L'efficienza di un'affezione nucleare NU di successo dovrebbe essere stimata mediante microscopia a fluorescenza Per l'EGFP, ad esempio, viene mostrato qui un tipico esperimento di affezione dei nuclei con circa il 5-10% della popolazione cellulare totale che esprime EGFP, le colonie di cellule staminali pluripotenti inducibili riprogrammate inizieranno a comparire circa due settimane dopo l'affezione nucleare di NU. Le colonie sono generalmente circolari con bordi ben definiti e possono essere identificate dalla loro caratteristica morfologia delle cellule staminali embrionali umane, comprese le piccole cellule strettamente impacchettate con un alto rapporto nucleare/citoplasmatico e i nucleoli visibili delle linee rappresentative che sono state completamente caratterizzate.

Tutti i test positivi per l'attività della fosfatasi alcalina esprimono i marcatori di pluripotenza standard e riattivano i geni della pluripotenza endogena Una volta padroneggiati. Questa tecnica può generare costantemente IPSC senza integrazione in quattro settimane se viene eseguita correttamente. A seguito di questa procedura, è possibile eseguire studi di differenziazione per rispondere a domande su qualsiasi tipo di tessuto.