Alta efficienza differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane di cardiomiociti e Caratterizzazione mediante citometria di flusso

L'obiettivo generale di questa procedura è generare colture di alta qualità di cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti e caratterizzare adeguatamente il prodotto finale utilizzando la citometria a flusso. Per ottenere questo risultato vengono generate colture monostrato di alta qualità di cellule staminali pluripotenti indifferenziate. La cardiomiogenesi viene quindi indotta modulando la via del vento utilizzando piccole molecole.

Successivamente, i cardiomiociti vengono fissati, permeati e colorati utilizzando condizioni specificamente ottimizzate per ciascun anticorpo. Infine, le cellule vengono analizzate mediante citometria a flusso. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano colture altamente positive per i marcatori cardiaci, TNNI tre e IRX quattro e dimostrano potenziali d'azione ventricolari simili.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come quelli nei corpi dei dipendenti e delle trecce, è che è relativamente semplice da implementare ed è conveniente. Inoltre, la tecnica genera colture di cellule altamente positive per la troponina cardiaca I.Senza la variazione interna sottostante e l'efficienza osservate da altri protocolli, la dimostrazione visiva del metodo è fondamentale in quanto la qualità delle cellule pre-differenziazione influenzerà significativamente l'efficienza della differenziazione. Inoltre, una fissazione impropria e permeabile prima della colorazione degli anticorpi porterà a risultati di citometria a flusso non ottimali che dimostrano che la procedura sarà Shabo Bachar, uno studente laureato del mio laboratorio.

L'aspetto più impegnativo della seguente procedura è il mantenimento di cellule staminali pluripotenti indifferenziate di alta qualità prima della differenziazione. L'uso di cellule con caratteristiche di crescita non ottimali influenzerà significativamente l'efficienza della differenziazione. Iniziare questa procedura con HPC ben consolidati coltivati in sei piastre rivestite a matrice qualificate HESC.

Controllare le cellule al microscopio per assicurarsi che presentino una morfologia omogenea. Se le cellule presentano una morfologia simile all'epitelio neurale o ai fibroblasti come mostrato qui, non dovrebbero essere utilizzate. Assicurarsi che le cellule proliferino in modo robusto quando sono posizionate a 0,75 milioni per passaggio del pozzetto, circa ogni tre giorni al 75%Passaggio di confluenza delle cellule con dissociazione a livello di singola cellula almeno cinque volte prima dell'inizio del passaggio di differenziazione.

Le cellule aspirano prima il terreno di crescita E otto e lavano le cellule due volte con quattro millilitri di PBS preriscaldato a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere un millilitro di soluzione di distacco cellulare a temperatura ambiente a ciascun pozzetto e lasciare il pozzetto indisturbato fino a quando i bordi delle celle iniziano ad arrotondarsi. Questo richiede in genere da tre a sette minuti e può essere osservato macroscopicamente e confermato utilizzando un microscopio.

Successivamente, utilizzando una pipetta di vetro di cotone con un bulbo, si sganciano le cellule e le si trasferisce in una provetta conica da 15 millilitri contenente un millilitro di terreno DM EMF 12. Questo inattiverà la soluzione di distacco cellulare. Prelevare un'aliquota di 10 microlitri della soluzione cellulare e mescolarla con 10 microlitri di trian blue in una provetta da microcentrifuga.

Contare le cellule e poi centrifugare la provetta conica da 15 millilitri a 130 GS per cinque minuti. A temperatura ambiente durante la centrifugazione contare le cellule utilizzando un emocitometro automatico. Aspettatevi una redditività compresa tra il 70 e l'80% in futuro.

Basare tutti i numeri di cellule sulla conta totale delle cellule anziché sulla conta delle cellule vitali. Dopo la centrifuga, aspirare il terreno e risospendere il pellet cellulare in D-M-E-M-F 12 a una concentrazione finale di 0,75 volte 10 per le sei celle per 500 microlitri, aggiungere 0,5 millilitri della sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti in cui ogni pozzetto contiene due millilitri di terreno E otto. Con l'inibitore di roccia, far oscillare delicatamente la piastra dalla parte anteriore a quella posteriore e da un lato all'altro per disperdere uniformemente le cellule nel pozzetto.

Rimettere le cellule nell'incubatore al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius. 24 ore dopo il confezionamento. Iniziare a sostituire il terreno ogni giorno utilizzando due millilitri per pozzetto di E otto con senza inibitore di roccia.

Ottimizza la densità di semina per ottenere il 100% di confluenza prima dell'inizio della differenziazione. Il giorno zero, le cellule sono confluenti al 100% con una morfologia compatta e detriti cellulari minimi. Inizia il processo di differenziazione sostituendo il mezzo E otto con due millilitri di differenziazione. Medio.

Numero uno, aggiungi 1,2 microlitri di CHIR a ciascuno. Ebbene, il primo e il secondo giorno, è comune osservare una significativa morte cellulare dal 40 al 50%. Tuttavia, le cellule attaccate manterranno una morfologia compatta.

Durante questo periodo, il mezzo diventa arancione e torbido. Se si osserva un terreno rosa, che indica un'eccessiva morte cellulare, confermare la vitalità cellulare con il triam blue e interrompere se la morte cellulare supera il 70%Altrimenti, il primo giorno, ripetere il processo di sostituzione del terreno con due millilitri di differenziazione fresca. Medio. Numero uno, aggiungere 1,2 microlitri di CHIR a ciascun pozzetto e nei giorni due o tre, sostituire con un terreno di differenziazione fresco.

Numero uno, durante il terzo e il quarto giorno, le cellule si riprenderanno e la densità aumenterà il quarto giorno. Sostituire il terreno in ogni pozzetto con una nuova differenziazione. Medio numero uno e un microlitro di IWR uno.

Durante i giorni da cinque a sei, si verifica una morte cellulare minima e il quinto giorno possono iniziare a comparire chiazze dense, sostituendo il terreno con una nuova differenziazione. Il mezzo numero uno, e aggiungere un microlitro di IWR uno a ciascun pozzetto dal sesto al settimo giorno, sostituire il mezzo con una nuova differenziazione. Medio numero uno.

Dal settimo all'ottavo giorno, si ottiene un monostrato confluente con morfologia compatta intervallata da macchie dense. Entro l'ottavo giorno, le cellule inizieranno a contrarsi spontaneamente e le prime contrazioni saranno spesso visibili nelle chiazze dense. L'ottavo giorno, sostituisci il mezzo con una nuova differenziazione. Medio.

Numero due, continuare a sostituire con il mezzo di differenziazione numero due, a giorni alterni per tutta la durata della cultura. Entro il giorno 10 si osserva una contrazione più robusta che continuerà a diffondersi in tutta la cultura nei giorni successivi. Questo video mostra le celle al giorno 30 e qui le celle sono mostrate al giorno 55.

Per raccogliere le cellule per la citometria a flusso, eseguire la raccolta e il conteggio della dissociazione cellulare come eseguito in precedenza. Si noti che a questo punto non è necessario mantenere sterili le cellule. Mentre si agita delicatamente il pellet cellulare, aggiungere 100 microlitri di soluzione di fissazione al pellet cellulare goccia a goccia.

Quindi incubare la provetta con ghiaccio per 15 minuti. Aggiungere tre millilitri di soluzione di lavaggio cellulare, raccogliere le cellule mediante centrifugazione dopo la centrifuga, aspirare la soluzione durante il vortex. Aggiungere 100 microlitri di soluzione permeabile al pellet cellulare goccia a goccia come prima.

Quindi incubare la provetta con ghiaccio per 30 minuti. Aggiungere tre millilitri di soluzione di lavaggio cellulare. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e aspirare la soluzione.

Ripetere per un totale di due lavaggi dopo la permeazione. Eseguire la colorazione degli anticorpi come descritto nel documento di accompagnamento utilizzando una pipetta P 1000 a 400 microlitri di soluzione di mantenimento cellulare nelle cellule e disaggregarle pipettandole verso l'alto e verso il basso. Quindi, pre-bagnare un tappo del filtro cellulare su una provetta a fondo rotondo con 50 microlitri di soluzione per la manutenzione delle celle.

Metti il tubo sul ghiaccio. Il cappuccio del filtro cellulare impedisce agli aggregati cellulari di intasare il citometro a flusso. Quindi, trasferire la soluzione cellulare nel tappo del filtro cellulare e lasciare che la sospensione cellulare si scarichi per gravità.

Picchiettare delicatamente la parte inferiore della provetta sul piano di lavoro in modo che le cellule vengano raccolte in una provetta. Rimetti il tubo sul ghiaccio il più rapidamente possibile. Sciacquare il colino con 250 microlitri di soluzione per il mantenimento delle cellule per garantire il massimo recupero delle cellule.

Mantenere le cellule sul ghiaccio e proteggerle dalla luce fino a quando non vengono analizzate mediante citometria a flusso per determinare la qualità dei cardiomiociti generati. Utilizzando questo protocollo, le cellule sono state differenziate per 10 giorni e colorate con anticorpi contro TNNI tre a, marcatore di cardiomiociti pan, TNNT due marcatore muscolare striato e marcatore cardiomiocitario ventricolare IRX quattro A. Si noti che le condizioni di fissazione e permeabilità sono state ottimizzate per ciascun anticorpo per ottenere la percentuale massima di cellule positive.

Gli istogrammi mostrano che il 99% delle cellule gate era positivo per TNNI 3 e il 96% era positivo per IRX 4. Inoltre, le cellule erano altamente positive per altri marcatori di differenziazione cardiaca, tra cui TNNT due, MLC due V e MLC due. Si noti che l'affermazione riguardante la purezza dei cardiomiociti e l'identità cellulare si basa su TNNI tre e IRX quattro.

La colorazione MC due V e MC due A non è limitata dalla camera durante lo sviluppo e TNNT due si trova anche nel muscolo scheletrico. Il potenziale d'azione mostrato qui è stato registrato da un singolo cardiomiocita che si contrae spontaneamente al giorno 46 di differenziazione utilizzando il patch clamping dell'intera cellula. Il profilo del potenziale d'azione indica che sono stati ottenuti cardiomiociti di tipo ventricolare.

È stata osservata anche una piccola percentuale di profili di tipo linfonodale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare colture di alta qualità di cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti e di come caratterizzarle mediante citometria a flusso. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa delle sfide comuni incontrate nel mantenere le cellule staminali come monostrati di alta qualità prima dell'inizio della differenziazione.

Non dimenticare che lavorare con un fissativo può essere pericoloso e personale. Durante l'esecuzione di questa procedura devono essere sempre indossati dispositivi di protezione come camice da laboratorio o guanti.