Name: Alta efficienza differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane di cardiomiociti e Caratterizzazione mediante citometria di flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Scopri la differenziazione efficiente di cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti umane mediante modulazione della via Wnt. Questo metodo utilizza citometria a flusso per caratterizzare l'identità cellulare.

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Questa ricerca è stata sostenuta dal NIH 4R00HL094708-03, MCW affari di ricerca Comitato New Faculty Award, e la fondazione Kern (fondi di avvio) presso il Medical College of Wisconsin (RLG); Research Grants Consiglio tematico Hong Kong Scheme ricerca T13-706 / 11 (KRB); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394, e AHA Fondata Investigator Award (JCW); AHA Postdoctoral Fellowship 12POST12050254 (PWB). Ringraziamo Speranza Campbell al Citometria a flusso Nucleo del Sangue Research Institute of Wisconsin per l&#39;assistenza con la raccolta dei dati e un&#39;attenta revisione del manoscritto.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Fondamentale per il successo del protocollo di differenziazione è l&#39;uso di colture di alta qualità hPSCs che sono state fatte passare a livello di singola cellula per almeno cinque passaggi prima dell&#39;inizio della differenziazione. Efficienze di differenziazione simili sono regolarmente osservate tra varie linee HPSC se sono 100% confluenti all&#39;inizio di differenziazione, indipendentemente linea cellulare. Efficienza non ottimale si osserva se la confluenza delle cellule all&#39;inizio della differenziazione...

La generazione di cardiomiociti da hPSCs, tra cui hESC e hiPSC, può funzionare come un modello in vitro di molto precoci processi di sviluppo cardiache umane, permettono di approfondire le fasi non altrimenti accessibili per gli studi meccanicistici. Questo modello di sistema fornisce opportunità uniche per studiare i meccanismi molecolari che controllano l&#39;impegno lignaggio cardiaco e le specifiche destino cellulare. Negli ultimi anni, la capacità di generare in modo efficiente le cellule cardiomyogenic da hPSCs è notevolmente migliorata 1-15. Tuttavia, tra protocolli c&#39;è variazione linea cellulare rispetto alla efficienza nella generazione di cellule cardiomyogenic ei tempi in cui le cellule esprimono marcatori specifici a camera (per esempio, ventricolo e atri). Idealmente, per le future applicazioni di questo sistema modello, le popolazioni più omogenee di cellule funzionalmente definiti sono desiderati. In contrasto con i metodi precedenti, il protocollo di differenziazione dei cardiomiociti qui descritto non richiede cell aggregazione o l&#39;aggiunta di Activin A o proteina morfogenetica dell&#39;osso 4 (BMP4) e robusta genera culture molto positivo per TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v, e MLC2a di giorno 10 celle in tutte le linee di hESC e hiPSC testati fino ad oggi. La strategia è tecnicamente semplice da realizzare, soprattutto rispetto a culture tridimensionali, cultura di massa, o strategie corpo embrioide basate 4-9, ed è stato recentemente definito in uno studio che descrive una piccola molecola con tossicità selettiva per hPSCs (Boheler et al. ) 65. Caratteristiche di questo protocollo sono la differenziazione delle hPSCs in coltura monostrato utilizzando un singolo strato di una matrice qualificato hESC (Matrigel), mezzi di questo tipo utilizzando piccole molecole di modulare la segnalazione Wnt (simile, ma distinto da 1,2,7,13), e citometria a flusso ottimizzato metodi di colorazione per la valutazione dell&#39;efficienza differenziazione e l&#39;identità delle cellule. In sintesi, i vantaggi di questo protocollo rispetto alle relazioni precedenti comprendono il suo costo-effectiveness, riproducibilità, e la sua elevata efficienza per la generazione di cardiomiociti tra più linee HPSC, comprese le linee di hESC e hiPSC. La citometria a flusso è un potente strumento analitico per valutare la qualità delle cellule in coltura e determinazione sottopopolazione omogeneità, e con una corretta progettazione sperimentale, in grado di fornire misurazioni quantitative. Come per tutte le strategie a base di anticorpi, accurata interpretazione dei risultati sperimentali richiede che gli elementi del disegno dosaggio compreso concentrazione di anticorpi e di fissazione e permeabilizzazione (quando le condizioni di targeting antigeni intracellulari) sono accuratamente testati per ogni anticorpo in condizioni sub-ottimali influenzano in modo significativo l&#39;efficienza di anticorpi vincolante, e quindi, l&#39;interpretazione dei risultati. È importante sottolineare che, se è richiesta la quantificazione, gli anticorpi monoclonali sono essenziali, come gli anticorpi policlonali possono riconoscere più epitopi e sono soggetti a variazioni da lotto a lotto. Attualmente, una varietà di anticorpi (posono stati descritti i protocolli lyclonal e monoclonali) e colorazione per la valutazione di differenziazione in vitro, il che rende difficile confrontare l&#39;efficienza di cardiomiogenesi tra protocolli 1,2,9,11. Per questo motivo, gli anticorpi monoclonali vengono utilizzati quando disponibili per tutte le analisi di citometria a flusso. Andando avanti, si prevede che la standardizzazione di questi protocolli di colorazione, soprattutto per quanto riguarda la quantificazione, dovrebbe consentire una migliore comparazione tra le strategie di differenziazione. La scelta di marcatori, e le loro corrispondenti anticorpi, utilizzato per valutare la purezza di in vitro cardiomiogenesi varia tra i rapporti. TNNT2 è stato considerato un indicatore di cellule impegnate nel destino cardiomyogenic ed è solitamente usata per valutare l&#39;efficienza dei protocolli di differenziamento cardiaci. Tuttavia, TNNT2 si esprime anche nel muscolo scheletrico durante l&#39;inizio pulcino e ratto sviluppo 16,17 ed è presente nel muscolo liscio umano 18 </sup&gt;. Così, TNNT2 non è necessariamente un marcatore specifico della cardiomiogenesi umana in vitro. MLC2v e MLC2a sono abitualmente utilizzati come marcatori surrogati di ventricolari ed atriali sottotipi, rispettivamente. Tuttavia, le sfide con basandosi su MLC2v e MLC2a per determinare cardiomiociti sottotipo nel contesto di differenziazione in vitro derivano dal fatto che questi prodotti genici non possono essere limitati a una specifica camera durante lo sviluppo cardiaco, dal tubo cuore attraverso adulto. Nel roditore loop cuore, MLC2a mRNA è predominante nella atriale / zona del tratto di afflusso e MLC2v mRNA è predominante nelle regioni del tratto ventricolare / deflusso. Nel cuore loop, co-espressione di MLC2a e MLC2v mRNA si osservano nel tratto di afflusso, canale atrioventricolare, e il tratto di efflusso 19,20. Entro 3 giorni dopo la nascita, MLC2v mRNA è limitato al ventricolo e di 10 giorni dopo la nascita, MLC2a è limitata alla atri neonatale nel ratto cuore 19. Pertanto, l&#39;interpretazionedei dati riguardanti l&#39;efficienza cardiomiogenesi e identità sottotipo deve non solo considerare la presenza e la quantità di livelli di marcatori di riferimento, ma deve prendere in considerazione lo stadio di sviluppo (s) a cui i punti temporali di differenziazione che vengono analizzati corrispondono. Ciò è particolarmente importante se si considera che la fase di maturazione delle cellule cardiomyogenic generate dalla differenziazione in vitro di hPSCs assomiglia più da vicino quelle di sviluppo embrionale / fetale 21-25. Così, basandosi su espressione spaziale di un marcatore nel cuore postnatale potrebbe non essere adatto per la valutazione delle cellule HPSC-derivate, almeno in alcuni casi. Nel tentativo di agevolare lo sviluppo di criteri più specifici per definire l&#39;identità dei cardiomiociti in vitro, TNNI3 è considerato un indicatore importante per valutare cardiomiogenesi in vitro in quanto è limitato al muscolo cardiaco durante l&#39;embriogenesi in pulcino e zebrafish 15,20ed è assente nel feto umano muscolo scheletrico 26. Mentre TNNI1 è presente nel cuore fetale umano, TNNI3 è la sola isoforma TNNI presente nel cuore adulto normale 27,28. Per quanto riguarda cardiomiociti sottotipo identità, IRX4 29-31 è un marcatore informativa di cellule con un destino ventricolare. A livello di proteine, IRX4 è stato recentemente dimostrato di essere limitato al ventricolo dal tubo lineari cuore attraverso le fasi neonatali nel topo 32. Di conseguenza, sono descritti protocolli di colorazione ottimizzati per l&#39;analisi di TNNI3 e IRX4 mediante citometria a flusso. A nostra conoscenza, questa è la prima descrizione di un metodo efficace per la colorazione a base di anticorpi e l&#39;analisi dei livelli di IRX4 in cardiomiociti umani mediante citometria a flusso.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cell Culture</td></tr><tr><td>BD Matrigel, matrice qualificata hESC</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr> Soluzione per il <tr><td>distacco di cellule accutasi</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS), senza calcio, senza magnesio</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO, Hybri-Max, filtrato sterile)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>53817</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2404-100G</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato inibitore selettivo p160ROCK R</td><td>& D Systems</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico-2-fosfato sale di sesquimagnesio idrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>Selenito di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261-10G</td><td></td></tr><tr><td>Transferrina (Optiferrin - ndash; Definito, senza animali, ricombinante umano)</td><td>Invitria</td><td>777TRF029</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2)</td><td>R& D Systems</td><td>4144-TC-01M</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita trasformante beta 1 (TGF&beta; 1)</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 con L-Glutammina e 15 mM HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021 HCl</td><td>Sellekchem</td><td>S2924</td><td></td></tr><tr><td>IWR-1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I0161</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 con L-Glutammina</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Integratore B-27 Minus Insulin</td><td>Life Technologies</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>Integratore B-27 (con insulina)</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Life Technologies</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Flow Cytometry Reagents</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (10x)</td><td>Quality Biological Inc.</td><td>119-069-151</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank senza Ca2+ e Mg2+</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix</td><td>BD Biosciences</td><td>554655</td><td></td></tr><tr><td>BD Phosflow perm buffer III</td><td>BD Biosciences</td><td>558050</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldeide</td><td>Thermo Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179957-4L</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Mallenckrodt Chemicals&nbsp;</td><td>2440-16</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>M236-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di blu di tripano, 0,4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>5 ml Tubo in polistirene a fondo tondo (senza tappo)</td><td>Corning</td><td>352008</td><td>Per la preparazione di Celle per citometria a flusso</td></tr><tr><td>5 ml Provetta in polistirene a fondo tondo (con 35 &micro; Tappo a scatto per filtro cellulare M)</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>Per la preparazione di cellule per citometria a flusso</td></tr><tr><td>Bulbi di gomma da 2 ml</td><td>Fischer Scientific</td><td>03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>Vetro borosilicato da 9" non collegato Pipette Pasteur</td><td>BioExpress</td><td>P-2904-2</td><td></td></tr><tr><td>0,65 ml Provette per microcentrifuga, graduate, verdi</td><td>GeneMate</td><td>C-3259-G</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 ml, graduate, rosso</td><td>GeneMate</td><td>C-3260-R</td><td></td></tr><tr><td>TC20 contatore di cellule automatizzato</td><td>BioRad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini di conteggio per TC20</td><td>BioRad</td><td>145-0011</td><td></td></tr> 6 <tr><td>pozzetti Piastra trattata per colture tissutali a fondo piatto</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe da 20 ml BD</td><td>Plastipak</td><td>300613</td><td>Per la sterilizzazione con filtro di aliquote</td></tr><tr><td>Filtri per siringhe sterili, 0,2 & micro; m polietersulfone</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>Per la sterilizzazione del filtro di aliquote</td></tr><tr><td>250 ml Sistema di filtraggio, 0,22 &; micro; m polietersulfone, sterilizzante, a basso legame</td><td>Corning</td><td>431096</td><td>Per la sterilizzazione con filtro di mezzi sfusi</td></tr><tr><td>Sistema di filtraggio da 500 ml, 0,22 &; m polietersulfone, sterilizzante, a basso legame</td><td>Corning</td><td>431097</td><td>Per la sterilizzazione con filtro di terreni</td></tr><tr> sfusi<td colspan="4">Anticorpi e controlli isotipici</td></tr><tr><td>Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7))</td><td>Abcam</td><td>ab19615</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>Anti-TNNT2 (clone: 1C11)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA1-16687</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>primario Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5)</td><td>Sistemi sinaptici</td><td>310111</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7)</td><td>Abcam</td><td>AB131661</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>primario Anti-IRX4&nbsp; &nbsp;</td><td>Bioss</td><td>BS-9464R</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Capra anti-topo IgG1&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A21121</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Capra anti-topo IgG2a</td><td>Life Technologies</td><td>A21241</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Capra anti-topo IgG2b</td><td>Life Technologies</td><td>A21141</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Ficoeritrina (PE) Capra anti-coniglio IgG</td><td>R& D Systems</td><td>F0110</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>di topo IgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>557273</td><td>Controllo dell'isotipo</td></tr><tr><td>di topo IgG2a</td><td>eBiosciences</td><td>16-4724-81</td><td>Controllo dell'isotipo</td></tr><tr><td>IgG-PE di coniglio</td><td>R& D Systems</td><td>IC105P</td><td>Isotype Control</td></tr><tr><td colspan="4">TaqMan Probesets per qRT-PCR</td></tr><tr><td>ACTB</td><td>Life Technologies</td><td>Hs01060665</td><td></td></tr><tr><td>Brachyury T</td><td>Life Technologies</td><td>Hs00610080</td><td></td></tr><tr><td>CASQ2</td><td>Life Technologies</td><td>Hs00154286</td><td></td></tr><tr><td>IRX4</td><td>Life Technologies</td><td>Hs01100809</td><td></td></tr><tr><td>ISL1</td><td>Life Technologies</td><td>Hs00158126</td><td></td></tr><tr><td>MESP1</td><td>Life Technologies</td><td>Hs01001283</td><td></td></tr><tr><td>MYH11 (SMMHC)</td><td>Life Technologies</td><td>Hs00224610</td><td></td></tr><tr><td>MYH6</td><td>Life Technologies</td><td>Hs01101425</td><td></td></tr><tr><td>MYL2 (MLC2v)</td><td>Life Technologies</td><td>Hs00166405</td><td></td></tr><tr><td>MYL7 (MLC2a)</td><td>Life Technologies</td><td>Hs01085598</td><td></td></tr><tr><td>MYOG</td><td>Life Technologies</td><td>Hs01072232</td><td></td></tr><tr><td>NKX2.5</td><td>Life Technologies</td><td>Hs00231763</td><td></td></tr><tr><td>NPPA</td><td>Life Technologies</td><td>Hs01081097</td><td></td></tr><tr><td>POU5F1</td><td>Life Technologies</td><td>Hs04260367</td><td></td></tr><tr><td>SOX17</td><td>Life Technologies</td><td>HS00751752</td><td></td></tr><tr><td>TNNI1</td><td>Life Technologies</td><td>HS00913333</td><td></td></tr><tr><td>TNNI2</td><td>Life Technologies</td><td>HS00268536</td><td></td></tr><tr><td>TNNI3</td><td>Life Technologies</td><td>HS00165957</td><td></td></tr><tr><td>TNNT2</td><td>Life Technologies</td><td>HS00165960</td><td></td></tr></tbody></table>

alta efficienza differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane di cardiomiociti e caratterizzazione mediante citometria di flusso

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

Vi è un urgente bisogno di sviluppare approcci per riparare il cuore danneggiato, la scoperta di nuovi farmaci terapeutici che non hanno effetti tossici sul cuore, e migliorare le strategie per modellare con precisione la malattia di cuore. Il potenziale di sfruttare la tecnologia umana indotto cellule staminali pluripotenti (hiPSC) per generare il muscolo cardiaco &quot;in un piatto&quot; per queste applicazioni continua a generare entusiasmo alto. Negli ultimi anni, la capacità di generare in modo efficiente le cellule cardiomyogenic da cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) è notevolmente migliorata, offrendoci nuove opportunità di modellare primissime fasi dello sviluppo cardiaco umano non altrimenti accessibili. A differenza di molti metodi precedenti, il protocollo di differenziazione dei cardiomiociti qui descritto non richiede l&#39;aggregazione delle cellule o l&#39;aggiunta di Activin A o BMP4 e genera robusta colture di cellule che sono altamente positivo per la troponina cardiaca I e T (TNNI3, TNNT2), Iroquois proteine ​​classe homeodomainIRX-4 (IRX4), miosina catena leggera normativo 2, isoforma ventricolare / muscolo cardiaco (MLC2v) e miosina catena leggera normativo 2, isoforma atriale (MLC2a) dal giorno 10 in tutti cellule staminali embrionali umane (hESC) e le linee hiPSC testato per data. Le celle possono essere diversi passaggi e mantenuti per più di 90 giorni di coltura. La strategia è tecnicamente semplice da implementare e conveniente. Caratterizzazione dei cardiomiociti derivati ​​da cellule pluripotenti spesso include l&#39;analisi dei marcatori di riferimento, sia a livello di mRNA e proteine. Per l&#39;analisi delle proteine, citometria a flusso è un potente strumento analitico per valutare la qualità delle cellule in coltura e determinazione sottopopolazione omogeneità. Tuttavia, la variazione tecnica in preparazione del campione può influenzare significativamente la qualità della citometria a flusso di dati. Così, la standardizzazione dei protocolli di colorazione dovrebbe facilitare il confronto tra le varie strategie di differenziazione. Di conseguenza, ottimizzati protocolli di colorazione per l&#39;analisi di IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, e TNNT2 mediante citometria di flusso sono descritti.

Il giorno 0, le cellule sono al 100% confluenti con morfologia compatta e detriti cellulari minima. Nei giorni 1-2, è comune osservare significativo morte cellulare (40-50%), ma le cellule attaccate manterrà morfologia compatta (Figura 1A). Durante questo periodo, i media è arancione e torbido. Rosa supporto indica morte cellulare eccessiva, e in questo caso, confermare con trypan blu e interrompere se la morte cellulare supera il 70%. Le cellule si riprenderà nei giorni 3-4 e la densità aumenteranno. D...

L&#39;articolo descrive la metodologia dettagliata per differenziare efficacemente le cellule staminali pluripotenti umane in cardiomiociti selettivamente modulando la via di Wnt, seguita da analisi citofluorimetrica di marcatori di riferimento per valutare l&#39;omogeneità e l&#39;identità della popolazione.

Alta efficienza differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane di cardiomiociti e Caratterizzazione mediante citometria di flusso

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare colture di alta qualità di cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti e caratterizzare adeguatamente il prodotto finale utilizzando la citometria a flusso. Per ottenere questo risultato vengono generate colture monostrato di alta qualità di cellule staminali pluripotenti indifferenziate. La cardiomiogenesi viene quindi indotta modulando la via del vento utilizzando piccole molecole.Successivamente, i cardiomiociti vengono fissati, permeati e colorati utilizzando condizioni specificamente ottimizzate per ciascun anticorpo. Infine, le cellule vengono analizzate mediante citometria a flusso. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano colture altamente positive per i marcatori cardiaci, TNNI tre e IRX quattro e dimostrano potenziali d'azione ventricolari simili.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come quelli nei corpi dei dipendenti e delle trecce, è che è relativamente semplice da implementare ed è conveniente. Inoltre, la tecnica genera colture di cellule altamente positive per la troponina cardiaca I.Senza la variazione interna sottostante e l'efficienza osservate da altri prot

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Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione della cardioblasts pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di risorse umane progenitori cardiaci e funzionale cardiomiociti per la riparazione cardiovascolare.

Derivazione efficiente dei diritti dell&#39;uomo e precursori cardiaci e cardiomiociti pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

Le cellule staminali pluripotenti, sia staminali (iPS), le cellule embrionali pluripotenti o indotto, costituiscono una preziosa fonte di cellule differenziate umani, tra cardiomiociti. Qui, ci si concentrerà sulla induzione cardiaco di cellule iPS, che mostra come usarli per ottenere cardiomiociti umani funzionali attraverso un protocollo embryoid corpi-based.

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Qui, descriviamo un robusto protocollo per la derivazione di cardiomiociti umani che combina la differenziazione cardiaca modulata da piccole molecole e la purificazione dei cardiomiociti mediata dalla privazione di glucosio, consentendo la produzione di cardiomiociti purificati ai fini della modellazione delle malattie cardiovascolari e dello screening dei farmaci.

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Qui, presentiamo un protocollo di differenziazione dei cardiomiociti robusto, veloce e scalabile per cellule staminali pluripotenti umane (hPSC). I cardiomiociti derivati utilizzando questo metodo su larga scala possono fornire un numero sufficiente di cellule per il loro uso efficace nella modellazione delle malattie cardiovascolari umane, nello screening di farmaci ad alto rendimento e potenzialmente in applicazioni cliniche.

Produzione su larga scala dei cardiomiociti da cellule staminali umane pluripotenti usando un altamente riproducibile piccole molecole-Based Differenziazione protocollo

Presentiamo tre protocolli nuovi e più efficienti per la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane in cardiomiociti, cellule endoteliali e cellule muscolari lisce e un metodo di consegna che migliora l'attecchimento delle cellule trapiantate, combinando l'iniezione di cellule con la consegna citochine patch-mediata.

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In Vitro Differenziazione delle cellule staminali mesenchimali umane in funzionale del Cardiomyocyte-come le cellule

Questo articolo contiene una serie di protocolli per lo sviluppo di reti di cardiomiociti derivate da cellule staminali derivate da cellule staminali derivate dall'uomo (hiPSC-CM) coltivate su piastre MEA multiwell per elettropolarmente la membrana cellulare per misurazioni potenziali di azione. Le registrazioni ad alta velocità vengono ottenute ripetutamente dagli stessi siti cellulari nel corso di giorni.

Reti di cardiomiociti derivati da umani da iPSC su array di microelettrodi multiwell per registrazioni di potenziali azioni ricorrenti

Qui descriviamo e convalidiamo un metodo per generare costantemente robusti cardiomiociti derivati da cellule staminali derivate da cellule staminali indotte dall'uomo e caratterizzano la loro funzione. Queste tecniche possono aiutare a sviluppare informazioni meccanicistiche sui percorsi di segnalazione, fornire una piattaforma per lo screening farmacologico su larga scala e modellare in modo affidabile le malattie cardiache.

Generazione di Cardiomiociti Ventricular-Like HiPSC-Derived e preparati cellulari di alta qualità per la caratterizzazione della movimentazione del calcio

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Viene presentato un metodo riproducibile per generare tessuti miocardici 3D combinando scaffold di scrittura elettrofilante (MEW), policaprolattone (PCL) e idrogel di fibrina con cardiomiociti e fibroblasti derivati da hiPSC. Questa tecnica offre un controllo preciso sull'architettura dello scaffold e può essere applicata nei test preclinici sui farmaci e nella modellazione delle malattie cardiache.

Generazione 3D di tessuto miocardico umano mediante scrittura di elettrofilatura per fusione di scaffold di policaprolattone e cellule cardiache derivate da hiPSC

Scopri la differenziazione efficiente di cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti umane mediante modulazione della via Wnt. Questo metodo utilizza citometria a flusso per caratterizzare l'identità cellulare.

Alta efficienza differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane di cardiomiociti e Caratterizzazione mediante citometria di flusso (Video) | JoVE Journal

Alta efficienza differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane di cardiomiociti e Caratterizzazione mediante citometria di flusso

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