Assay Semplice per la quantificazione della Social Prevenzione in Drosophila melanogaster

L'obiettivo di questa procedura è quantificare la risposta delle mosche al segnale sociale emesso dagli individui stressati. Ciò si ottiene raccogliendo per la prima volta le mosche del risponditore e dell'emettitore non più di due giorni prima dell'esperimento. Il secondo passo consiste nel trasferire sia i moscerini emettitori che quelli responder in fiale fresche due ore prima dell'esperimento e lasciarli abituare alla stanza controllata dal punto di vista ambientale in cui verrà eseguito il test.

Successivamente, le mosche responder vengono inserite nelle TMA e data la scelta tra una fiala in cui le mosche sono state precedentemente stressate, contenente quindi l'odorante da stress drosophila, e una fiala fresca, il passaggio finale consiste nel contare il numero di mosche responder nella fiala fresca nella fiala DSO e nell'ascensore per quantificare la loro risposta al DSO. In definitiva, il labirinto a T viene utilizzato per misurare l'evitamento da parte delle mosche di un segnale di stress sociale, in particolare l'odorante da stress gilo. Ho avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando ero un postdoc al Caltech.

A quel tempo, Greg Sue e il suo consulente post-dottorato David Anderson, erano interessati a studiare la paura o l'evitamento sociale in Phyla, ma non esisteva alcun test per questo. Mi hanno contattato perché stavo eseguendo molti test comportamentali nel laboratorio di S brands e mentre eseguivo esperimenti di taxi fotografico e di apprendimento olfattivo, avevo notato che le mosche erano attratte da fiale in cui altre mosche avevano trascorso un po' di tempo indisturbate evitando le fiale in cui le mosche erano state stressate in quel momento con una scossa elettrica. Vescovo. La dimostrazione di questo metodo è fondamentale in quanto il processo sperimentale del saggio di evitamento sociale richiede un po' di pratica per essere rapidi ed efficienti nel trasferimento del bios senza perdere mosche o DSL.

Il vantaggio principale di questa tecnica per esaminare le interazioni sociali rispetto ai metodi esistenti come il tracciamento video assistito da computer, è che si tratta di un test facile da padroneggiare e implementare, ma è molto potente per quantificare l'evitamento sociale degli individui stressati. Per iniziare l'esperimento, taglia un foglio di polietilene poroso per coprire una scatola di 12,7 centimetri per 10,2 centimetri. Riempi la scatola con ghiaccio tritato e coprila con il foglio per completare l'apparecchio per anestesia fredda della drosophila.

Esegui l'esperimento su una panca coperta da una copertura bianca e una lavagna bianca davanti per garantire condizioni di illuminazione omogenee. Quindi, prepara l'apparato dei compagni di squadra dell'aspiratore di mosche a vortice, il termometro e il timer. Uno o due giorni prima dell'esperimento, l'anestetizzazione del colon fa volare.

Trasferisci le mosche con un imbuto in un tubo da 50 millilitri e posiziona il tubo in un secchiello per il ghiaccio isolato sotto il livello del ghiaccio. Attendi cinque minuti che le mosche entrino in coma da brivido. Quindi trasferire le mosche sul foglio di polietilene poroso a temperatura ambiente e selezionare le mosche responder con uno stereomicroscopio.

Separare le mosche maschi da tre a sette giorni dalle mosche femmine e mantenere queste mosche in un gruppo di 40 mosche emettitrici di Canton di sesso misto raccolte delicatamente. Utilizzando un aspiratore per la bocca lascia che le mosche siano in grado di farlo. Una notte di recupero per ridurre al minimo qualsiasi effetto confondente della raccolta sul comportamento.

Quindi, apri il sacchetto delle fiale di test per sostituire l'aria viziata che odora di plastica nel sacchetto con aria fresca. Prima dell'esperimento, assicurarsi che la temperatura della stanza di prova sia di 25 gradi Celsius, che la stanza abbia una luce uniforme e che l'umidità sia superiore al 30%Due ore prima dell'esperimento, trasferire le mosche del rispondente e dell'emettitore in fiale di cibo fresco e consentire alle mosche di adattarsi all'ambiente sul banco in cui verrà eseguito l'esperimento. Posiziona il labirinto di tè sul tappetino martellante e stringi la clip a vite in modo che l'ascensore sia stabile.

Quindi, trasferisci le mosche del responder in una nuova fiala di prova e fai scattare la fiala contenente le mosche del responder sopra il labirinto del tè. Quindi inclina l'apparecchio del labirinto del tè e picchiettalo sul tappetino da pestare in modo che i moscerini della frutta cadano nell'ascensore. Sposta la parte superiore dell'ascensore verso il basso per posizionare le mosche tra le sezioni superiore e inferiore dei TMA e assicurati che l'ascensore sia al di sopra del punto di scelta per evitare che le mosche scappino mentre le mosche del soccorritore si stanno adattando al nuovo ambiente.

Metti le mosche dell'emettitore in una fiala di prova fresca e coprila con un pezzo di cotone. Agitare la fiala su un mini vortice in questo modo. Le mosche emetteranno DSO, trasferiranno le mosche in una fiala di cibo e posizioneranno rapidamente la fiala piena di DSO in uno dei due lati della squadra.

A alternare il lato di posizionamento per la fiala riempita DSO. In ogni nuova corsa, posiziona una nuova fiala di prova sull'altro lato della squadra A, quindi abbassa completamente l'ascensore in modo che i moscerini della frutta possano scegliere tra la fiala di prova fresca e la fiala piena di DSO. Avvia immediatamente il timer.

Dopo un minuto, spostare l'ascensore verso l'alto per separare le mosche nella fiala fresca e nella fiala DSO dalle mosche bloccate nell'ascensore. Conta il numero di mosche in ogni fiala e nell'ascensore. Ripeti l'operazione.

Per ogni genotipo e/o condizione, la dimensione del gruppo di mosche responder non influenza il loro evitare la DSO. Dopo aver eseguito l'esperimento su un intervallo da 10 a 80 mosche, un test T non ha mostrato alcuna significatività statistica tra gli indici di prestazione o PI delle mosche responder. Il numero di mosche emettitrici influisce sull'evitamento delle mosche del DSO, come dimostrato da questo grafico, che rappresenta diverse prove.

Utilizzando da 10 a 160 mosche emettitrici ciascuna. Un sostanziale evitamento è stato comunque rilevato con solo 10 mosche stressate. La scelta, il tempo e il background genetico dei moscerini della frutta influenzano la risposta al DSO, come dimostrato da questo grafico, che illustra una risposta dei ceppi di Canton e Elwood.

Entrambi i genotipi mostrano una maggiore evitabilità del DSO rispetto all'Oregon e ad alcuni ceppi di markin dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per identificare il circuito neuronale alla base della percezione e dell'evitamento della CO2, uno dei componenti del DSO. È stato anche utilizzato per studiare il ruolo dei geni candidati all'autismo nell'influenzare il comportamento sociale.

In Joseph Ano Gaster. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di cinque minuti per replica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come condurre un test di evitamento sociale dalla preparazione delle mosche dell'emettitore e del soccorritore prima di testarle alla generazione del bios sul campo DSL e alla manipolazione dei compagni di squadra per fornire ai rispondenti una scelta binaria.