Isolare e utilizzo Sezioni di mesenterica bovina arteria e vena come un saggio biologico per verificare Vasoactivity nel piccolo intestino
7 ottobre 2014
L'intestino tenue è spesso esposto alle tossine che possono influenzare il flusso di sangue e di influenzare negativamente l'assorbimento dei nutrienti. Utilizzando un multimyograph e mesenterica arteria e vena isolati, composti o tossine di interesse possono essere sottoposti a screening per vasoactivity.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di isolare sezioni trasversali di arterie e vene mesenteriche bovine in un grafico multim per consentire lo screening di composti sperimentali per la loro attività vascolare. Ciò si ottiene raccogliendo prima un campione di tessuto mesenterico dall'animale. Nella seconda fase, il campione viene pulito e i recipienti vengono sezionati.
Successivamente, le sezioni vengono montate ed equilibrate sul myo graft. Nella fase finale, i recipienti isolati vengono esposti ai composti di interesse. In definitiva, questo biodosaggio di arterie e vene può essere utilizzato per valutare l'attività vascolare dei composti e gli effetti che hanno sul flusso sanguigno all'interno dei vasi sanguigni mesenterici bovini.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la misurazione del flusso sanguigno in vivo, è che con questa tecnica, il tessuto di un singolo animale può essere esposto a più composti contemporaneamente. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su sindromi animali molto specifiche che possono causare vasocostrizione come la festuca, la tossicosi o l'ergotismo, può anche essere applicato ad altri scenari che possono essere di interesse per i ricercatori, come i prodotti farmaceutici in fase di sviluppo o i prodotti naturali. Inoltre, potrebbe anche essere applicato non solo alla vascolarizzazione del bestiame, ma anche alla vascolarizzazione di qualsiasi altra specie di mammifero.
Dopo aver rimosso i vasi sanguigni dal tessuto mesenterico, utilizzare un paio di pinze per posizionare il campione di tessuto su una superficie di taglio e immergerlo parzialmente in un tampone ghiacciato per galline henzel. Quindi, utilizzando il numero cinque di gioielli, il forcipe e il rumore, le forbici Iris sezionano accuratamente il grasso e i tessuti connettivi che circondano i vasi. Dopo aver separato l'arteria e la vena, identificare l'apertura del vaso a un'estremità della sezione e afferrare con cura la fascia che circonda il vaso con la pinza.
Quindi fai scorrere la punta delle forbici sotto la fascia rialzata per fare un taglio con le forbici parallele al vaso. Dopo l'incisione iniziale, tagliare entrambi i lati del vaso per staccare ulteriormente il grasso e i tessuti connettivi e per pulire il vaso. Posizionare i vasi sanguigni puliti in una provetta fresca di tampone leggero Krebs Henzel e conservare la provetta a quattro gradi Celsius per un massimo di 24 ore.
Quando è pronto, utilizzare un'affettatrice per tessuti per ottenere sezioni trasversali coerenti del recipiente di interesse nel numero desiderato di sezioni di due millimetri, quindi esaminare ciascuna sezione con un ingrandimento di 12,5 x per assicurarsi che ogni campione non presenti anomalie, rami, valvole o danni superficiali acquisiti durante il processo di dissezione e pulizia. Conservare le sezioni accettabili del recipiente affettato immerse nel tampone leggero Krebs Henzel a quattro gradi Celsius per un massimo di 30 minuti. Quindi inserire delicatamente i supporti attraverso il lume di ciascun campione e utilizzare il micro posizionatore sull'innesto myo per aumentare gradualmente la tensione per montare il vaso sull'innesto mio.
Facendo attenzione a non allungare i vasi oltre una lettura di due o tre grammi. Una volta che tutte le camere sono coperte, aspirare il tampone da ciascuna camera e riempirle nuovamente con cinque millilitri di tampone fresco. Dopo che tutte le sezioni del recipiente si sono equilibrate per 1,5 ore per raggiungere una tensione di riposo stabile di un grammo a 500 microlitri di cloruro di potassio molare da 1,32 molari a una concentrazione finale di 0,12 molari alla soluzione da 5,5 millilitri, bagnando il vaso.
Non regolare manualmente la tensione, poiché la risposta massima al cloruro di potassio verrà utilizzata per normalizzare i dati del trattamento, sostituire la soluzione con un tampone leggero Krebs Henzel fresco a intervalli di 15 minuti fino a quando la tensione non è tornata al valore basale di un grammo. Una volta che la tensione è tornata al basale, aggiungere gli standard in aliquote da 25 microlitri a ciascuna camera secondo il protocollo sperimentale. Quando è stato aggiunto l'ultimo standard, avviare un timer di nove minuti.
Al termine dell'incubazione, rimuovere il tampone contenente il trattamento dalle camere e aggiungere cinque millilitri di tampone fresco in ciascuna camera. Quindi avvia un timer di 2,5 minuti dopo il completamento, ripeti questo risciacquo di 2,5 minuti. Una seconda volta al termine del secondo risciacquo, aspirare le camere.
Quindi, dopo aver aggiunto ancora una volta un nuovo buffer, avvia un timer di un minuto per il conto alla rovescia fino all'inizio della seconda edizione standard. Come osservato nei periodi di incubazione di nove minuti qui illustrati, ci sono aumenti incrementali nella risposta agli standard secondo cui, con l'aumentare delle concentrazioni del trattamento, l'aggiunta di cloruro di potassio alla conclusione dell'esperimento è essenziale in quanto conferma la vitalità del tessuto. Questo biotest può essere utilizzato per valutare l'attività vascolare dei composti sperimentali sui vasi sanguigni che forniscono nutrienti all'intestino tenue, nonché sui vasi sanguigni che trasportano via i nutrienti assorbiti.
Ad esempio, in questo esperimento, non è stata osservata alcuna differenza nelle risposte contrattili arteriose o venose dopo il trattamento con cinque idrossitriptamina. Al contrario, la risposta contrattile della vena mesenterica all'aumento delle concentrazioni di noradrenalina era maggiore di quella dell'arteria mesenterica. Seguendo questa procedura, il metodo potrebbe essere ulteriormente modificato per includere nel tampone agonisti o antagonisti che erano di interesse specifico per il ricercatore.
Ciò consentirebbe al ricercatore di comprendere meglio il coinvolgimento di recettori molto specifici e i meccanismi alla base delle risposte vascolari osservate durante l'esperimento mio. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come raccogliere, elaborare e isolare i vasi sanguigni. Per un mio esperimento.
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Panoramica
Questo studio si concentra sull'isolamento delle arterie e delle vene mesenteriche bovine per valutare la vasoattività di diversi composti. Utilizzando un multimioagrafo, i ricercatori possono valutare come questi composti influenzino il flusso sanguigno e l'assorbimento dei nutrienti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia vascolare
- Tossicologia
Sfondo
- L'intestino tenue è spesso esposto a tossine che possono alterare il flusso sanguigno.
- La comprensione della vasoreattività è fondamentale per valutare l'assorbimento dei nutrienti.
- I vasi sanguigni mesenterici svolgono un ruolo chiave nella fisiologia gastrointestinale.
- Lo screening sperimentale può aiutare a identificare potenziali composti terapeutici.
Scopo dello studio
- Isolare arterie e vene mesenteriche bovine per la ricerca.
- Esaminare composti per le loro proprietà vasoattive.
- Valutare l'impatto di questi composti sul flusso sanguigno.
Metodi Utilizzati
- Prelievo di campioni di tessuto mesenterico da fonti bovine.
- Pulizia e sezionamento dei vasi.
- Montaggio ed equilibrazione dei segmenti su un multimyografo.
- Esposizione dei vasi isolati a composti di interesse per la valutazione.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di arterie e vene mesenteriche.
- Identificazione di composti con effetti vasoattivi significativi.
- Dimostrazione dell'efficacia del metodo nella valutazione dei cambiamenti del flusso ematico.
- Possibili implicazioni per la comprensione della dinamica dell'assorbimento dei nutrienti.
Conclusioni
- Il saggi biologico valuta efficacemente la vasoattività dei composti.
- Questo metodo può contribuire alla ricerca sulla salute gastrointestinale.
- Ulteriori studi potrebbero esplorare le applicazioni terapeutiche dei composti identificati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo saggio biologico in vitro consente una valutazione precoce degli effetti dei composti sul tono vascolare nell'arteria e nella vena mesenterica bovina, supportando la validazione degli obiettivi terapeutici e la riduzione dei rischi meccanicistici in farmacologia gastrointestinale. Isolando la vascolarizzazione da un singolo animale e testando contemporaneamente più composti, il metodo aumenta l'affidabilità predittiva e riduce la dipendenza da modelli in vivo durante l'identificazione dei composti promettenti. L'approccio offre un valore traslazionale per la valutazione di potenziali effetti vasoattivi indesiderati o di candidati terapeutici che influenzano il flusso sanguigno intestinale e l'assorbimento dei nutrienti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche mediante la valutazione della vasoattività indotta da composti nei vasi di resistenza e di capacità della circolazione mesenterica.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale del bersaglio attraverso il profilo di agonisti/antagonisti per chiarire le risposte vascolari mediate da recettori.
- Valore strategico: Favorisce la previsione e la selezione del portafoglio identificando precocemente nel processo scoperta potenziali effetti avversi o opportunità vasocoattive.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive isolando e montando sezioni di vasi su un multimyografo per la misurazione in tempo reale della contrattilità.
- Valore operativo: Fornisce output quantitativi standardizzati e riproducibili (ad esempio, variazioni di tensione), consentendo una valutazione affidabile dei composti in diverse condizioni sperimentali.
- Valore strategico: Migliora la prontezza e la scalabilità delle analisi, permettendo di testare più composti per ogni campione di tessuto animale, aumentando la produttività del saggio e l'efficienza nell'uso delle risorse.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Fornisce una modellizzazione del sistema rilevante per le malattie utilizzando la vascolarizzazione proveniente dall'apporto afferente ed efferente dell'intestino tenue, riflettendo così la dinamica fisiologica del flusso sanguigno.
- Valore operativo: Garantisce continuità dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica mantenendo la vitalità del tessuto e condizioni sperimentali costanti.
- Valore strategico: Facilita decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio, collegando l'esposizione al composto a esiti vascolari funzionali rilevanti per la salute gastrointestinale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggi biologico si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'interazione con il bersaglio all'identificazione del composto promettente, offrendo un'analisi funzionale che collega l'attività molecolare alle risposte vascolari a livello tissutale in un contesto fisiologicamente rilevante.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi misurando le risposte vasocoattive a composti di interesse, consentendo l'eliminazione dei rischi meccanicistici dei bersagli vascolari.
- Screening: Fornisce prontezza del saggio e misurazioni quantitative della contrattilità che permettono il confronto degli effetti dei composti tra diverse concentrazioni e gruppi di trattamento.
- Analisi: Genera dati in tempo reale sulla tensione normalizzati alla risposta massimale al cloruro di potassio, consentendo il confronto standardizzato della potenza e dell'efficacia vasocoattiva.
- Ricerca Translazionale: Si collega alla continuità preclinica modellando la vascolarizzazione coinvolta nell'assorbimento intestinale dei nutrienti e nella perfusione, rilevante per i modelli di disturbi gastrointestinali.
- Riutilizzo Aziendale: Funziona come piattaforma di screening vascolare riutilizzabile, adattabile a diversi composti, specie e campagne di profilazione dei recettori.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nelle risposte vascolari attraverso una valutazione funzionale diretta del tessuto.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione e la riproducibilità mediante procedure controllate di montaggio, equilibrazione e normalizzazione sul multimyografo.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale e riduce il rischio biologico in fasi avanzate identificando precocemente gli effetti vasocoattivi, informando le decisioni di proseguimento o interruzione.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei composti aggiustata per il rischio, basata sulla tossicità vascolare o sul potenziale terapeutico in indicazioni gastrointestinali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella dissezione vascolare, nella manipolazione dei tessuti e nell'uso del miografo per una preparazione e un montaggio costanti dei vasi.
- È subordinato all'accesso a un sistema multimografo, a una perfusione del buffer con controllo della temperatura e a microposizionatori di precisione per la regolazione della tensione.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda i protocolli di sezionamento dei vasi, i tempi di equilibrazione e la somministrazione dei composti, al fine di garantire la riproducibilità tra diversi utilizzatori.
- Richiede considerazioni di adattamento quando il metodo viene applicato a diversi tipi di vasi, specie o modelli di malattia, in particolare per quanto riguarda il tono basale e l'espressione dei recettori.
- È limitato dalla durata della vitalità del vaso dopo l'isolamento, richiedendo esperimenti tempestivi entro condizioni ottimizzate di conservazione in buffer.
