Saggio di crescita a base Reporter, per l'analisi sistematica di proteine ​​degradazione

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare le variazioni nei tassi di degradazione delle proteine in modo sistematico, accoppiandole alla cinetica di crescita del lievito in coltura liquida. Ciò si ottiene coltivando per prime le cellule che esprimono una proteina reporter composta da un segnale di degradazione accoppiato a un marcatore metabolico durante la notte in fase stazionaria in un mezzo selettivo adatto. Successivamente, viene misurata la densità ottica delle cellule per determinare la cinetica di crescita delle cellule, quindi il tempo di raddoppio minimo delle cellule durante la fase logaritmica viene calcolato dalla cinetica di crescita utilizzando un programma software designato.

In definitiva, il tempo di raddoppio minimo calcolato può essere utilizzato per definire le variazioni nella cinetica di degradazione delle proteine. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il ciclamato o i saggi di degradazione a inseguimento di impulsi hanno aggiunto che la nostra tecnica è semplice da configurare. L'acquisizione e l'analisi dei dati sono semplici e il design del saggio è estremamente modulare.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della degradazione dei vasi, come ad esempio quali elementi sono necessari per il riconoscimento dei vasi ripiegati in modo errato da parte del sistema dei vasi ubiquitina. Ho avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando volevo fare uno screening per identificare le proteine che coinvolgono la rimozione dell'ubiquitina dal loro sottoinsieme. Così ho stabilito un modo semplice per confrontare più campioni per preparare le cellule per l'analisi.

Iniziare trasformando le cellule di lievito atrofiche di bue appropriate, come TRY 4, 67, con un plasmide contenente una fusione U tre Deron e un marcatore metabolico aggiuntivo per la selezione e il mantenimento del plasmide. Per la selezione e il mantenimento dei plasmidi, far crescere le cellule su piastre di agar con un mezzo sintetico definito adatto, privo di marcatori di selezione degli amminoacidi, trasferire le colonie sopravvissute in cerotti, trasferire le cellule dai cerotti in terreni liquidi e incubare per una notte a 30 gradi Celsius fino a raggiungere una fase stazionaria. Quindi, per 15 campioni o meno, diluire 50 microlitri di cellule dalla coltura notturna con 150 microlitri di terreno sintetico definito per pozzetto.

In una piastra a 96 pozzetti con fondo trasparente, utilizzare un lettore di micropiastre per determinare i valori di OD 600 dei campioni. Quindi, dopo aver calcolato il volume esatto necessario per ottenere cellule di lievito a una quantità equivalente a un OD 600 di 0,25, centrifugare le cellule per un minuto a 12.000 volte G e risospendere le cellule a temperatura ambiente in un millilitro del mezzo selettivo appropriato per ottenere un OD 600 di 0,25 e trasferire 200 microlitri del ceppo diluito in un pozzetto di una nuova piastra a 96 pozzetti quando maggiore di 15 I campioni devono essere testati. Trasferire 10 microlitri di cellule stazionarie coltivate durante la notte in un pozzetto di una nuova piastra da 96 pozzetti contenente 190 microlitri del terreno selettivo appropriato per misurare la cinetica di crescita delle cellule di lievito trasformate in condizioni selettive.

Successivamente, impostare un lettore di micropiastre multimodale su una temperatura di incubazione di 30 gradi Celsius OD 600, intervalli di misurazione di 15 minuti e cicli di agitazione orbitale e lineare di un minuto ogni sette minuti. Quindi incubare le cellule a 30 gradi Celsius nel lettore di micropiastre per 12-24 ore. Quando le cellule hanno raggiunto la fase stazionaria, esportare i dati grezzi in un foglio di calcolo per determinare la cinetica di crescita del lievito utilizzando MDT Calc.

Assicurati che il file del foglio di calcolo contenente i dati di crescita sia salvato e chiuso. Quindi aprire il programma applicativo MDT Calc nel percorso del file. Fare clic sul rettangolo per individuare il file del foglio di calcolo sotto il nome del foglio.

Inserisci il nome del foglio di calcolo in cui si trovano i dati grezzi nella posizione iniziale. Immettere la coordinata del tempo del foglio di calcolo, zero del primo campione nella colonna del tempo. Immettere la lettera che definisce la posizione della colonna del punto temporale in secondi sotto colonna vuota, immettere la lettera che definisce la posizione della colonna vuota.

Ad esempio, il pozzetto A della piastra a 96 pozzetti. Prossimo. In Valore OD scegliere il valore OD 600 trasformato minimo necessario per l'avvio del calcolo MDT. Di solito da 0,15 a 0,25 per garantire che l'MDT venga calcolato solo per i campioni che raggiungono il valore D 600 definito o superiore.

Una volta inserito l'ultimo valore, fai clic sul pulsante Calcola e verifica che la barra di avanzamento a destra diventi gradualmente verde. Infine, esporta i due set di dati che appaiono automaticamente sullo schermo al completamento del calcolo MDT in un nuovo foglio di calcolo. Verificare che i dati includano il valore MDT per ogni pozzo che supera il test del valore OD minimo e l'ora di inizio dell'intervallo a partire dal quale è stato calcolato l'MDT in questo esperimento rappresentativo.

Le differenze relative nella cinetica di degradazione delle proteine tra il wild type e i vari ceppi mutanti sono state confrontate inizialmente con cellule wild type U, BBC six, delta, UBC seven delta o DOA: 10 delta che esprimono D one VMAU tre sono state coltivate su un terreno completo sintetico definito. Quindi, per misurare le branchie, le cellule sono state lavate e incubate in terreni sintetici definiti. Meno uracile curve di crescita simili e MDT calcolato sono stati osservati per tutti i ceppi cresciuti in terreno completo sintetico definito, escludendo la possibilità che la delezione di uno qualsiasi dei geni esaminati influenzi la crescita cellulare.

Al contrario, l'incubazione in terreni sintetici definiti senza uracile ha portato a una scarsa crescita di cellule di tipo selvatico, mentre solo un difetto di crescita minore è stato osservato nei ceppi mutanti. UBC sette è assolutamente necessario per la degradazione DEG uno VMAU tre che consente una valutazione accurata anche degli effetti parziali di vari mutanti E due. Di conseguenza, si osserva una cinetica di crescita rapida nelle cellule che esprimono UBC sette con i mutanti del sito attivo, C 89 s e N 81 A.In inoltre, due mutanti che si prevede ostacolino indirettamente DEG uno VMA ETH tre degradazione V 20 5G e H 90 4K sono stati trovati anche per migliorare la crescita cellulare rispetto a UBC 7 wild type, anche se in misura minore rispetto ai mutanti attivi del sito.

Pertanto, il metodo delle branchie può essere utilizzato per misurare con precisione il contributo relativo di vari fattori di degradazione alla stabilità di un substrato reporter. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il protocollo è sensibile a piccole differenze nei tassi di degradazione delle proteine. Questo è un vantaggio, ma significa anche che bisogna fare attenzione nella progettazione e nella verifica del Deron da utilizzare Seguendo questa procedura.

Altri metodi, come la microscopia a fluorescenza ad alto rendimento, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio qual è la propensione all'aggregazione delle proteine reporter. Per questo motivo, è una buona idea includere anche un tag GFP nel reporter. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare i cambiamenti nel tasso di degradazione delle proteine in modo sistematico utilizzando un lettore di MICROPIASTRE e il nostro programma software designato.