Name: Lanalisi di neurovascolare ritocca in Entorhino-ippocampali Culture Organotipica Slice (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Impara a studiare simultaneamente neuroni e vasi sanguigni in colture di fette organotipiche entorino-ippocampali. Questo metodo analizza le modifiche neurovascolari dopo lesioni cerebrali ischemiche in vitro.

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Questo lavoro è stato sostenuto dall&#39;Università di Basilea, Dipartimento di Biomedicina, e il Fondo nazionale svizzero (31003A_141007). Markus Saxer ha fornito supporto tecnico.

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità delle Comunità europee Direttiva del Consiglio del 22 settembre 2010 (2010/63 / UE) e sono stati esaminati e autorizzati dalle autorità svizzere. 1. Impostazione culture fetta Organotipica Entorhino-ippocampali <ol><li> Preparare organotipica culture fetta entorhino-ippocampale (EHOSCs) da postnatali cuccioli giorno 4 (P4) del mouse utilizzando il metodo di incubazione statico 4,11. Qui, utilizzare C57BL6 e CB6F1 topi. <ol><li> Prendete circa 30 minuti per il mouse cucciolo per la preparazione di culture fetta, cioè, 3 ore per una cucciolata di 6 cuccioli di topo. Effettuare tutte le operazioni in condizioni sterili in un banco di lavoro a flusso laminare con strumenti chirurgici sterilizzati. </li><li> Al fine di evitare una possibile interferenza dalla posizione della sezione lungo l&#39;asse setto-temporale, utilizzare solo ippocampo fette di metà settale. Se non diversamente specificato, eseguire tutti i passaggi a RT. </li></ol></li><li> Tagliare tha testa di un cucciolo topo P4 con le forbici chirurgiche. Non è necessaria alcuna anestesia per questo passo. <ol><li> Rimuovere il cranio intorno al cervello e identificare la fessura tra la fine caudale degli emisferi cerebrali e del mesencefalo. Rimuovere con cura la parte del cervello rostrale al mesencefalo dal cranio e metterlo in mezzo preparazione ghiacciata composto da MEM supplementato con una forma stabilizzata di L-glutammina. </li></ol></li><li> Continuare la dissezione sotto uno stereomicroscopio con il cervello essere immersi nel ghiaccio medio preparazione freddo. Rimuovere restanti meningi dagli emisferi corticali. Identificare l&#39;ippocampo alla superficie caudale mediale dell&#39;emisfero e separarlo insieme alla corteccia entorinale adiacente dal resto del cervello. <ol><li> Trasferire il tessuto di un elicottero del tessuto e tagliare a fette spesse 400 micron in condizioni asettiche trasversale all&#39;asse setto-temporale dell&#39;ippocampo. </li></ol></li><li> Mettere le fette su ceInserti cultura ll (circa 6 fette per inserto) e incubare in 6 pozzetti con 1 ml per pozzetto di mezzo di incubazione (47 ml di MEM, 25 ml Eagle Medium, 25 ml di siero di cavallo, 1 ml Glutamax I, 1 ml di una soluzione sterile 10% di glucosio, pH 7,3) in atmosfera umidificata con 5% di CO 2 a 37 ° C. Modificare il supporto il giorno successivo e poi a giorni alterni fino a 1 settimana. </li></ol> 2 In Vitro ipossia e deprivazione di ossigeno e glucosio con riperfusione <ol><li> Vedere la Tabella 1 per un calendario preciso momento della procedura. EHOSCs di coltura per 5 giorni (DIV5) prima dell&#39;esposizione all&#39;ipossia o OGD. A questo punto il tempo cambiare il supporto da mezzo di incubazione contenente siero di cavallo 25% di siero medio gratuito con la seguente composizione: Neurobasal media con supplemento B27 2%, 1% e il Glutamax ulteriore 0,1% di glucosio. </li><li> Preparare il terreno OGD come dettagliato nel riferimento 7 .Le concentrazioni finali dei componenti sarà il seguente: 0.3CaCl 2 mM, 70 mM NaCl, 5,25 mM NaHCO 3, 70 mM KCl, 1,25 mM saccarosio NaH 2 PO 4, 2 MgSO mm 4, e 10 mM a pH 6.8. Aggiungere 1 ml di OGD medio in ciascun pozzetto di due piastre di coltura di tessuto 6 pozzetti. <ol><li> Profumato il mezzo OGD con N 2 per 1 ora in una camera di ipossia e poi sigillare e mantenere O / N in un incubatore a 37 ° C. </li><li> Utilizzare strisce anaerobici come indicatori di ipossia. Si consideri il mezzo per essere ossigeno libero quando il colore delle strisce cambiato dal rosa al bianco. </li><li> Per l&#39;induzione di ipossia, utilizzare mezzo privo di siero con glucosio invece di OGD media. Prima dell&#39;uso, profumato il mezzo con N 2 in una camera di ipossia come descritto sopra per OGD medie. </li></ol></li><li> Prima che le fette sono esposti a OGD, perfusione il mezzo OGD nuovo con N 2 per 30 min. Aggiungere 2 ml di 1 mg / ml di ioduro di propidio (PI) soluzione per bene (per una concentrazione finale di 2 mg / ml) per le fette per 30 min e selezionaresolo fette sani per la sperimentazione, come indicato da un basso numero di cellule positive PI. </li><li> Utilizzare il programma di esposizione OGD e riperfusione indicato nella figura 1. Privare le fette di ossigeno sia solo (ipossia) o di ossigeno e glucosio (OGD) per 15 min. <ol><li> Per l&#39;induzione di ipossia o OGD, trasferire le fette in OGD medio e mantenere per 15 minuti nella camera di ipossia. Assicurarsi che tutti i materiali che rimangono sui lati dell&#39;inserto vengono aspirati via quando le colture vengono commutati da medie a regolare OGD medio e indietro. </li><li> Dopo ipossia o OGD, sostituire il supporto OGD con terreno privo di siero ossigenato e le culture sono autorizzati a recuperare per 3, 24 o 48 ore in mezzo privo di siero in incubatrice regolare a 37 ° C con il 5% di CO 2. Aggiungere PI nuovamente prima del fissaggio per la determinazione della morte cellulare. </li></ol></li></ol> 3. trattamenti farmacologici di Entorhino-ippocampali Culture Organotipica Slice <ol><li> CulturE EHOSCs per 5 giorni (DIV5) nel mezzo di incubazione prima dell&#39;esposizione ai trattamenti farmacologici. Inizia trattamenti farmacologici sia durante OGD o immediatamente dopo OGD quando le fette sono trasferiti mezzo privo di siero. </li><li> Trattamenti per la protezione da OGD. <ol><li> Aggiungere 100 mM 6-ciano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX) o 1 mM tetrodotossina (TTX) al mezzo di coltura durante l&#39;induzione OGD (per 15 minuti) o subito dopo induzione OGD per 30 min. Poi, incubare in normossia mezzo privo di siero per 48 ore prima della fissazione. </li></ol></li><li> Trattamenti per l&#39;induzione della morte eccitotossica. <ol><li> Dopo 5 giorni in culture interruttore medio di incubazione di siero media liberi contenente 100 mM (RS) -α-amino-3-idrossi-5-metil-4-isoxazolepropionic acido (AMPA) per 30 min. </li><li> Rimuovere il terreno di coltura contenente AMPA per aspirazione (fare attenzione a rimuovere ogni residuo di supporto su inserti), quindi trasferire le fette di piatti freschi con il normale mezzo privo di siero eli conserva per 48 ore fino fissazione. </li></ol></li></ol> 4. Fissazione e Immunostaining di Entorhino-ippocampali Culture Organotipica Slice <ol><li> Propidio ioduro (PI) colorazione. <ol><li> Aggiungere PI per 30 min al mezzo di coltura di fette residenti ad una concentrazione di 2 mg / ml. Visualizza colture vive con un microscopio invertito dotato di ottica di fluorescenza e selezionare fette per ulteriori trattamenti. Per PI colorazione in combinazione con immunoistochimica, aggiungere la soluzione PI 30 minuti prima della fissazione delle culture. </li></ol></li><li> Fissazione delle fette. <ol><li> Rimuovere il terreno di coltura da 6 pozzetti e aggiungere 3 ml di preparati al momento 4% paraformaldeide (PFA) in ciascun pozzetto. Quindi, posizionare la piastra 6-bene in frigorifero e fissare O / N a 4 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione PFA il giorno seguente e lavare le fette di 3-4 volte con tampone fosfato (PBS). </li></ol></li><li> La rimozione delle fette dalla I coltura cellularensert e la procedura di blocco per immunoistochimica di sezioni free-floating. <ol><li> Staccare con cautela e rimuovere le fette dagli inserti cultura utilizzando un pennello arte del formato 0 o più piccolo. Trasferire ogni singola fetta in un pozzetto di una piastra ben 96 riempita con tampone di bloccaggio (PBS con siero normale di capra 3% (NGS) e il 2% Triton-X100). Mantenere le fette nel buffer di blocco per 2 ore a temperatura ambiente sotto costante agitazione da un agitatore orbitale. </li></ol></li><li> Immunostaining delle culture fetta <ol><li> Per l&#39;etichettatura dei vasi sanguigni utilizzano policlonale anti-laminina a una diluizione di 1: 200 in PBS contenente 1% NGS e 0.5% Triton-X100. </li><li> Per neuroni etichettatura utilizzano anti-proteina associata ai microtubuli 2 (MAP2) alla diluizione di 1: 500 in PBS contenente 1% NGS e 0.5% Triton-X100. </li><li> Incubare le fette con anticorpi primari per 48 ore a 4 ° C con costante agitazione. Dopo il periodo di incubazione, lavarli in PBS con 0,5% Triton-X100 per 3-4 volte. </li&gt; <li> Diluire anticorpi secondari 1: 500 in PBS contenente 1% NGS e 0.5% Triton-X100. Incubare le fette per 2 ore a temperatura ambiente al buio con gli anticorpi secondari coniugati Alexa fluoroforo. Utilizzare l&#39;appropriato di capra anti-coniglio o anticorpo secondario di capra anti-topo coniugato con Alexa 350 o 488. </li><li> Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario e lavare le fette per tre volte con soluzione salina tamponata con Tris (TBS); montarli su vetrini e applicare il coprioggetto le diapositive con Mowiol. </li></ol></li><li> Microscopia delle fette colorate </li><li> Vedi le fette macchiati sia su un microscopio standard attrezzature epifluorescenza o con un microscopio confocale. Prendete le immagini con una fotocamera adeguata. Per alcune immagini, invertire il contrasto fluorescenza al fine di produrre navi scuro macchiate su uno sfondo luminoso (figure 5 e 6). </li></ol> 5 Determinazione della densità dei vasi regionale nei Culture <ol><li> Quantificare il VesseDensità l basata su incroci nave come descritto in riferimento 8. </li><li> Utilizzare fette colorate per la laminina per queste misurazioni. Sovrapporre le immagini registrate di ingrandimento 10X con una griglia 6 x 6, dove ogni griglia è pari a 100 x 100 micron per metro quadrato, campo totale di 0,25 mm 2. </li><li> Overlay tre di queste reti nella regione CA1, CA3, DG, e CE (Figura 2). Contare le navi che attraversano le linee della griglia. </li><li> Per ottenere risultati con una buona rilevanza statistica, effettuare le misure in almeno 3 esperimenti indipendenti, ognuno compresi i dati da 3 cuccioli di topo con 3 fette per il mouse cucciolo. </li><li> Determinare il valore medio di attraversamenti delle navi dalle griglie per ogni regione e di effettuare un&#39;analisi statistica mediante ANOVA con correzione di Bonferroni come post hoc di prova (p &lt;0.05 definito come significativo) utilizzando appropriati software di statistiche. </li></ol>

<ol><li>Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+of+cerebral+ischemia+and+the+quest+for+neuroprotection%3A+navigating+past+failure+to+future+success%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success.</a> J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).</li>
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<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
</ol>

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità delle Comunità europee Direttiva del Consiglio del 24 novembre 1986 (86/609 / CEE) e sono stati esaminati e autorizzati dalle autorità svizzere. Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Con i metodi qui presentati, ippocampo culture fetta organotipica può essere utilizzato come uno strumento versatile per studiare i cambiamenti plastici in tessuto neurale dopo l&#39;infortunio. Mentre culture fetta organotipica sono stati utilizzati in passato per studiare le reazioni neuronali dopo ischemia 6, 7, il nuovo aspetto dello studio simultaneo di cambiamenti vascolari aumenta notevolmente le potenziali applicazioni di questo metodo. L&#39;induzione di OGD o solo ipossia può essere applicato con me...

Il sistema nervoso centrale è particolarmente sensibile ad una perdita o riduzione di ossigeno e glucosio da parte del sistema vascolare. Anche un piuttosto breve interruzione della fornitura di sangue al cervello può indurre una perdita permanente della funzione delle aree cerebrali interessate conducono alle tipiche sindromi ictus. Oltre alla perdita neuronale nelle aree colpite primari, di solito si aggiunge la perdita neuronale ritardata attraverso danni secondari. Purtroppo fino ad oggi, nessun trattamento neuroprotettivo per la riduzione della morte neuronale secondaria era disponibile 1. Le attività di ricerca per lo studio dei meccanismi di danno secondario si basano su l&#39;uso di modelli animali di ischemia cerebrale come mezzo occlusione dell&#39;arteria cerebrale e varie tecniche di occlusione trombotica (per una recente rassegna vedi punto 2). In parallelo, anche a causa di limitazioni e problemi etici con l&#39;uso di modelli animali, la cultura fetta organotipica di vari tessuti del sistema nervoso centrale sono stati utilizzati che permettono la study delle reazioni neuronali a vari tipi di lesioni 3-5. Per studiare la reazione neuronale in condizioni che mimano lesione cerebrale ischemico, è stato sviluppato il sistema di modello di deprivazione di ossigeno glucosio (OGD). In questo modello, culture fetta sono temporaneamente esposti a un mezzo che manca di glucosio ed è stata equilibrata con gas azoto in assenza di ossigeno. Con tale trattamento, è possibile indurre danno neuronale e la perdita che è piuttosto simile a quella osservata dopo danno ischemico in vivo 6, 7. Nell&#39;ippocampo, tale trattamento induce la perdita neuronale specificamente nel CA1, ma non nella zona CA3 e giro dentato dell&#39;ippocampo. Al contrario, lo studio delle reazioni vascolari in culture fetta finora non è stato ampiamente intrapresa. Una ragione ovvia è la mancanza di circolazione e vaso sanguigno perfusione nel modello di cultura fetta. Tuttavia, abbiamo dimostrato in precedenza che è possibile mantenere bvasi Lood in CNS fetta culture per diversi giorni 8, 9. L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di monitorare non solo il destino dei neuroni dopo OGD ma estendere lo studio al destino e il rimodellamento del sistema vascolare, che è una parte importante della risposta lesioni. Fino ad ora tali studi hanno richiesto il ricorso alla sperimentazione animale (De Jong et al, 1999;. Cavaglia et al, 2001.). Nel protocollo qui presentato, ci sarà dettaglio come tali studi può essere fatto in organotipica culture fetta entorhino-ippocampale sfidato sia con ipossia o da lesioni eccitotossici seguita da analisi di entrambe le reazioni di sopravvivenza e vascolari neuronali. Questo protocollo si basa su uno studio precedentemente pubblicato sull&#39;argomento 10 e può essere utile per qualsiasi laboratorio interessato interazioni neurovascolari nel SNC.

<table><tbody><tr><td>Terreno essenziale minimo MEM</td><td>Gibco</td><td>11012-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>forma stabilizzata di L-glutammina</td></tr><tr><td>Inserti per colture cellulari</td><td>Millicell Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Terreno basale Eagle&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>41010-026</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Terreno neurobasale</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Integratore B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Strisce anaerobiche</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59886</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di ioduro di propidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>AMPA</td><td>Re D systems</td><td>0169-10</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>R& D sistemi</td><td>0190/10</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>R& D systems</td><td>1078/1</td><td></td></tr><tr><td>policlonale anti-laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anti-MAP2</td><td>Abcam</td><td>ab11267</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-mouse 350</td><td>Sonde molecolari</td><td>A11045</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-mouse 488</td><td>Sonde molecolari</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-coniglio 350</td><td>Sonde molecolari</td><td>A11046</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-coniglio 488</td><td>Sonde molecolari</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Software di statistica</td><td>Software GraphPad</td><td>GraphPad Prism</td><td></td></tr><tr><td>Tritatessuti McIlwain</td><td>Ted Pella</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>Camera per ipossia</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;analisi di neurovascolare ritocca in entorhino-ippocampali culture organotipica slice

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Lesione cerebrale ischemica è tra le condizioni più comuni e devastanti compromettenti corretto funzionamento del cervello e porta spesso a persistenti deficit funzionali nei pazienti affetti. Nonostante gli sforzi di ricerca intensiva, non esiste ancora una opzione di trattamento efficace disponibile che riduce il danno neuronale e protegge i neuroni nelle aree ischemiche dalla morte secondario ritardo. La ricerca in questo settore in genere comporta l&#39;uso di modelli animali elaborati e problematici. Culture fetta organotipica Entorhino-ippocampale sfidati con deprivazione di ossigeno e glucosio (OGD) sono stabilite in modelli in vitro che imitano l&#39;ischemia cerebrale. L&#39;aspetto innovativo di questo studio è che i cambiamenti dei vasi sanguigni cerebrali sono studiati in aggiunta ai cambiamenti neuronali e la reazione sia del compartimento neuronale e il compartimento vascolare possono essere confrontati e correlati. I metodi presentati in questo protocollo ampliare notevolmente le potenziali applicazioni della oganotypic approccio cultura fetta. L&#39;induzione di OGD o solo ipossia può essere applicato con mezzi relativamente semplici in culture fetta organotipiche e porta a danni affidabile e riproducibile nel tessuto neurale. Ciò è in netto contrasto con i complicati e problematici esperimenti sugli animali che inducono ictus e ischemia in vivo. Ampliando l&#39;analisi per comprendere lo studio della reazione del sistema vascolare potrebbe fornire nuovi modi su come conservare e ripristinare le funzioni cerebrali. L&#39;approccio della cultura fetta presentato qui potrebbe trasformarsi in uno strumento interessante e importante per lo studio del danno cerebrale ischemico e potrebbe essere utile per testare potenziali misure terapeutiche volte a neuroprotezione.

La privazione dell'ossigeno glucosio e ipossia induce la morte neuronale e la riduzione dei vasi sanguigni in particolare nella regione ippocampale CA1. OGD o ossigeno-privazione solo per 15 min indotto una forte induzione di morte cellulare come visto da propidio ioduro colorazione specificamente nell'area CA1 dell'ippocampo (Figura 3) analogo a quello descritto in precedenza 7. Con i marcatori di visualizzare la rete di vasi sanguigni, si è constatato che la densità dei vasi s...

Un protocollo per culture fetta organotipica entorhino-ippocampale, che permette di riprodurre molti aspetti della lesione cerebrale ischemico, è presentato. Studiando cambiamenti del neurovasculature in aggiunta ai cambiamenti nei neuroni, questo protocollo è uno strumento versatile per studiare i cambiamenti plastici in tessuto neurale dopo l&#39;infortunio.

L&#39;analisi di neurovascolare ritocca in Entorhino-ippocampali Culture Organotipica Slice

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare simultaneamente i cambiamenti dei neuroni e dei vasi sanguigni in un modello di coltura tissutale di lesione cerebrale ischemica. Ciò si ottiene impostando prima le colture di fette di rinoceronte ippocampale. Il secondo passo consiste nell'imitare la lesione cerebrale ischemica esponendo le colture a condizioni ipossiche.Il passo finale consiste nell'analizzare e correlare la sopravvivenza neuronale e i cambiamenti vascolari. In definitiva, viene utilizzato un approccio in vitro basato su colture organiche di fette di ippocampo per mostrare le complesse interazioni tra neuroni e sistema vascolare in condizioni ischemiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che dopo una sfida ipossica, la sopravvivenza neuronale e i cambiamenti dei vasi sanguigni possono essere studiati simultaneamente in un sistema modello di coltura a fette.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neuroischemia, come rivelare le complesse interazioni tra neuroni e vascolarizzazione e le condizioni ischemiche. Per iniziare, preparare, entrare in colture di fette organotipiche ippocampali di rinoceronte dal giorno postnatale forma pop di topo. Dopo aver rimosso il cranio, identificare la fessura tra l'estremità cordale degli emisferi cerebrali e il mesencefalo.Rimuovere con cautela le parti del cervello rostrali al mesencefalo e metterlo in un terreno di preparazione ghiacciato costituito da MEM integrato. Continuare la dissezione sotto uno stereomicroscopio, mantenendo il cervello immerso nel terreno di preparazione ghiacciato. Rimuovere le meningi rimanenti dagli emisferi corticali.Successivamente, identificare l'ippocampo sulla superficie cordale mediale dell'emisfero e separarlo insieme all'adiacente corteccia RH dal resto del cervello. Trasferire il tessuto in un tritatessuti e tagliare fette spesse 400 micron trasversalmente all'asse temporale settale dell'ippocampo. Posizionare le fette sugli inserti di coltura cellulare e incubarle in piastre a sei pozzetti con un millilitro di terreno di incubazione in un'atmosfera umidificata.Cambiare il terreno il giorno successivo e poi a giorni alterni fino a una settimana Successivamente, preparare il terreno OGD. Aggiungere un millilitro di terreno OGD a ciascun pozzetto di due sei. Le piastre di coltura tissutale perfondono il terreno OGG con azoto per un'ora in una camera di ipossia e prima di sigillare e conservare per una notte In un incubatore a 37 gradi Celsius, utilizzare strisce anaerobiche come indicatori ipossici.Considera il mezzo privo di ossigeno quando il colore delle strisce cambia dal rosa al bianco. Quando sono pronte, selezionare le cellule sane mediante ioduro di propidio o colorazione PI. Aggiungere pi greco per 30 minuti al terreno di coltura a una concentrazione di due microgrammi per millilitro.Osserva le colture dal vivo con un microscopio invertito dotato solo di ottica a fluorescenza. Le sezioni con poche celle etichettate, come mostrato qui, dovrebbero essere selezionate per ulteriori studi Sezioni con molte celle etichettate, come mostrato qui. Non deve essere utilizzato per l'induzione di OGD.Trasferire le fette nel terreno OGD e conservarle per 15 minuti nella camera di ipossia, assicurarsi che tutti i liquidi che rimangono sui lati dell'inserto vengano aspirati via dalle colture di interruttore. Dal terreno normale al terreno OGD e viceversa dopo l'OGD, sostituire il terreno OGD con un terreno ossigenato privo di siero e lasciare che le colture si riprendano per 3, 24 o 48 ore. Nel terreno libero dal siero, aggiungere nuovamente pi greco prima della fissazione per determinare la morte cellulare.Se lo studio richiede trattamenti farmacologici, iniziarli durante l'OGD o immediatamente dopo, quando le fette vengono trasferite nel siero libero. Terreno per la colorazione PI. In combinazione con l'immunoistochimica, aggiungere la soluzione PI 30 minuti prima della fissazione delle colture.Dopo aver fissato le cellule durante la notte, rimuovere la soluzione di PFA e lavare le fette tre o quattro volte. Con la PBS, iniziare la procedura di blocco staccando con cura le fette dagli inserti di coltura e trasferendole in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti riempita con tampone di blocco. Conservare le fette nel tampone di blocco per due ore a temperatura ambiente sotto costante agitazione da parte di un agitatore orbitale.Dopo aver aggiunto gli anticorpi primari di scelta, incubare per 48 ore a quattro gradi Celsius con agitazione costante dopo il periodo di incubazione. Lavarli in PBS con Triton X 103 allo 0,5% a quattro volte. Successivamente, seguire le procedure standard in tutto l'anticorpo secondario prima di montare le sezioni coloranti su vetrini con vetrini protettivi.Osservate le fette colorate su un microscopio standard con apparecchiature per epifluorescenza o con un microscopio confocale. Per alcune immagini, invertire il contrasto di fluorescenza in modo da ottenere vasi colorati di scuro su uno sfondo luminoso utilizzando fette colorate per la laminina. Immagini registrate sovrapposte di ingrandimento 10 x con una sovrapposizione di una griglia sei per sei tre di queste griglie nella regione ca uno, CA tre DG e DC.E conta le navi che attraversano le linee della rete per ottenere risultati con una buona rilevanza statistica. Prendi le misure da almeno tre esperimenti indipendenti, ciascuno dei quali include i dati di tre sbuffi di topo con tre fette per cucciolo di topo. Il confronto delle colture di controllo con quelle trattate rivela che l'ipossia induce la morte neuronale e la perdita dei vasi sanguigni nella regione circa uno dell'ippocampo.In questi esempi, la colorazione PI è mostrata in rosso e fusa con la colorazione con laminina in verde a tre ore dopo il trattamento con ipossia, non è visibile alcuna colorazione PI e non sono evidenti alterazioni vascolari. Dopo 24 ore emerge la colorazione PI ed è evidente anche la perdita dei vasi sanguigni. Sia la colorazione PI che la perdita dei vasi sanguigni diventano più evidenti dopo 48 ore.L'OGD da solo induce sia la perdita neuronale che la perdita di vasi sanguigni. In ca, un'applicazione di TTX o CN QX ha prevenuto sia la perdita neuronale come si è visto con la colorazione PI che la perdita dei vasi sanguigni rivelata dal trattamento di colorazione con laminina con 100 micromolari A MPA per 30 minuti ha indotto una perdita neuronale diffusa nella maggior parte delle aree dell'ippocampo, ma la perdita di vasi sanguigni è rimasta limitata all'area CA uno. La quantificazione dei vasi sanguigni conferma la perdita selettiva nell'area del CA uno.A seguito di questa procedura, possono essere eseguiti trattamenti farmacologici o modificazioni genetiche per identificare agenti neuroprotettivi efficaci e per comprendere meglio i meccanismi del rimodellamento vascolare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare colture simili all'ippocampo intermedio e di indurre l'OGD seguita dall'analisi sia della sopravvivenza neuronale che dei cambiamenti vascolari.

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