Metodi per cellulari-attached Misure di capacità in mouse surrenale cromaffini cellulare

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare la singola vescicola, la citosi e l'endocitosi. Ciò si ottiene ottenendo prima una digestione pulita e completa del tessuto della ghiandola surrenale di topo. Il secondo passo consiste nel dissociare e placcare le cellule dalle ghiandole surrenali.

Successivamente, le celle di cromina vengono identificate e bloccate per ottenere registrazioni della capacità attaccate alla cella. Infine, si possono osservare vescicola singola, citosi ed endocitosi. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le registrazioni di singoli canali ionici, è che siamo in grado di rilevare l'esocitosi e l'endocitosi di singole vescicole.

La dimostrazione visiva di questo metodo è utile in quanto ottenere un sigillo giga è difficile da imparare. Inoltre, può essere difficile identificare le cellule tra i tipi di cellule miste che si trovano all'interno della piastra. Per prepararti all'intervento chirurgico, inizia con l'autoclave di un paio di dissezioni grandi e piccole, forbici e due paia di pinze.

Quindi posizionare la vaschetta di dissezione su un secchiello per il ghiaccio. Inizia anche a far bollire la soluzione enzimatica con il 5% di anidride carbonica e il 95% di ossigeno. La soluzione è rosa brillante prima della gorgogliamento. Prossimo.

Dopo l'eutanasia e la decapitazione di un topo appena nato di tre giorni, utilizza il set di forbici più piccolo per tagliare la parte posteriore del cucciolo seguendo la colonna vertebrale dalla regione cervicale a quella cordale. Assicurati di tagliare superficialmente sotto la pelle per evitare di perforare la cavità del corpo. Quindi, staccare la pelle dalla colonna vertebrale in modo che la muscolatura sia esposta e ci sia una visione chiara della colonna vertebrale.

Ora fai un taglio in sezione trans sul midollo spinale cervicale e poi fai due tagli paralleli lungo i lati della colonna vertebrale con un paio di pinze che tengono il corpo principale dell'animale. Usa l'altro paio di pinze per afferrare la colonna vertebrale e staccare la colonna vertebrale fino a quando i reni non sono esposti. Dopo aver individuato le ghiandole surrenali sopra i reni, usa una pinza per rimuoverle.

Quindi posizionare con cura le ghiandole surrenali in un tubo conico riempito con soluzione di blocco. Usa un secondo paio di pinze per rimuovere le ghiandole surrenali. Se si attaccano al primo paio di pinze, posizionare il tubo conico sul ghiaccio.

I premistoppa possono essere mantenuti in soluzione di blocco per un massimo di due ore. A questo punto, controllare la soluzione enzimatica per assicurarsi che la soluzione equilibrata sia passata da un colore rosa brillante a un colore arancione rosato. Quindi, aggiungere la pape alla soluzione enzimatica appena bollita a una concentrazione finale di 20-25 unità per millilitro.

Quindi aggiungere la soluzione di enzima propano a un nuovo tubo conico e utilizzare una pinza per trasferire le ghiandole surrenali nel tubo enzimatico propano. Incubare le ghiandole per 40-60 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi aggiungere il 75% di soluzione di inattivazione in ciascuna provetta e incubare a 37 gradi Celsius per altri 10 minuti.

Dopo 10 minuti, trasferire delicatamente le ghiandole in una provetta appena etichettata e lavare le ghiandole tre volte con terreni di coltura. Dopo il lavaggio, posizionare le ghiandole in 200 microlitri di terreno di coltura, quindi titolare delicatamente le ghiandole su e giù attraverso la punta di una pipetta da 200 microlitri. Durante la titolazione, mantenere le ghiandole sul fondo della provetta con la forza verso il basso dalla punta della pipetta da 200 microlitri e impegnare il tessuto delicatamente e lentamente Assicurarsi di utilizzare movimenti lenti e continui, non pipettando mai rapidamente o bruscamente dopo la titolazione, aggiungere altri 250 microlitri di terreno di coltura per portare il volume totale del terreno di coltura fino a 450 microlitri.

Al secondo posto, sette vetrini coprioggetto pre-rivestiti PDL da 12 millimetri in una piastra per piastre di coltura da 60 x 50 millimetri. Quindi impiattare 60 microlitri della cella contenente la soluzione su ciascuno dei sette vetrini coprioggetto. Una volta impiattato, posizionare il piatto nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente cinque millilitri di terreno di coltura preriscaldato al piatto di coltura, quindi incubare per 24 ore prima di eseguire le registrazioni delle cellule. Dopo il luogo di incubazione, il vetrino coprioggetto da 12 millimetri contiene le cellule surrenaliche nella soluzione extracellulare. Poiché sono state utilizzate le ghiandole surrenali intere, il passo successivo è quello di differenziare tra le cellule della cromina e le cellule corticali.

In coltura, le cellule della cromina sono tipicamente molto luminose con una colorazione beige brunastra e una forma circolare quasi perfetta. Al contrario, le cellule corticali sono più piccole e più deboli delle cellule CHRO. Dopo aver estratto le pipette per cerotti come descritto nel protocollo di testo, immergere la punta della pipetta nella cera fusa per ridurre la capacità del vetro.

Quindi lucidare a fuoco la punta per soffiare via questa cera dall'interno della punta della pipetta. Quindi, costruire la pipetta con la soluzione di pipetta patch in modo che la sua resistenza sia di circa due mega ohm. Collegare la pipetta patch al suo manipolatore e portarla a una distanza massima di diversi micron dalla cellula.

Continuare ad avanzare la pipetta alla ricerca di eventuali lievi deformazioni cellulari. Una volta individuata la deformazione, applicare un'aspirazione delicata fino a ottenere una tenuta giga om. Ottenendo una configurazione collegata a celle.

Una volta rivelato un sigillo giga om, effettuare registrazioni collegate alla cella attraverso l'uso di un amplificatore EPC seven plus patch clamp e di un amplificatore lock-in analogico bifase come descritto nel protocollo di testo, impostare la fase dell'amplificatore lock-in, in modo tale che la capacità transitoria cambi prodotta da un'aspirazione delicata. Gli impulsi appaiono solo nella capacità del cerotto, o Im trace senza proiezione nel cerotto, conduttanza o ritraccia il processo di patching funge da stimolazione meccanica. Poiché la corrente di azione può essere tipicamente registrata dalla maggior parte delle celle, identificare le variazioni di capacità tipiche con il passo verso il basso marcato.

Il passaggio finale consiste nel salvare i dati per analisi future. Di seguito è illustrata una tipica registrazione della capacità collegata a celle con più passaggi verso il basso. Ogni passo verso il basso è associato a una singola endocitosi iCal.

Una volta padroneggiata, la coltura cellulare può essere completata entro due o tre ore e le registrazioni possono essere eseguite entro i quattro giorni successivi al suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della trasmissione sinaptica per esplorare il riciclaggio delle vescicole sinaptiche nelle cellule neuroendocrine della cromomina.