Name: Metodi per cellulari-attached Misure di capacità in mouse surrenale cromaffini cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Impara a rilevare esocitosi ed endocitosi di singole vescicole in cellule cromaffini surrenali di topo mediante registrazioni di capacità in configurazione cell-attached. Questo metodo elettrofisiologico avanzato permette di studiare la dinamica delle vescicole sinaptiche in tempo reale.

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Questo lavoro è supportato da un premio della National Science Foundation (1145581) a LWG.

NOTA: L&#39;intera procedura è stata condotta in conformità con le linee guida del National Institutes of Health, come approvato dalla cura e uso degli animali Comitato della University of Illinois a Chicago. 1. Soluzioni e Media Cultura Preparati <ol><li> Conservare tutte le soluzioni a -20 ° C per un massimo di sei mesi. Tenere il terreno di coltura a 4 ° C per un massimo di 3 mesi. </li><li> Preparare 100 ml di coltura mescolando 1 ml di soluzione di pen-strep e 1 ml di ITSX (Insulin-transferrina-Selenio-supplementazione) a 100 ml con DMEM. </li><li> Preparare la soluzione enzimatica mescolando 250 ml di DMEM, 2,5 ml di 100 mM CaCl 2, e 2,5 ml di 50 mM EDTA. </li><li> Preparare la soluzione inattivazione mescolando 225 ml di DMEM, 25 ml di FBS, 625 mg di albumina, e 625 mg di inibitore della tripsina. </li><li> Preparare la soluzione di un Locke di 154 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 5,0 HEPES mM, 3,6 mM NaHCO3, 5,6 mM di glucosio. Regolare il pH a 7,3 con NaOH. </li><li>Preparare una soluzione di poli-D-lisina (PDL) di 50 mg / ml. Utilizzare una concentrazione finale di 1 mg / ml a lamelle cappotto. </li><li> Preparare una soluzione extracellulare di 140 mM NaCl, KCl 5 mM, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 10 mM HEPES-NaOH, e glucosio 10 mM. Regolare il pH a 7,3 con NaOH con una osmolarità di ~ 310 nmol / kg. </li><li> Preparare una soluzione di pipetta di 50 mM NaCl, TEACL 100 mM, KCl 5 mM, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, e HEPES 10 mM. Regolare il pH a 7,3 con NaOH con una osmolarità di ~ 290 nmol / kg. </li></ol> Isolamento 2. ghiandola surrenale <ol><li> Autoclave un paio di grandi e piccole forbici dissezione e due paia di pinze. Indossare i guanti durante l&#39;intero processo e posizionare il vassoio dissezione su un secchio di ghiaccio. </li><li> Utilizzare i topi prese a Day 0-3. Euthanize animali con una pressione di CO 2 serbatoio seguita da decapitazione. </li><li> Utilizzare il set più piccolo di forbici per tagliare lungo la schiena del cucciolo che segue la colonna vertebrale da cervi<html> cal per caudale regione. Assicuratevi di tagliare superficialmente sotto la pelle e non penetrare nella cavità del corpo. </li><li> Avanti, pelle a buccia lontano da spina dorsale in modo che la muscolatura sia esposto ad avere una visione chiara della colonna vertebrale. Da qui, fare un taglio transectional al midollo spinale cervicale e poi fare due tagli paralleli lungo i lati della colonna vertebrale. </li><li> Con un paio di pinze che tengono il corpo dell&#39;animale, utilizzare l&#39;altra coppia di pinze per afferrare colonna vertebrale e buccia indietro della colonna vertebrale fino reni sono esposti. </li><li> In questo momento, visualizzare le ghiandole surrenali sulla parte superiore dei reni. Poi posizionare accuratamente i due ghiandole di ogni animale in un tubo conico riempito con soluzione di Locke. NOTA: A volte le ghiandole si attacchi alle pinze. Se questo è il caso, utilizzare delicatamente un altro paio di pinze per aiutare nella rimozione delle ghiandole delle pinze e verso la soluzione di Locke. Le ghiandole possono essere mantenuti in questa condizione per un massimo di 2 ore. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Tissue digestione <ol><li> Nel frattempo, bolla soluzione enzimatica con 5% di CO 2 + 95% O 2 per 15 minuti prima dell&#39;uso. Assicurarsi che la soluzione equilibrata si trasforma da un colore rosa brillante nel colore rosa / arancio. </li><li> Aggiungere la papaina alla soluzione enzimatica appena bolle ad una concentrazione finale di 20-25 unità / ml. Incubare ciascuna coppia di ghiandole di ciascun animale per 40-60 minuti a 37 ° C nella soluzione enzimatica con papaina. </li><li> Aggiungere 75% di soluzione di inattivazione a ciascuna provetta e incubare a 37 ° C per altri 10 min. Questo incubazione inattiva l&#39;attività enzimatica della papaina. </li><li> Dopo i 10 minuti di incubazione con la soluzione di inattivazione, trasferire delicatamente le ghiandole in una provetta nuova etichetta e poi lavare le ghiandole 3x con la cultura dei media. </li></ol> 4. cellulare Dissociazione e placcatura <ol><li> Dopo il lavaggio, posizionare i due ghiandole in 200 ml di media cultura e poi titolare delicatamente le ghiandole egiù attraverso la punta della pipetta con una pipetta 200 microlitri fino a quando non vi è più un grosso pezzo di tessuto nella soluzione. NOTA: Quando titolazione, mantenere ghiandole nella parte inferiore del tubo con una forza verso il basso dalla punta della pipetta 200 microlitri e impegnare il tessuto delicatamente e lentamente. Essere certi di utilizzare lenti, continui colpi, mai pipettaggio veloce o improvviso. </li><li> Aggiungere un ulteriore coltura 250 microlitri per portare il volume totale dei terreni di coltura fino a 450 ml. </li><li> Piatto 60 ml di questa soluzione di cellule contenenti su ciascuno dei sette coprioggetto PDL-pre-rivestite 12 mm, che sono collocati in un piatto di coltura 60 x 15 mm. </li><li> Una volta placcato, mettere il piatto in incubatrice che è impostato a 37 ° C e mantenuta con un costante flusso / fornitura di 5% di CO 2 per 30 minuti al fine di garantire un ambiente per la vitalità cellulare. Dopo l&#39;incubazione, aggiungere delicatamente 5 ml di terreni di coltura pre-riscaldato nel piatto cultura e restituire il piatto di nuovo nel incubatore per 24 ore prima di cellula-addettoregistrazioni d. NOTA: in genere, le cellule possono essere utilizzate per le registrazioni elettrofisiologiche per un massimo di 4 giorni. </li></ol> 5. cellulare Identificazione e Gigaohm Seal Formazione <ol><li> Posizionare il coprioggetto 12 millimetri nella soluzione extracellulare. Dal momento che l&#39;intero ghiandole surrenali sono utilizzati per la preparazione delle cellule, mescolare le cellule cromaffini (in genere molto luminose con un marrone / colorazione beige e una forma quasi perfetta circolare (Figura 1) in coltura con cellule corticali (più piccole e dimmer di cellule cromaffini). </li><li> Tirare le pipette di patch in quattro fasi utilizzando una programmabile P-97 estrattore. Immergere la punta della pipetta in una cera fusa, che contribuirà a ridurre la capacità del vetro e poi sparano lucidare la punta di &quot;blow-away&quot;, questa cera dall&#39;interno della punta della pipetta. NOTA: Quando riempito con una soluzione di patch pipetta, pipette di patch in genere hanno una resistenza di circa 2 MW. </li><li> Avvicinarsi alla pipetta di patch vicino alla cella all&#39;interno diversi microns. Per ottenere una configurazione cell-schiera, cercare qualsiasi lieve deformazione cellula durante l&#39;avvicinamento della pipetta di patch più vicino alla cella. Esercitare una leggera aspirazione fino ad ottenere un sigillo GΩ. </li></ol> 6. cellulari-Attached Recordings di capacità <ol><li> Una volta che un sigillo GΩ si rivela, effettuare registrazioni cellulari-attached attraverso l&#39;uso di un amplificatore EPC-7 plus patch-clamp e un amplificatore lock-in analogico a due fasi (vedi tabella allegata delle attrezzature). Applicare una sinusoide con ampiezza di 50 mV (rms) e la frequenza di 20 kHz dall&#39;amplificatore lock-in. </li><li> Impostare il filtro di uscita dell&#39;amplificatore lock-in a 1 costante di tempo msec e 24 db. Impostare la fase dell&#39;amplificatore lock-in modo tale che variazioni di capacità transitori prodotte da impulsi di aspirazione dolci appaiono solo nella traccia senza proiezione nel tracciato cerotto conduttanza (Ri) cerotto capacità (Im) (Figura 2). NOTA: Si prega di vedere i dettagli per la calibrazione del sistema in reFerence 19. </li><li> Identificare le tipiche variazioni di capacità di passi &quot;verso il basso&quot; (Figura 3). NOTA: Una registrazione solido sarà considerata come una &quot;scala&quot; tipo somiglianza con molti passi verso il basso, che indica interiorizzare singole vescicole. Il processo di patching serve da stimolo meccanico in quanto attuale azione può essere in genere registrato dalla maggior parte delle cellule. </li><li> Nome file come singole cartelle compresa la data: gg / mm / anno e ogni registrazione cell-attached come propria numerazione individuale (xx) all&#39;interno di quel file. </li></ol>

<ol><li>Rettig, J., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+presynaptic+proteins+in+Ca%2B%2B-triggered+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis.</a> Science. 298, 781-785 (2002).</li>
<li>Gong, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+phosphate+kinase+type+I+gamma+regulates+dynamics+of+large+dense-core+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol phosphate kinase type I gamma regulates dynamics of large dense-core vesicle fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5204-5209 (2005).</li>
<li>Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fusion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The fusion pore.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1641, 167-173 (2003).</li>
<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389, 509-512 (1997).</li>
<li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitance+flickers+and+pseudoflickers+of+small+granules%2C+measured+in+the+cell-attached+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Capacitance flickers and pseudoflickers of small granules, measured in the cell-attached configuration.</a> Biophys J. 75, 53-59 (1998).</li>
<li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+fusion+pore+of+small+granules+has+a+conductance+similar+to+an+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The exocytotic fusion pore of small granules has a conductance similar to an ion channel.</a> The Journal of cell biology. 129, 99-104 (1995).</li>
<li>Dernick, G., Gong, L. W., Tabares, L., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+amperometry%3A+high-resolution+measurements+of+single-vesicle+fusion+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Patch amperometry: high-resolution measurements of single-vesicle fusion and release.</a> Nat Methods. 2, 699-708 (2005).</li>
<li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li>
<li>Gong, L. W., de Toledo, G. A., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytotic+catecholamine+release+is+not+associated+with+cation+flux+through+channels+in+the+vesicle+membrane+but+Na%2B+influx+through+the+fusion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exocytotic catecholamine release is not associated with cation flux through channels in the vesicle membrane but Na+ influx through the fusion pore.</a> Nature Cell Biology. 9, 915-922 (2007).</li>
<li>Gong, L. W., Hafez, I., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+vesicles+membrane+area+is+regulated+in+tandem+with+quantal+size+in+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Secretory vesicles membrane area is regulated in tandem with quantal size in chromaffin cells.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 23, 7917-7921 (2003).</li>
<li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+does+not+provide+direct+mechanical+forces+for+vesicle+fission+during+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization does not provide direct mechanical forces for vesicle fission during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, 15793-15798 (2013).</li>
<li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+1+is+necessary+for+the+Ca2%2B+dependence+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin 1 is necessary for the Ca2+ dependence of clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 3778-3785 (2012).</li>
<li>McMahon, H. T., Boucrot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+and+physiological+functions+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 12, 517-533 (2011).</li>
<li>Murthy, V. N., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+the+presynaptic+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cell biology of the presynaptic terminal.</a> Annu Rev Neurosci. 26, 701-728 (2003).</li>
<li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51, 773-786 (2006).</li>
<li>Rosenboom, H., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exo-endocytosis+and+closing+of+the+fission+pore+during+endocytosis+in+single+pituitary+nerve+terminals+internally+perfused+with+high+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Exo-endocytosis and closing of the fission pore during endocytosis in single pituitary nerve terminals internally perfused with high calcium concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 5267-5271 (1994).</li>
<li>MacDonald, P. E., Eliasson, L., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+increases+endocytotic+vesicle+size+and+accelerates+membrane+fission+in+insulin-secreting+INS-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Calcium increases endocytotic vesicle size and accelerates membrane fission in insulin-secreting INS-1 cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 5911-5920 (2005).</li>
<li>Zhao, Y., Fang, Q., Straub, S. G., Lindau, M., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+inhibition+of+endocytosis%3A+novel+roles+for+noradrenaline+and+G+protein+G%28z%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hormonal inhibition of endocytosis: novel roles for noradrenaline and G protein G(z).</a> J Physiol. 588, 3499-3509 (2010).</li>
<li>Debus, K., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+patch+capacitance+recordings+and+of+fusion+pore+conductances+in+small+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Resolution of patch capacitance recordings and of fusion pore conductances in small vesicles.</a> Biophys J. 78, 2983-2997 (2000).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Misure di capacità cellulari iscritti richiedono diversi passaggi critici al fine di ottenere con successo le registrazioni di alta qualità: 1) cellule vitali e sane preparate dalle ghiandole surrenali; 2) il rivestimento PDL dei coprioggetto; 3) formazione sigillo gigaohm; 4) livello di rumore del sistema; e 5) correzione di fase. Per la chirurgia animali, le modifiche si può potenzialmente fare è quello di regolare l&#39;approccio chirurgico al meglio destrezza vestito e per evitare danni ...

Trasmissione sinaptica è mediata da esocitosi delle vescicole sinaptiche, contenenti neurotrasmettitori, e queste vescicole deve subire riciclaggio endocitica locale all&#39;interno del nervo terminale per mantenere la comunicazione neuronale a lungo termine. Dato il ruolo essenziale della trasmissione sinaptica nel cervello, la comprensione del macchinario molecolare che costituisce il ciclo delle vescicole sinaptiche è un fondamento essenziale verso una migliore comprensione nella comunicazione cellulare nel suo complesso. Tra sistemi modello delle cellule, la cellula cromaffini surrenale ha fornito alcune delle l&#39;intuizione più definitiva nel meccanismo molecolare alla base riciclo delle vescicole sinaptiche. Esocitosi, la fase finale di rilascio di neurotrasmettitore, è stato immensamente studiata ed esaminata attraverso l&#39;uso della cella cromaffini surrenale 1,2. In realtà, la maggior parte dei giocatori molecolari che orchestrano la formazione, il targeting, attracco, e la fusione dei granuli secretori sono stati identificati grazie alla applicazione di divtecniche di Erse nelle cellule cromaffini 1. Inoltre, fornendo l&#39;opportunità di consentire la risoluzione di una singola vescicola dei macchinari proteina coinvolta nella esocitosi, la cella cromaffini rimane un modello potente per affrontare le questioni della fusione delle vescicole 3. Misure di capacità cellulari iscritti sono stati utilizzati nella risoluzione di singolo-fusione delle vescicole durante esocitosi 3. Esocitosi di vescicole piccole come ~ 60 nm di diametro è stato dimostrato di essere rilevato da membrana cellulare misurazioni ammissione con la tecnica del patch clamp in configurazione cell allegato 4-7. Accettazione è definita come una misura di quanto facilmente un circuito o un dispositivo consentirà una corrente di flusso; è l&#39;inverso di impedenza. Pertanto, le misure di ammissione forniscono una comprensione della capacità di membrana. Questo si ottiene l&#39;incorporazione della membrana vescicolare nella membrana plasmatica; questa incorporazione rivela cambiamenti di superficiezona 8. Ogni vescicola fusione provoca un aumento graduale di capacità di membrana 9,10. Inoltre, questa misura ammettenza fornisce la conduttanza della membrana e la fusione dei pori conduttanza durante un evento esocitotico 3. Poiché questa tecnica ha fornito uno strumento unico di identificare cinetica singoli-vescicole durante esocitosi, il nostro laboratorio ha recentemente applicato questo concetto per rilevare endocitosi di singole vescicole 11,12. Il nostro interesse specifico è clatrina-mediata endocitosi (CME), che è stato considerato come una componente fondamentale di pulizia in molte cellule 13 e come via principale per endocitosi delle vescicole sinaptiche nei terminali neuronali 14,15. CME è conosciuto per essere biologicamente importante, tuttavia, la sua cinetica non restino ben capito a causa di limitazioni tecniche di monitoraggio degli eventi endocitiche singolari. Date le somiglianze nei meccanismi di esocitosi tra le cellule cromaffini e neuroni 1, è plausible che i meccanismi di fissione nelle cellule cromaffini può probabilmente applicarsi a endocitosi delle vescicole sinaptiche nei neuroni. Le misure di capacità di cella-attached sono stati utilizzati per monitorare singoli eventi endocitiche e analizzare la cinetica di fissione, che la maggior parte dei metodi non sono in grado di risolvere. Nelle nostre registrazioni cellulari-attached, un&#39;onda sinusoidale a 20 kHz si trova sopra il potenziale di detenzione, e la corrente di uscita è suddiviso in membrana conduttanza in un canale e capacità di membrana in un altro canale da una a due fasi amplificatore lock-in 16 18. Dai cambiamenti nella conduttanza di membrana e capacità, si può calcolare la cinetica di fissione poro, che probabilmente corrispondente al collo membrana tubolare che collega la vescicola internalizzazione alla membrana plasmatica prima vescicola pinch-off. Collettivamente, questa tecnica ci dà l&#39;opportunità di esaminare i meccanismi regolatori della vescicola fissione durante CME.

<table><tbody><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>15066024</td><td>Tenere lontano dai raggi UV</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Copertura in vetro</td><td>Carolina Biological</td><td>633029</td><td>12 mm</td></tr><tr><td>Penicillina Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>di Insulin-Trans-Sel-X</td><td>Life Technologies</td><td>51500056</td><td>scongelare solo su ghiaccio!</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>39S11614</td><td></td></tr><tr><td>EPC-7 plus amplificatore di patch</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BNC-2090 scheda di acquisizione dati</td><td></td> National Instruments <td></td><td></td></tr><tr><td>Software di acquisizione dati Igor</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 estrattore di pipette</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Scientific Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-110-10</td><td>Diametro esterno: 1,5 mm 
Diametro interno: 1,10 mm 
Lunghezza: 10 cm</td></tr></tbody></table>

metodi per cellulari-attached misure di capacità in mouse surrenale cromaffini cellulare

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

La trasmissione neuronale è parte integrante della comunicazione cellulare all'interno del cervello. La depolarizzazione della membrana presinaptica porta alla fusione delle vescicole, nota come esocitosi, che media la trasmissione sinaptica. Il successivo recupero delle vescicole sinaptiche è necessario per generare nuove vescicole piene di neurotrasmettitori in un processo identificato come endocitosi. Durante l'esocitosi, la fusione delle membrane delle vescicole comporterà un aumento della superficie e la successiva endocitosi comporterà una diminuzione della superficie. Qui, il nostro laboratorio dimostra un'introduzione di base alle registrazioni della capacità attaccata alle cellule di singoli eventi endocitici nella cellula cromaffini surrenalica di topo. Questo tipo di registrazione elettrica è utile per registrazioni ad alta risoluzione di esocitosi ed endocitosi a livello di singola vescicola. Sebbene questa tecnica sia in grado di rilevare sia l'esocitosi che l'endocitosi delle vescicole, l'obiettivo del nostro laboratorio è l'endocitosi delle vescicole. Inoltre, questa tecnica ci permette di analizzare la cinetica di singoli eventi endocitici. Qui vengono descritti i metodi per la dissezione del tessuto della ghiandola surrenalica di topo, la coltura cellulare cromaffina, le tecniche di base di adesione alle cellule e i successivi esempi di tracce individuali che misurano un singolo evento endocitico.

La vitalità delle cellule e la qualità di tenuta gigaohm sono critici nel determinare la qualità delle registrazioni capacità della cella collegata. Pertanto, è fondamentale per procurare un coltura cellulare efficace ed efficiente prima di registrazioni elettrofisiologiche, e le cellule vitali tipiche sono illustrate nella figura 1. Practice e il tempo sarà utile nel raggiungimento di un sigillo gigaohm con alta qualità. Se si può vedere chiaramente deformazione cella quando la pipetta di patch sta avv...

Dopo l'esocitosi, la membrana plasmatica fusa viene recuperata attraverso un processo noto come endocitosi. Questo meccanismo riforma le nuove vescicole sinaptiche per il successivo ciclo di rilascio. I singoli eventi endocitici vengono catturati e analizzati attraverso l'uso delle registrazioni della capacità attaccata alle cellule nelle cellule cromaffini surrenaliche di topo.

Metodi per cellulari-attached Misure di capacità in mouse surrenale cromaffini cellulare

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare la singola vescicola, la citosi e l'endocitosi. Ciò si ottiene ottenendo prima una digestione pulita e completa del tessuto della ghiandola surrenale di topo. Il secondo passo consiste nel dissociare e placcare le cellule dalle ghiandole surrenali.Successivamente, le celle di cromina vengono identificate e bloccate per ottenere registrazioni della capacità attaccate alla cella. Infine, si possono osservare vescicola singola, citosi ed endocitosi. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le registrazioni di singoli canali ionici, è che siamo in grado di rilevare l'esocitosi e l'endocitosi di singole vescicole.La dimostrazione visiva di questo metodo è utile in quanto ottenere un sigillo giga è difficile da imparare. Inoltre, può essere difficile identificare le cellule tra i tipi di cellule miste che si trovano all'interno della piastra. Per prepararti all'intervento chirurgico, inizia con l'autoclave di un paio di dissezioni grandi e piccole, forbici e due paia di pinze.Quindi posizionare la vaschetta di dissezione su un secchiello per il ghiaccio. Inizia anche a far bollire la soluzione enzimatica con il 5% di anidride carbonica e il 95% di ossigeno. La soluzione è rosa brillante prima della gorgogliamento. Prossimo.Dopo l'eutanasia e la decapitazione di un topo appena nato di tre giorni, utilizza il set di forbici più piccolo per tagliare la parte posteriore del cucciolo seguendo la colonna vertebrale dalla regione cervicale a quella cordale. Assicurati di tagliare superficialmente sotto la pelle per evitare di perforare la cavità del corpo. Quindi, staccare la pelle dalla colonna vertebrale in modo che la muscolatura sia esposta e ci sia una visione chiara della colonna vertebrale.Ora fai un taglio in sezione trans sul midollo spinale cervicale e poi fai due tagli paralleli lungo i lati della colonna vertebrale con un paio di pinze che tengono il corpo principale dell'animale. Usa l'altro paio di pinze per afferrare la colonna vertebrale e staccare la colonna vertebrale fino a quando i reni non sono esposti. Dopo aver individuato le ghiandole surrenali sopra i reni, usa una pinza per rimuoverle.Quindi posizionare con cura le ghiandole surrenali in un tubo conico riempito con soluzione di blocco. Usa un secondo paio di pinze per rimuovere le ghiandole surrenali. Se si attaccano al primo paio di pinze, posizionare il tubo conico sul ghiaccio.I premistoppa possono essere mantenuti in soluzione di blocco per un massimo di due ore. A questo punto, controllare la soluzione enzimatica per assicurarsi che la soluzione equilibrata sia passata da un colore rosa brillante a un colore arancione rosato. Quindi, aggiungere la pape alla soluzione enzimatica appena bollita a una concentrazione finale di 20-25 unità per millilitro.Quindi aggiungere la soluzione di enzima propano a un nuovo tubo conico e utilizzare una pinza per trasferire le ghiandole surrenali nel tubo enzimatico propano. Incubare le ghiandole per 40-60 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi aggiungere il 75% di soluzione di inattivazione in ciascuna provetta e incubare a 37 gradi Celsius per altri 10 minuti.Dopo 10 minuti, trasferire delicatamente le ghiandole in una provetta appena etichettata e lavare le ghiandole tre volte con terreni di coltura. Dopo il lavaggio, posizionare le ghiandole in 200 microlitri di terreno di coltura, quindi titolare delicatamente le ghiandole su e giù attraverso la punta di una pipetta da 200 microlitri. Durante la titolazione, mantenere le ghiandole sul fondo della provetta con la forza verso il basso dalla punta della pipetta da 200 microlitri e impegnare il tessuto delicatamente e lentamente Assicurarsi di utilizzare movimenti lenti e continui, non pipettando mai rapidamente o bruscamente dopo la titolazione, aggiungere altri 250 microlitri di terreno di coltura per portare il volume totale del terreno di coltura fino a 450 microlitri.Al secondo posto, sette vetrini coprioggetto pre-rivestiti PDL da 12 millimetri in una piastra per piastre di coltura da 60 x 50 millimetri. Quindi impiattare 60 microlitri della cella contenente la soluzione su ciascuno dei sette vetrini coprioggetto. Una volta impiattato, posizionare il piatto nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente cinque millilitri di terreno di coltura preriscaldato al piatto di coltura, quindi incubare per 24 ore prima di eseguire le registrazioni delle cellule. Dopo il luogo di incubazione, il vetrino coprioggetto da 12 millimetri contiene le cellule surrenaliche nella soluzione extracellulare. Poiché sono state utilizzate le ghiandole surrenali intere, il passo successivo è quello di differenziare tra le cellule della cromina e le cellule corticali.In coltura, le cellule della cromina sono tipicamente molto luminose con una colorazione beige brunastra e una forma circolare quasi perfetta. Al contrario, le cellule corticali sono più piccole e più deboli delle cellule CHRO. Dopo aver estratto le pipette per cerotti come descritto nel protocollo di testo, immergere la punta della pipetta nella cera fusa per ridurre la capacità del vetro.Quindi lucidare a fuoco la punta per soffiare via questa cera dall'interno della punta della pipetta. Quindi, costruire la pipetta con la soluzione di pipetta patch in modo che la sua resistenza sia di circa due mega ohm. Collegare la pipetta patch al suo manipolatore e portarla a una distanza massima di diversi micron dalla cellula.Continuare ad avanzare la pipetta alla ricerca di eventuali lievi deformazioni cellulari. Una volta individuata la deformazione, applicare un'aspirazione delicata fino a ottenere una tenuta giga om. Ottenendo una configurazione collegata a celle.Una volta rivelato un sigillo giga om, effettuare registrazioni collegate alla cella attraverso l'uso di un amplificatore EPC seven plus patch clamp e di un amplificatore lock-in analogico bifase come descritto nel protocollo di testo, impostare la fase dell'amplificatore lock-in, in modo tale che la capacità transitoria cambi prodotta da un'aspirazione delicata. Gli impulsi appaiono solo nella capacità del cerotto, o Im trace senza proiezione nel cerotto, conduttanza o ritraccia il processo di patching funge da stimolazione meccanica. Poiché la corrente di azione può essere tipicamente registrata dalla maggior parte delle celle, identificare le variazioni di capacità tipiche con il passo verso il basso marcato.Il passaggio finale consiste nel salvare i dati per analisi future. Di seguito è illustrata una tipica registrazione della capacità collegata a celle con più passaggi verso il basso. Ogni passo verso il basso è associato a una singola endocitosi iCal.Una volta padroneggiata, la coltura cellulare può essere completata entro due o tre ore e le registrazioni possono essere eseguite entro i quattro giorni successivi al suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della trasmissione sinaptica per esplorare il riciclaggio delle vescicole sinaptiche nelle cellule neuroendocrine della cromomina.

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