Imaging del calcio nei neuroni
Gli ioni calcio svolgono un ruolo fondamentale nella funzione neuronale: agiscono come segnali intracellulari che possono suscitare risposte come l'es…
L'imaging del calcio è una tecnica estremamente utile per studiare la varietà di ruoli che gli ioni calcio hanno nei neuroni funzionanti. Gli ioni calcio generano una moltitudine di segnali intracellulari che controllano le funzioni chiave, come il rilascio di neurotrasmettitori dalle vescicole sinaptiche. I metodi di imaging del calcio consentono la misurazione diretta del flusso dinamico di calcio all'interno dei neuroni e del tessuto neuronale. Questo video fornisce una panoramica di come funzionano i coloranti indicatori di calcio, come viene completato un esperimento di imaging del calcio e infine discute alcune delle applicazioni di questa tecnica.
Innanzitutto, esaminiamo i principi biochimici dei coloranti indicatori di calcio.
I coloranti indicatori di calcio sono molecole chelatrici modificate, come Fura-2, che sono composte da due componenti principali. Il primo è il sito chelatore che lega il calcio in modo selettivo. Il secondo è un sito fluorescente che emette luce a una specifica lunghezza d'onda quando illuminato da una lunghezza d'onda di eccitazione della luce ultravioletta.
Il legame del calcio al colorante altera le sue proprietà di fluorescenza, che fornisce un modo per quantificare i cambiamenti nella concentrazione di calcio, che è qui rappresentata dalla differenza di intensità fluorescente emessa da questo neurone a due diverse lunghezze d'onda di eccitazione.
La maggior parte dei coloranti indicatori di calcio vengono ulteriormente modificati per consentire loro di attraversare facilmente la membrana cellulare e vengono introdotti nella soluzione del bagno con i neuroni o iniettati nel tessuto cerebrale per studi su animali interi.
Alcuni coloranti hanno proprietà di doppia eccitazione o doppia emissione a seconda che il calcio sia legato o meno. Prendiamo, ad esempio, il colorante Fura-2, che ha una diversa lunghezza d'onda di eccitazione quando il calcio è legato rispetto a quando non lo è. Prendendo il rapporto tra l'intensità di emissione alle due lunghezze d'onda di eccitazione, è possibile fare una stima molto più precisa della concentrazione di calcio.
I coloranti a doppia eccitazione o emissione, come il Fura-2, sono chiamati indicatori di calcio ratiometrici. Esistono coloranti non riconsecimetrici che hanno singole lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione. Tuttavia, sono più suscettibili al fotosciviazione, che è l'indebolimento o la perdita di fluorescenza con un'esposizione prolungata alla luce.
Un passo fondamentale prima di utilizzare un colorante in un esperimento è calibrare le misure di fluorescenza prese dal colorante con soluzioni di concentrazioni di calcio note. Ciò consentirà agli scienziati di stimare con precisione le concentrazioni intracellulari di calcio in base alle intensità di emissione misurate durante gli esperimenti.
Ora che abbiamo imparato come funzionano gli indicatori di calcio, esploriamo come immaginare il flusso di calcio nei neuroni placcati.
Inizia preparando il colorante indicatore di calcio di scelta, come Fura-2, e mescolandolo con ulteriori soluzioni fisiologiche. Vortice la soluzione per garantire una corretta miscelazione. Una volta sufficientemente mescolato trasferire in un piatto. Ora posiziona il coperchio con i neuroni coltivati nel piatto con la soluzione colorante. Quindi, incubare i neuroni al buio per il tempo richiesto alla temperatura appropriata, che in questo caso è di 30 minuti a 37 ° C. Dopo il periodo di incubazione, trasferire il coverslip in un piatto senza il colorante.
Il prossimo passo è montare il coverslip sulla camera di imaging del microscopio. Una volta montato, collegare la linea di ingresso del sistema di perfusione e riempire lentamente la camera. Fissare la camera allo stadio del microscopio e installare le linee di perfusione in uscita, garantendo un flusso continuo in tutto il sistema di perfusione.
Ora che lo stadio del microscopio è pronto, metti a fuoco i neuroni usando la luce visibile. Testare il colorante illuminando le cellule a lunghezze d'onda di 340 e 380 nm. Ricordiamo che con Fura-2, i neuroni non attivati dovrebbero emettere più luce quando eccitati di 380 nm poiché il calcio non è legato.
Quindi, regolare le impostazioni della fotocamera per ottimizzare la gamma dinamica prima di iniziare l'esperimento. Raccogli un'immagine a ciascuna lunghezza d'onda, quindi utilizza la regione di interesse o lo strumento ROI per misurare l'intensità di fondo a ciascuna lunghezza d'onda. Immettere i valori di sfondo nel software di controllo in modo che possano essere sottratti dalle immagini successive.
Una volta completata la configurazione iniziale, scegliere i circa cinque campi di visualizzazione che devono essere ripresi per l'esperimento e salvare le coordinate nel software di controllo. Durante l'esperimento lo stadio automatizzato si sposta su un campo, raccoglie un rapporto tra l'intensità del campo a lunghezze d'onda di 340 e 380 nm e passa al campo successivo fino a quando tutti i campi non vengono raccolti.
In alcuni esperimenti, un agente farmacologico viene aggiunto al fluido di perfusione che provoca cambiamenti nei livelli di calcio intracellulare. Una soluzione ad alto contenuto di potassio, che depolarizza i neuroni, può far aumentare la concentrazione intracellulare di calcio, come mostrato in questa serie di immagini time lapse e funge da buon controllo positivo. Una volta completata la raccolta dei dati, procedere all'analisi.
Per analizzare i risultati, selezionare le regioni di interesse che includono neuroni o parti di neuroni utilizzando il software. Successivamente, utilizzare il software per misurare le informazioni sull'intensità del rapporto immagine da entrambe le lunghezze d'onda a ciascun ROI in tutte le immagini raccolte. Con queste informazioni, è possibile eseguire una valutazione quantitativa delle variazioni delle concentrazioni intracellulari di calcio nel tempo.
Ora che hai una comprensione di come si ottiene l'imaging del calcio nei neuroni, diamo un'occhiata ad alcuni dei modi in cui questo prezioso metodo viene applicato nella ricerca di oggi.
Innanzitutto, l'imaging del calcio viene utilizzato per studiare come il calcio intracellulare flussua in relazione all'attività neurale.
In questo studio, i singoli neuroni sono stati riempiti con un colorante indicatore di calcio mentre venivano registrati patch-clamp. Il controllo preciso del potenziale di membrana abilitato dalla tecnica patch-clamp fornisce informazioni sulla dinamica del flusso di calcio.
L'imaging del calcio consente ai ricercatori di studiare l'attività di rete altamente sincrona dei neuroni.
Qui, i neuroscienziati hanno usato l'imaging del calcio per valutare il segnale fluorescente di 40 neuroni. Con queste informazioni, è possibile determinare le proprietà di rete come la propagazione del segnale e le correlazioni neurali.
La dinamica del calcio può anche rivelare come i neuroni elaborano i segnali provenienti dal mondo esterno, come gli odori.
In questo esperimento, gli organi sensibili ai feromoni estratti da un naso di topo sono stati coltivati in coltura. I neuroni all'interno del tessuto sono stati incubati con Fura-2 e ripresi mentre venivano presentati con odoranti come l'urina o feromoni purificati. Manipolando l'espressione delle proteine del recettore degli odori nei neuroni olfattivi, è possibile visualizzare direttamente come una singola proteina influenza la capacità di una cellula di rispondere a odori unici.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE all'imaging del calcio nei neuroni. In questo video, abbiamo discusso le proprietà alla base della tecnica e abbiamo esaminato un esperimento tipico.
Dati i molti ruoli importanti del calcio, l'imaging del calcio rimarrà uno strumento vitale nella comprensione dei neuroni e di come interagiscono tra loro.
Grazie per l'attenzione!
L'imaging del calcio è una tecnica estremamente utile per studiare la varietà di ruoli che gli ioni calcio hanno nei neuroni funzionanti. Gli ioni calcio generano una moltitudine di segnali intracellulari che controllano le funzioni chiave, come il rilascio di neurotrasmettitori dalle vescicole sinaptiche. I metodi di imaging del calcio consentono la misurazione diretta del flusso dinamico di calcio all'interno dei neuroni e del tessuto neuronale. Questo video fornisce una panoramica di come funzionano i coloranti indicatori di calcio, come viene completato un esperimento di imaging del calcio e infine discute alcune delle applicazioni di questa tecnica.
Innanzitutto, esaminiamo i principi biochimici dei coloranti indicatori di calcio.
I coloranti indicatori di calcio sono molecole chelatrici modificate, come Fura-2, che sono composte da due componenti principali. Il primo è il sito chelatore che lega il calcio in modo selettivo. Il secondo è un sito fluorescente che emette luce a una specifica lunghezza d'onda quando illuminato da una lunghezza d'onda di eccitazione della luce ultravioletta.
Il legame del calcio al colorante altera le sue proprietà di fluorescenza, che fornisce un modo per quantificare i cambiamenti nella concentrazione di calcio, che è qui rappresentata dalla differenza di intensità fluorescente emessa da questo neurone a due diverse lunghezze d'onda di eccitazione.
La maggior parte dei coloranti indicatori di calcio vengono ulteriormente modificati per consentire loro di attraversare facilmente la membrana cellulare e vengono introdotti nella soluzione del bagno con i neuroni o iniettati nel tessuto cerebrale per studi su animali interi.
Alcuni coloranti hanno proprietà di doppia eccitazione o doppia emissione a seconda che il calcio sia legato o meno. Prendiamo, ad esempio, il colorante Fura-2, che ha una diversa lunghezza d'onda di eccitazione quando il calcio è legato rispetto a quando non lo è. Prendendo il rapporto tra l'intensità di emissione alle due lunghezze d'onda di eccitazione, è possibile fare una stima molto più precisa della concentrazione di calcio.
I coloranti a doppia eccitazione o emissione, come il Fura-2, sono chiamati indicatori di calcio ratiometrici. Esistono coloranti non riconsecimetrici che hanno singole lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione. Tuttavia, sono più suscettibili al fotosciviazione, che è l'indebolimento o la perdita di fluorescenza con un'esposizione prolungata alla luce.
Un passo fondamentale prima di utilizzare un colorante in un esperimento è calibrare le misure di fluorescenza prese dal colorante con soluzioni di concentrazioni di calcio note. Ciò consentirà agli scienziati di stimare con precisione le concentrazioni intracellulari di calcio in base alle intensità di emissione misurate durante gli esperimenti.
Ora che abbiamo imparato come funzionano gli indicatori di calcio, esploriamo come immaginare il flusso di calcio nei neuroni placcati.
Inizia preparando il colorante indicatore di calcio di scelta, come Fura-2, e mescolandolo con ulteriori soluzioni fisiologiche. Vortice la soluzione per garantire una corretta miscelazione. Una volta sufficientemente mescolato trasferire in un piatto. Ora posiziona il coperchio con i neuroni coltivati nel piatto con la soluzione colorante. Quindi, incubare i neuroni al buio per il tempo richiesto alla temperatura appropriata, che in questo caso è di 30 minuti a 37 ° C. Dopo il periodo di incubazione, trasferire il coverslip in un piatto senza il colorante.
Il prossimo passo è montare il coverslip sulla camera di imaging del microscopio. Una volta montato, collegare la linea di ingresso del sistema di perfusione e riempire lentamente la camera. Fissare la camera allo stadio del microscopio e installare le linee di perfusione in uscita, garantendo un flusso continuo in tutto il sistema di perfusione.
Ora che lo stadio del microscopio è pronto, metti a fuoco i neuroni usando la luce visibile. Testare il colorante illuminando le cellule a lunghezze d'onda di 340 e 380 nm. Ricordiamo che con Fura-2, i neuroni non attivati dovrebbero emettere più luce quando eccitati di 380 nm poiché il calcio non è legato.
Quindi, regolare le impostazioni della fotocamera per ottimizzare la gamma dinamica prima di iniziare l'esperimento. Raccogli un'immagine a ciascuna lunghezza d'onda, quindi utilizza la regione di interesse o lo strumento ROI per misurare l'intensità di fondo a ciascuna lunghezza d'onda. Immettere i valori di sfondo nel software di controllo in modo che possano essere sottratti dalle immagini successive.
Una volta completata la configurazione iniziale, scegliere i circa cinque campi di visualizzazione che devono essere ripresi per l'esperimento e salvare le coordinate nel software di controllo. Durante l'esperimento lo stadio automatizzato si sposta su un campo, raccoglie un rapporto tra l'intensità del campo a lunghezze d'onda di 340 e 380 nm e passa al campo successivo fino a quando tutti i campi non vengono raccolti.
In alcuni esperimenti, un agente farmacologico viene aggiunto al fluido di perfusione che provoca cambiamenti nei livelli di calcio intracellulare. Una soluzione ad alto contenuto di potassio, che depolarizza i neuroni, può far aumentare la concentrazione intracellulare di calcio, come mostrato in questa serie di immagini time lapse e funge da buon controllo positivo. Una volta completata la raccolta dei dati, procedere all'analisi.
Per analizzare i risultati, selezionare le regioni di interesse che includono neuroni o parti di neuroni utilizzando il software. Successivamente, utilizzare il software per misurare le informazioni sull'intensità del rapporto immagine da entrambe le lunghezze d'onda a ciascun ROI in tutte le immagini raccolte. Con queste informazioni, è possibile eseguire una valutazione quantitativa delle variazioni delle concentrazioni intracellulari di calcio nel tempo.
Ora che hai una comprensione di come si ottiene l'imaging del calcio nei neuroni, diamo un'occhiata ad alcuni dei modi in cui questo prezioso metodo viene applicato nella ricerca di oggi.
Innanzitutto, l'imaging del calcio viene utilizzato per studiare come il calcio intracellulare flussua in relazione all'attività neurale.
In questo studio, i singoli neuroni sono stati riempiti con un colorante indicatore di calcio mentre venivano registrati patch-clamp. Il controllo preciso del potenziale di membrana abilitato dalla tecnica patch-clamp fornisce informazioni sulla dinamica del flusso di calcio.
L'imaging del calcio consente ai ricercatori di studiare l'attività di rete altamente sincrona dei neuroni.
Qui, i neuroscienziati hanno usato l'imaging del calcio per valutare il segnale fluorescente di 40 neuroni. Con queste informazioni, è possibile determinare le proprietà di rete come la propagazione del segnale e le correlazioni neurali.
La dinamica del calcio può anche rivelare come i neuroni elaborano i segnali provenienti dal mondo esterno, come gli odori.
In questo esperimento, gli organi sensibili ai feromoni estratti da un naso di topo sono stati coltivati in coltura. I neuroni all'interno del tessuto sono stati incubati con Fura-2 e ripresi mentre venivano presentati con odoranti come l'urina o feromoni purificati. Manipolando l'espressione delle proteine del recettore degli odori nei neuroni olfattivi, è possibile visualizzare direttamente come una singola proteina influenza la capacità di una cellula di rispondere a odori unici.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE all'imaging del calcio nei neuroni. In questo video, abbiamo discusso le proprietà alla base della tecnica e abbiamo esaminato un esperimento tipico.
Dati i molti ruoli importanti del calcio, l'imaging del calcio rimarrà uno strumento vitale nella comprensione dei neuroni e di come interagiscono tra loro.
Grazie per l'attenzione!
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Q1: How do calcium indicator dyes work to measure neuronal calcium levels?
Calcium indicator dyes like Fura-2 are modified chelator molecules with two main components: a chelator site that selectively binds calcium ions and a fluorescent site that emits light when illuminated. When calcium binds to the dye, it alters the fluorescence properties, allowing scientists to quantify changes in calcium concentration by measuring differences in fluorescent intensity at specific wavelengths.
Q2: What is the difference between ratiometric and non-ratiometric calcium indicators?
Ratiometric calcium indicators like Fura-2 have dual excitation or emission properties that change depending on whether calcium is bound, enabling precise calcium concentration estimates by taking the ratio of emission intensities at two wavelengths. Non-ratiometric dyes with single excitation and emission wavelengths are simpler but more susceptible to photobleaching, the weakening or loss of fluorescence with prolonged light exposure.
Q3: Why is calibration important before conducting a calcium imaging experiment?
Calibration involves measuring fluorescence from solutions with known calcium concentrations, establishing a standard curve that allows scientists to accurately estimate intracellular calcium concentrations based on measured emission intensities during experiments. This critical step ensures that the fluorescent signals collected directly correlate to actual calcium levels within neurons.
Q4: What are the key steps in preparing neurons for calcium imaging?
Prepare the calcium indicator dye and mix it with physiological solutions, then incubate cultured neurons in the dye solution in the dark at appropriate temperature, typically 30 minutes at 37°C. After incubation, transfer the coverslip to a dish without dye, mount it onto the microscope imaging chamber, connect the perfusion system, and optimize camera settings before data collection begins.
Q5: How does patch clamp electrophysiology complement calcium imaging studies?
Patch clamp electrophysiology provides precise control of neuronal membrane potential, enabling researchers to correlate specific electrical states with calcium dynamics. When individual neurons are simultaneously filled with calcium indicator dye and patch-clamp recorded, scientists gain detailed insight into how membrane potential changes influence intracellular calcium flux dynamics.
Q6: What can calcium imaging reveal about neuronal network activity?
Calcium imaging enables researchers to assess fluorescent signals from multiple neurons simultaneously, allowing determination of network properties such as signal propagation and neural correlations. By imaging 40 or more neurons at once, scientists can visualize the highly synchronous network activity that occurs during coordinated neuronal communication and information processing.
Q7: How is calcium imaging used to study sensory processing in neurons?
Researchers incubate sensory tissue with calcium indicator dyes like Fura-2 and image neurons while presenting specific stimuli such as odorants or pheromones. By manipulating the expression of sensory receptor proteins and visualizing resulting calcium responses, scientists can directly determine how individual proteins influence a cell's ability to detect and respond to external signals from the environment.