Quantitative Immunofluorescence Assay misurare la variazione dei livelli di proteine ​​ad centrosomi

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare i cambiamenti relativi nel livello di una proteina nei centrosomi in varie condizioni. Ad esempio, in un punto specifico del ciclo cellulare dopo l'inibizione del proteasoma, ciò si ottiene trattando prima le cellule che crescono su vetrini coprioggetti con l'inibitore del proteasoma MG one 15 o con il solvente di controllo DMSO. Quindi aggiungendo immediatamente BRDU a entrambe le cellule e incubandole per quattro ore in un incubatore per colture cellulari.

Il secondo passo consiste nel trasferire i vetrini di copertura su una piastra a 24 pozzetti per fissare le celle. Successivamente, le cellule vengono colorate con anticorpi contro BRDU e le proteine di interesse, e quindi con anticorpi secondari corrispondenti. Il passaggio finale consiste nell'acquisire immagini di cellule BRDU positive utilizzando un microscopio a fluorescenza e un software di imaging digitale per applicare lo stesso tempo di esposizione e lunghezza dell'asse Z alle cellule di ciascun campione.

Quindi analizzando le immagini per quantificare il livello relativo di VDA C3 romale. In definitiva, la microscopia quantitativa a immunofluorescenza viene utilizzata per dimostrare che il pool centro-somico di VDA C3 aumenta di due volte quando il proteasoma viene inibito durante la fase S. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la citometria a flusso, l'immunoblotting o il microscopio quantitativo, è che questa tecnica analizza il livello romale relativo della proteina in due campioni trattati in modo diverso che vengono elaborati su due diversi vetrini. Questo metodo utilizza la normalizzazione a uno standard interno per controllare la necessità di elaborare le due popolazioni cellulari sperimentali.

Separatamente, sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla regolazione di proteine specifiche nei centrosomi. Può anche essere applicato ad altre situazioni, come altre strutture subcellulari o l'esame di specifici pool di proteine che si trovano in più siti all'interno della cellula. A dimostrare la procedura sarà Schu Majumder, un postdoc del mio laboratorio Per iniziare l'esperimento, passare due volte da 10 al quinto in modo asincrono di una cellula RPE in piatti da 35 millimetri precedentemente preparati con labbra di copertura e far crescere le cellule in due millilitri di terreno completo.

Sostituire il terreno di coltura ogni 24 ore con un terreno di preriscaldamento fresco Dopo 44 ore. Sostituire il terreno di coltura con un terreno completo contenente 0,05% di DMSO o MG 1 15 a una concentrazione finale di cinque micromolari e contemporaneamente aggiungere BRDU alle cellule a una concentrazione finale di 40 micromolari, incubare le cellule per quattro ore. Quindi, trasferire ciascun vetrino di copertura su una piastra a 24 pozzetti.

Aggiungere 500 microlitri di metanolo pre-lavorato a ciascun pozzetto e incubare la piastra a meno 20 gradi Celsius per fissare le cellule. Dopo 10 minuti, lavare immediatamente i vetrini coprioggetto tre volte con 500 microlitri di tampone di lavaggio. Incubare le cellule fissate sul coperchio, infilare 200 microlitri di tampone bloccante per 30 minuti mentre le cellule sono in incubazione.

Preparare una camera umidificata posizionando un tovagliolo di carta bagnato nella metà inferiore di una scatola vuota di puntali per pipette da 1000 microlitri. Stendere una striscia di profumo sulla superficie del rack e aggiungere sulla paraforma una goccia da 20 microlitri di anticorpo rabbit anti V DDA three e mouse anti gamma tubulina diluito in tampone bloccante. Dopo il blocco, capovolgere un vetrino coprioggetti su ciascuna gocciolina di soluzione anticorpale.

Assicurarsi che le celle siano immerse e chiudere il coperchio della scatola dei puntali. Incubare le cellule con anticorpi primari per una notte a quattro gradi Celsius nella camera umidificata. Capovolgere nuovamente i vetrini coprioggetto e rimetterli al 24.

Lavare bene i vetrini coprioggetti, quindi incubarli in una soluzione da 150 microlitri di anticorpi secondari, diluiti in tampone bloccante per un'ora a temperatura ambiente Dopo l'incubazione, lavare i vetrini coprioggetti tre volte con tampone di lavaggio. Fissare le cellule RPE colorate con 500 microlitri di metanolo raffreddato a meno 20 gradi Celsius. Dopo che le celle si sono fissate per 10 minuti, lavarle tre volte nel tampone di lavaggio.

Successivamente, incubare le cellule in 200 microlitri di due HCL normali per 30 minuti. A temperatura ambiente, neutralizzare le cellule con 300 microlitri di tris CL a pH otto di un molare e lavare le cellule tre volte. Con il tampone di lavaggio bloccare le celle con 200 microlitri di tampone bloccante per 30 minuti a temperatura ambiente.

Dopo il blocco, incubare le cellule con l'anticorpo anti BRDU di ratto e il tampone bloccante per 45 minuti a 37 gradi Celsius nella camera umidificata. Restituire i vetrini di copertura al 24. Lavare bene le cellule.

Successivamente, incubarli con anticorpi secondari diluiti in 150 microlitri di tampone bloccante. In una pirofila a 24 pozzetti per un'ora a temperatura ambiente. Quindi lavare i vetrini coprioggetti tre volte con un punto XPBS, una gocciolina da sei microlitri di una soluzione di montaggio contenente reagente Antifa su un microscopio di vetro.

Far scorrere un vetrino coprioggetti con il lato della cella rivolto verso il basso sulla soluzione di montaggio. Con un panno morbido, premere delicatamente il vetrino coprioggetti contro il vetrino per rimuovere il liquido in eccesso, sigillare il vetrino coprioggetti sul microscopio. Far scorrere applicando lo smalto lungo il bordo del vetrino coprioggetti.

Utilizzare un obiettivo a immersione in olio APO 100 x plan con un'apertura numerica di 1,4 per acquisire le immagini di una cella di RPE positiva BRDU a temperatura ambiente. Determinare il piano focale superiore e inferiore appropriato lungo l'asse Z con una dimensione del passo di 0,2 micron e acquisire immagini lungo l'asse Z. Successivamente, eseguire la deconvoluzione di tutte le pile di immagini acquisite lungo l'asse Z.

Ottenere la proiezione dell'intensità totale di ciascuna immagine. Impilare lungo l'asse Z per le cellule i cui centrosomi sono separati da meno di due micron. Disegna un quadratino di 20-30 pixel per lato attorno a entrambi i centrosomi e segna l'area selezionata.

Disegna un quadrato più grande di 24-35 pixel per lato attorno al primo quadrato e segna l'area selezionata del quadrato grande. Quindi ottenere l'area e l'intensità totale di fluorescenza di ciascun fluoro quattro. In ogni casella, calcolare l'intensità di fluorescenza corretta per lo sfondo di ciascun fluoro. Quattro.

Infine ottenere l'intensità di fluorescenza normalizzata di VDA C3 calcolando il rapporto tra l'intensità di fluorescenza corretta di fondo del suo fluoro. Quattro a quello dei quattro fluoro utilizzati per le immagini standard interne scelte sono state catturate di campi casuali di RPE in crescita asincrona, una cellula incubata con BRDU e l'inibitore del proteasoma MG one 15 o il solvente di controllo DMSO e display DNA e BRDU. L'intensità di fluorescenza corretta del fondo corrispondente al Centro Somal.

La VD 3 era circa 2,5 volte superiore nelle cellule trattate MG 1 15 rispetto alle cellule di controllo, come dimostrato da questo diagramma a scatola e baffi. Quando i dati sono stati normalizzati per la fluorescenza totale di VD 3 rispetto a quella della gamma tubulina, la piega è aumentata, è scesa leggermente a circa il doppio. La colorazione VD C3 a livello di citi non romali o il livello cellulare totale di VD 3 non è stato influenzato dall'inibizione del proteasoma.

Pertanto, il pool romico di VDA C3 è regolato dalla degradazione mediata dal proteasoma. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che gli anticorpi contro la proteina in esame e lo standard interno devono essere aumentati in diverse specie ospiti e che le immagini di entrambi i campioni devono essere acquisite utilizzando parametri di imaging identici, come il numero di tagli cesarei e i tempi di esposizione, al fine di ridurre al minimo l'effetto dell'imaging digitale.