Name: Quantitative Immunofluorescence Assay misurare la variazione dei livelli di proteine ad centrosomi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Impara a quantificare i livelli proteici ai centrosomi con immunofluorescenza quantitativa. Questo metodo utilizza RPE1 e normalizzazione a gamma-tubulina per misurare con precisione le variazioni di proteine come VDAC3 nel ciclo cellulare.

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del National Institutes of Health (GM77311) e da una sovvenzione iniziale da The Ohio Cancer Research Associates (a H.A.F.). SM è stato parzialmente supportato da una borsa di studio Up on the Roof del Programma di Genetica del Cancro Umano dell'Ohio State University Comprehensive Cancer Center.

Cultura 1. Cella <ol><li> Utilizzare telomerasi umana trascrittasi inversa (hTERT) cellule epiteliali del pigmento retinico immortalati (hTERT-RPE1, di cui qui RPE1). NOTA: le cellule RPE1 sono quasi diploide, non trasformati cellule umane che sono comunemente usati per studiare l&#39;assemblaggio centriolo e ciliogenesis. Queste cellule seguono un normale ciclo di duplicazione centriolo coordinato con un ciclo cellulare regolamentato. </li><li> Passaggio un quasi confluenti 100 millimetri piatto di coltura cellulare delle cellule RPE1 a diluizione 1: 5 della coltura originale in un piatto dolce 100 mm avente 10 ml di DME / F-12 (1: 1) media supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS), 100 U / ml di penicillina G e 100 ug / ml di streptomicina (terreno completo è fatto riferimento come DME / F-12 di media). Grow cellule a 37 ° C in presenza di 5% CO 2. <ol><li> Incubare 12 millimetri rotondi vetrini in 50 ml di HCl 1 N in un bicchiere di vetro coperto, O / N senza agitazione, a 60 ° C in un bagno d&#39;acqua o incubatore. </li><li> After scartando la soluzione di acido, lavare i coprioggetti tre volte in 100 ml di acqua distillata incubando per 15 min, con agitazione intermittente. Ripetere il lavaggio simile in 70% etanolo e il 95% di etanolo. </li><li> Asciugare i coprioggetti dai loro diffusione singolarmente su una carta assorbente da laboratorio in un armadio biosicurezza, seguita da sterilizzazione con radiazioni UV per 60 min. </li></ol></li><li> Mettere 2-4 coprioggetto secco in un piatto di coltura cellulare di 35 mm. Diluire la soluzione di fibronectina o fibronectina come polimero ingegnerizzato (concentrazione archivio di 1 mg / ml) ad una concentrazione di 25 ug / ml in PBS coltura cellulare. <ol><li> Mettere 80-100 ml di soluzione diluita su ogni coprioggetto e incubare per 60 min per rivestire il lato superiore del vetrino. Lavare i coprioggetti tre volte con PBS prima di aggiungere terreno completo. </li></ol></li></ol> 2. crescita delle cellule e cellule Trattare con Proteasome Inhibitors <ol><li> Passaggio 2 x 10 5 asincrono crescerecellule ing RPE1 in ogni piatto 35 millimetri contenente coprioggetto e far crescere le cellule in 2 ml terreno completo. Sostituire il terreno di coltura ogni 24 ore con terreno completo fresco pre-riscaldato. <ol><li> Per analizzare l&#39;effetto di inibizione del proteasoma a livello centrosomica della proteina di prova (qui VDAC3 o γ-tubulina), crescono le cellule in due 35 piatti mm per 44 ore. Sostituire il terreno di coltura con terreno completo e aggiungere sia MG115 o DMSO come solvente comando ad una concentrazione finale di 5 mM o 0,05% rispettivamente. Allo stesso tempo, aggiungere BrdU alle cellule ad una concentrazione finale di 40 mM e incubare cellule per 4 ore. </li><li> Trasferire ogni coprioggetto in un 24-pozzetti. Aggiungere metanolo 500 microlitri refrigerata a ciascun pozzetto e incubare la piastra a -20 ° C per 10 minuti per fissare le cellule sui vetrini. Lavare immediatamente i vetrini tre volte con 500 microlitri tampone di lavaggio (PBS 1x contenente 0,5 mM MgCl 2 e il 0,05% Triton-X 100). </li></ol></li><li> Raccogliere il residuocellule dal piatto da 35 mm e centrifugare le cellule a 1000 xg per 5 min. Utilizzare il pellet di cellule per analizzare le proteine ​​mediante western blotting (punto 6). </li></ol> 3. BrdU Pulse e Chase test per analizzare i livelli di proteine ​​nelle diverse fasi del ciclo cellulare <ol><li> Per analizzare la variazione del livello di una proteina (qui VDAC3, SAS6 o Cep135) a centrosomes nelle diverse fasi del ciclo cellulare, crescere le cellule in due piatti 35 mm contenenti coprioggetti per 44 hr. Sostituire il terreno di coltura con terreno completo contenente 40 mM BrdU e incubare le cellule per 4 ore nell&#39;incubatrice coltura cellulare. </li><li> Da un piatto, di trasferire i coprioggetti di un 24-pozzetti per fissare le cellule utilizzando metanolo freddo come descritto al punto 2.1.2. </li><li> Dopo l&#39;impulso di BrdU 4 ore, rimuovere il terreno-BrdU contenente, lavare le cellule una volta con PBS ed una volta con mezzo completo, aggiungere mezzo fresco, e poi far crescere le cellule in assenza di BrdU per vari tempi (tipicamente un&#39;altra 4 hrper le cellule RPE1) prima che fissa le cellule come descritto al punto 2.1.2. NOTA: Per le cellule RPE1, la maggior parte delle cellule BrdU-positive sono in ritardo S o G2-fase, dopo un inseguimento 4 ore. Questo deve essere determinata in modo indipendente per ciascun tipo di cellula. </li></ol> 4. Immunostaining <ol><li> Incubare le cellule fissate su vetrini in 200 microlitri di tampone bloccante (2% BSA e 0,1% TritonX-100 in PBS 1x) per 30 min. <ol><li> Incubare le cellule con una miscela di anticorpi primari (tipicamente un risalto in coniglio e un&#39;altra sollevato nel topo) diluito in tampone di bloccaggio O / N a 4 ° C in una camera umidificata. </li><li> Per fare una camera umidificata, mettere un tovagliolo di carta bagnata nella metà inferiore di un 1.000 ml box puntale vuota. Disporre una striscia di Parafilm sulla superficie cremagliera, e individuare una goccia (15-20 ml) della soluzione di anticorpi sulla Parafilm per ogni coprioggetto da incubate. Invertire un coprioggetto su una goccia di soluzione di anticorpi (in modo che le cellule sono immerse) e vicinoil coperchio della scatola punta. </li><li> Capovolgere nuovamente coprioggetto e tornare al piatto 24-bene. Lavare coprioggetto e poi incubare 150 miscela anticorpo secondario microlitri (qui green-colorante fluorescente coniugato anti-coniglio e colorante rosso fluorescente coniugato anti-topo diluito in tampone di bloccaggio) per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare i coprioggetti tre volte. NOTA: Gli anticorpi secondari fluoroforo-coniugato sono fotosensibili. Proteggere i campioni dalla luce durante le fasi 4.1.3-5.1.2. </li></ol></li><li> Preparatevi per la colorazione anti-BrdU fissando cellule RPE1 colorate di nuovo con 500 microlitri metanolo raffreddato a -20 ° C per 10 minuti, come descritto al punto 2.1.2. Lavare i coprioggetti tre volte. NOTA: Questa fissazione assicura l&#39;etichettatura anticorpo primario e secondario della proteina (s) di interesse durante il processo di idrolisi acida nel passaggio seguente. <ol><li> Incubare le cellule in 200 ml di 2 N HCl per 30 minuti a RT. Neutralizzare con 300 ml di 1 M Tris-Cl, pH 8 und lavare le cellule tre volte con tampone di lavaggio. </li><li> Bloccare le cellule nuovamente utilizzando 200 microlitri di tampone bloccante per 30 minuti a RT. </li><li> Incubare le cellule con anticorpo anti-topo (BrdU diluito in tampone di bloccaggio) per 45 min a 37 ° C in una camera umidificata. Restituisce i coprioggetti torna al piatto 24 pozzetti, lavarli e poi incubare con blu-colorante fluorescente coniugato anti-rat anticorpo secondario (diluito in 150 ml di soluzione bloccaggio in piatto 24 pozzetti per 1 ora a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Lavare i coprioggetti tre volte. Spot una goccia (circa 3-6 ml) di una soluzione di montaggio contenente antifade reattivo su un vetrino da microscopio in vetro. Invertire un coprioggetto, con la cellula-lato rivolto verso il basso, sulla soluzione di montaggio. Pulire il liquido in eccesso premendo delicatamente il vetrino contro il vetrino utilizzando tessuti di pulizia molli. Applicare lo smalto trasparente lungo il bordo del vetrino per sigillarlo sul vetrino da microscopio. </li></ol> 5. immunofluorescenza Immagine Acquisition e analisi <ol><li> Utilizzare un obiettivo ad immersione 100X Plan Apo (con un&#39;apertura numerica 1.4) per acquisire le immagini di cellule RPE1 BrdU-positive a temperatura ambiente. <ol><li> Mettere un vetrino sul microscopio (vedi attrezzature) collegato con una macchina fotografica in grado di digital imaging. Per ciascun fluoroforo, determinare il tempo di esposizione appropriata (tipicamente tra 300-1,000 msec) esaminando manualmente tutti i campioni di un esperimento. Prima di acquisire immagini di una cella, determinare manualmente all&#39;inizio appropriato e piano focale inferiore lungo l&#39;asse Z (tipicamente 0,2 micron passo). Acquisire le immagini di diversi campioni che si trovano su vetrini separati con tempo di esposizione identico per i diversi fluorofori lungo l&#39;asse Z utilizzando un pacchetto software di imaging digitale di microscopia. </li></ol></li><li> Eseguire deconvoluzione (in questi casi utilizzando n algoritmo prossimo) di tutte le pile di immagine acquisiti lungo l&#39;asse Z. <ol><li> Ottenere la proiezione intensità totale di ogni pila di immagini insiemeZ. </li></ol></li><li> Nelle cellule dove centrosomi sono vicini (distanza tra due centrosomi è inferiore a 2 micron), disegnare una piccola piazza (tipicamente 20-30 pixel per lato) intorno ad entrambi i centrosomi e segnare l&#39;area selezionata. <ol><li> Disegnare un quadrato più grande (in genere 24-35 pixel per lato) che circondano la prima piazza e segnare l&#39;area selezionata del piazzale. </li><li> Ottenere la zona (A) e l&#39;intensità di fluorescenza totale (F) di ciascun fluoroforo in ciascuna casella (S denota piccola scatola e L indica grande scatola). </li><li> Analizzare il fondo corretta intensità di fluorescenza di ciascun fluoroforo utilizzando la formula descritta da Howell et al. 29: F = F S - [(F L - F S) x A S / (A L - A S)]. </li><li> Ottenere l&#39;intensità di fluorescenza normalizzata della proteina di interesse (qui VDAC3 o SAS6) calcolando il rapporto tra l&#39;intensità di fluorescenza di fondo corretto dei suoi fluorophore a quella del fluoroforo utilizzato per lo standard prescelto interno (qui γ-tubulina, SAS6 o Cep135). </li></ol></li><li> Nel caso di analisi cellule dove centrosomes sono ben separati (distanza tra due centrosomi è maggiore di 2 micron), analizzare ogni centrosome separatamente disegnando due gruppi separati di scatole. Disegnare una piccola piazza (tipicamente 15-25 pixel per lato) intorno ad ogni centrosomi e segnare l&#39;area selezionata. Disegnare un quadrato più grande (20-30 pixel per lato) che circondano la prima piazza e segnare l&#39;area selezionata. <ol><li> Ottenere la zona (A) e l&#39;intensità di fluorescenza totale (F) di ciascun fluoroforo in ogni casella, e calcolare correzione del fondo fluorescenza intensità di ciascun fluoroforo, separatamente per ciascuna centrosome, come descritto al punto 5.3.3. </li><li> Combinare correzione del fondo fluorescenza intensità di ciascuna proteina dai due centrosomi per ottenere il livello centrosomica totale di proteine ​​che in quella cella. </li><li> Ottenere ilintensità normalizzata per la proteina di interesse calcolando il rapporto tra l&#39;intensità totale centrosomica all&#39;intensità centrosomica totale dello standard interno. </li></ol></li><li> Analizzare almeno 15-25 cellule per ogni condizione sperimentale e tracciare il grafico in un foglio di calcolo. </li></ol> 6. Analizzando il Proteine ​​totali Utilizzando Western Blotting <ol><li> Risospendere le cellule in radioimmunoprecipitazione dosaggio (RIPA) tampone contenente 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1% desossicolato di sodio, 0,1% sodio dodecil solfato (SDS) e incubare per 10 min in ghiaccio per lisare le cellule. <ol><li> Centrifugare la miscela a 10.000 xg per 10 min, separare il lisato dalla frazione pellet e misurare la concentrazione di proteine ​​totali di ciascun lisato utilizzando un acido bicinconinico (BCA) Kit test. </li></ol></li><li> Mescolare 40 ug di lisato con 4x SDS-PAGE tampone di caricamento (50 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerolo, ditiotreitolo 100 mM, 0,1% Bromophenol blu). <ol><li> Lessare i campioni per 10 minuti ed eseguire i campioni su un 12,5% di denaturazione SDS-PAGE ad una tensione costante di 200 V. </li></ol></li><li> Trasferire le proteine ​​separate su SDS-PAGE su una membrana di nitrocellulosa utilizzando la tecnica western blotting (ad una tensione costante di 90 V per 1 ora a freddo). <ol><li> Bloccare la membrana con 3% latte scremato in PBS 1x e quindi incubare la membrana con soluzioni di anticorpi primari diluiti (in questo caso coniglio anti-VDAC3, coniglio anti-γ-tubulina e topo anti-α-tubulina) per 1 ora a RT. </li><li> Dopo aver lavato la membrana tre volte (ogni 5 min di incubazione sotto agitando) usando tampone PBS-T (PBS 1x e 0,2% Tween-20), incubare la membrana in una miscela di infrarosso vicino (IR) colorante fluorescente coniugato anti-coniglio e colorante fluorescente IR coniugati anti-topo anticorpi secondari (diluito in PBS-T) per 1 ora. </li><li> Lavare la membrana per tre volte e quindi acquisire la membrana per analizzare le fasce con un f infrarossisistema di imaging luorescence adatto per il rilevamento immunoblot. </li></ol></li></ol>

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<li>Buck, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2%27-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry%2C+an+alternative+to+using+5-bromo-2%27-deoxyuridine+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Microscopia quantitativa in biologia cellulare è comunemente associato con live-cell test di imaging come la Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP), ecc, tuttavia, ci sono esempi di crescita di biologi cellulari di sviluppo diversi saggi microscopia quantitativi per fisso cellule negli ultimi anni 27,34-36. È importante sottolineare che, progressi nella comprensione della biologia centrosoma spesso richiede la comprensione della funzione ...

Centrosomi costituiti da una coppia di centrioli circondate da materiale pericentriolar (PCM). Essendo i principali centri di organizzazione dei microtubuli (MTOC) in cellule di mammifero, centrosomi servono come i due poli di fusi mitotici nelle cellule in divisione, e quindi aiutano a mantenere l&#39;integrità genomica 1. Nelle cellule quiescenti (ad esempio, durante la fase G0), uno dei due centrioli del centrosoma, cioè centriolo madre, si trasforma in un corpo basale per assemblare il cilium primaria, un organello sensoriale sporge dalla superficie cellulare 2. Una volta che le cellule ri-entrare nel ciclo cellulare, cilia primaria sono smontati e ogni centriolo dirige il montaggio di un procentriole alla sua estremità prossimale che allunga progressivamente a formare una centriolo maturo 3. All&#39;inizio della fase S, una struttura di carro-like che fornisce la simmetria 9 volte al centriolo è formata sulla superficie di ciascun centriole esistente e diventerà la base di ogni procentriole. SAS6 tcappello è indispensabile per il montaggio centriolo viene reclutato per formare il fulcro della Cartwheel 4-6. Altre proteine ​​centriolar vengono poi assemblati sul cartwheel in un altamente regolamentato, prossimale a distale maniera 7. Dopo aver completato proprio centriolo duplicazione, cellule assemblare materiali pericentriolar supplementari per la costruzione di due centrosomi funzionali entro la fine della fase G2 8. Oltre ai componenti centriolar base 9-11, diverse altre proteine ​​tra cui chinasi, fosfatasi, accompagnatori, componenti del ponteggio, proteine ​​associate membrana e macchinari degrado sono associate a centrioli, corpi basali e PCM in momenti diversi del ciclo cellulare 12-16. Si è spesso osservato che i livelli centrosomica di molte proteine ​​sono temporalmente regolati da meccanismi di targeting centrosomica e / o degradazione del proteasoma in centrosomes. È importante sottolineare che le fluttuazioni del livello centrosomica di diverse proteine ​​come Plk4, Mps1, SAS6, e CP110 unt diversi punti del ciclo cellulare sembra essere essenziale per regolare centriole assemblaggio 5,17-22, e nel caso di Mps1 prevenire questa degradazione centrosomica porta alla formazione di centrioli eccesso 19. D&#39;altra parte, le frazioni centrosomica di diverse proteine ​​sono meno labile rispetto alle piscine citosolici. Per esempio siRNA-mediata down-regulation di Centrin 2 (Cetn2) ha comportato solo una riduzione moderata del livello di proteine ​​nelle centrioli nonostante grande riduzione dei suoi livelli di cellule intere 23. E &#39;quindi fondamentale per misurare le variazioni del livello delle proteine ​​centrosomica al centrosoma, piuttosto che misurare i livelli di proteine ​​intere cellule nel valutare le loro funzioni specifiche centrosoma. In questo studio abbiamo sviluppato un saggio con immunofluorescenza indiretta (IIF) per quantificare il livello relativo di una proteina a centrosomi. Questo test è stato sviluppato in particolare per analizzare cellule che sono da diversi campionie quindi non può essere ripreso contemporaneamente. Questi campioni possono essere le cellule che sono stati trattati con diversi reagenti (cioè, farmaco contro controllo), raccolti in diversi momenti (ad esempio, impulsi contro chase), o sono in diverse fasi del ciclo cellulare. Il principio di questo test consiste nel misurare l&#39;intensità di fluorescenza di fondo corretta corrispondente ad una proteina in una piccola regione e per normalizzare tale valore contro lo stesso per un&#39;altra proteina i cui livelli non variano nelle condizioni sperimentali adottate. Diversi studi in biologia centrosome hanno recentemente utilizzato varie tecniche di microscopia quantitative, in entrambe le cellule vive o fissi, per determinare la funzione specifica centrosoma di proteine ​​candidate 24-27. Simile a tali saggi, la tecnica attuale misura anche il fondo corretta intensità di fluorescenza della proteina. Tuttavia, l&#39;inclusione della normalizzazione usando uno standard interno in questo saggio sarebbe probabilmente offrire maggiorela precisione e la fiducia ad analizzare due campioni diversi che si trovano su due lamelle differenti. Inoltre, oltre ad esaminare il livello di proteine ​​a centrosomes, con piccole modifiche questo metodo può essere applicato ad un insieme eterogeneo di condizioni sperimentali o in altri siti cellulari. Qui, uniamo la nostra analisi di microscopia quantitativa con una strategia di pulse-chase BrdU per confrontare le cellule provenienti da diverse fasi del ciclo cellulare. Invece di utilizzare tecniche di arresto del ciclo cellulare normale e rilascio di studiare vari momenti del ciclo cellulare, le cellule in modo asincrono in crescita sono incubate con BrdU per etichettare le cellule in fase S, e le cellule marcate sono inseguiti per diverse volte (in genere 4-6 hr). La maggior parte delle cellule marcate saranno in fase S immediatamente dopo l&#39;impulso. La lunghezza della caccia è scelto in modo che dopo la caccia, cellule marcate saranno in ritardo S, G2 o mitosi, che può essere verificata da caratteristiche morfologiche tale posizione as- di centrosomi rispetto nuclei, distanza tra centrosomi, condensazione di cromosomi ecc Quindi, la lunghezza della caccia dipende dalla durata media di S, G2 e M di fase di un particolare tipo di cellula. Poiché questo approccio evita inibitori del ciclo cellulare come idrossiurea, afidicolina, nocodazole, ecc, permette una analisi più fisiologicamente rilevanti ciclo cellulare. Così, abbiamo dimostrato qui che la microscopia a fluorescenza quantitativa dosaggio soli, o in combinazione con BrdU test pulse-chase, è una tecnica semplice ma potente per misurare con precisione le relative variazioni del livello centrosomica di una proteina candidato durante un ciclo cellulare imperturbato. Abbiamo misurato il livello di centrosomica VDAC3, una proteina che abbiamo recentemente identificato in centrosomi, oltre ai mitocondri 16,28, con questi test. I risultati ottenuti qui verificare la nostra osservazione precedente che il pool di centrosomica VDAC3 è regolato da degrado, e varia anche in un dependen ciclo cellularet modo 16, inoltre, convalida l&#39;applicabilità di questo metodo.

<table><tbody><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma</td><td>F8141</td><td>Stock di 1 mg/ml in acqua</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>MG115</td><td>Sigma</td><td>SCP0005</td><td>Stock di 10 mM in DMSO</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td>Stock di 10 mM in DMSO</td></tr><tr><td>Anti-&#947;-tubulina (monoclonale di topo, clone GTU 88)</td><td>Sigma</td><td>T 6557</td><td>1:200 in tampone bloccante IIF&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-VDAC3 (policlonale di coniglio)&nbsp;</td><td>Aviva Systems Biology</td><td>ARP35180-P050</td><td>1:50 in tampone di blocco IIF, 1:1.000 in tampone di blocco WB</td></tr><tr><td>Anti-Sas6 (monoclonale di topo)&nbsp;</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-81431 1</td><td>:100 in tampone bloccante IIF</td></tr><tr><td>Anti-Cep135 (policlonale di coniglio)</td><td>Abcam</td><td>ab-75005</td><td>1:500 in tampone bloccante IIF</td></tr><tr><td>Anti-BrdU (monoclonale di ratto)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1:250 in tampone di blocco IIF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A21093</td><td>1:200 in IIF buffer di blocco</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21202</td><td>1:1.000 in IIF buffer di blocco</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21203</td><td>1:1.000 in IIF tampone bloccante</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21206</td><td>1:1.000 in tampone di blocco IIF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21207</td><td>1:1.000 in tampone di blocco IIF</td></tr><tr><td>Anti-&#947;-tubulina (coniglio policlonale)</td><td>Sigma</td><td>T5192</td><td>1:1.000 in tampone</td></tr> <tr><td>di blocco WBAnti-&#945;-tubulina (monoclonale di topo, DM1A)</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1:20.000 in tampone di blocco del WB</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A10043</td><td>1:10.000 in tampone di blocco del WB</td></tr><tr><td>IgG di topo (H& L) Anticorpo IRDye800CW Anticorpi coniugati</td><td>Rockland</td><td>610-731-002</td><td>1:10.000 in tampone di blocco WB</td></tr><tr><td>Reagente antidissolvenza SlowFade Gold</td><td>Life technologies</td><td>S36936</td><td>Supporti di montaggio</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti rotondi 12CIR.-1</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Olympus IX-81</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga ExiFAST 1394 Telecamera IR</td><td>QImaging&nbsp;</td><td>32-0082B-238</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo a immersione in olio 100X Plan Apo</td> Apertura numerica <td>Olympus</td><td></td><td>1.4</td></tr><tr><td>Pacchetto software Slidebook</td><td>Innovazioni</td><td></td><td></td>di imaging intelligente</tr><tr><td>Sistema di imaging IR Odyssey</td><td>Li-cor Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saggio dell'acido bicinchoninico (BCA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>U-MNU2 Cubo</td> <td>UV strettoFiltro Olympus</td><td>U-M622</td><td></td></tr><tr><td>U-MNU2 Cubo blu stretto</td><td>Filtro Olympus</td><td>U-M643</td><td></td></tr><tr><td>U-MNU2 Cubo verde stretto</td><td>Filtro Olympus</td><td>U-M663</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative immunofluorescence assay misurare la variazione dei livelli di proteine ​​ad centrosomi

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomi sono piccoli ma importanti organelli che servono come i poli di mitotico mandrino per mantenere l&#39;integrità genomica o assemblare cilia primario per agevolare le funzioni sensoriali nelle cellule. Il livello di una proteina può essere regolata in modo diverso a centrosomes rispetto ad altre posizioni .cellular, e la variazione nel livello centrosomica di diverse proteine ​​in punti diversi del ciclo cellulare sembra essere cruciale per la corretta regolazione del complessivo centriolo. Abbiamo sviluppato un microscopio a fluorescenza dosaggio quantitativo che misura variazioni relative del livello di una proteina a centrosomes in cellule fisse di diversi campioni, come in diverse fasi del ciclo cellulare o dopo trattamento con vari reagenti. Il principio di questo test consiste nel misurare l&#39;intensità di fluorescenza di fondo corretta corrispondente ad una proteina in una piccola regione, e normalizzare che misura contro lo stesso per un&#39;altra proteina che non varia con il c sperimentale presceltoondition. Utilizzando questo test, in combinazione con l&#39;impulso BrdU e la strategia caccia di studiare cicli cellulari imperturbati, abbiamo quantitativamente convalidato la nostra recente osservazione che il pool di centrosomica VDAC3 è regolata a centrosomi durante il ciclo cellulare, probabilmente dalla degradazione proteasoma-mediata specificamente a centrosomi.

I nostri studi recenti identificati romanzo localizzazione centrosomica e la funzione di VDAC3, uno dei porine mitocondriali 16,28. Immunostaining di diverse cellule di mammiferi, tra cui le cellule RPE1 utilizzando un anticorpo VDAC3 specifico ha mostrato prominente colorazione centrosomica e relativamente debole colorazione mitocondriale. Abbiamo anche dimostrato che VDAC3 centrosomica è preferenzialmente associata al centriolo madre, e la piscina centrosomica sia endogeno e ectopicamente espresso VDAC3 è r...

Qui, viene sviluppato un nuovo test di fluorescenza quantitativa per misurare i cambiamenti nel livello di una proteina specificamente nei centrosomi normalizzando l'intensità di fluorescenza di quella proteina a quella di uno standard interno appropriato.

Quantitative Immunofluorescence Assay misurare la variazione dei livelli di proteine ​​ad centrosomi

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare i cambiamenti relativi nel livello di una proteina nei centrosomi in varie condizioni. Ad esempio, in un punto specifico del ciclo cellulare dopo l'inibizione del proteasoma, ciò si ottiene trattando prima le cellule che crescono su vetrini coprioggetti con l'inibitore del proteasoma MG one 15 o con il solvente di controllo DMSO. Quindi aggiungendo immediatamente BRDU a entrambe le cellule e incubandole per quattro ore in un incubatore per colture cellulari.Il secondo passo consiste nel trasferire i vetrini di copertura su una piastra a 24 pozzetti per fissare le celle. Successivamente, le cellule vengono colorate con anticorpi contro BRDU e le proteine di interesse, e quindi con anticorpi secondari corrispondenti. Il passaggio finale consiste nell'acquisire immagini di cellule BRDU positive utilizzando un microscopio a fluorescenza e un software di imaging digitale per applicare lo stesso tempo di esposizione e lunghezza dell'asse Z alle cellule di ciascun campione.Quindi analizzando le immagini per quantificare il livello relativo di VDA C3 romale. In definitiva, la microscopia quantitativa a immunofluorescenza viene utilizzata per dimostrare che il pool centro-somico di VDA C3 aumenta di due volte quando il proteasoma viene inibito durante la fase S. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la citometria a flusso, l'immunoblotting o il microscopio quantitativo, è che questa tecnica analizza il livello romale relativo della proteina in due campioni trattati in modo diverso che vengono elaborati su due diversi vetrini. Questo metodo utilizza la normalizzazione a uno standard interno per controllare la necessità di elaborare le due popolazioni cellulari sperimentali.Separatamente, sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla regolazione di proteine specifiche nei centrosomi. Può anche essere applicato ad altre situazioni, come altre strutture subcellulari o l'esame di specifici pool di proteine che si trovano in più siti all'interno della cellula. A dimostrare la procedura sarà Schu Majumder, un postdoc del mio laboratorio Per iniziare l'esperimento, passare due volte da 10 al quinto in modo asincrono di una cellula RPE in piatti da 35 millimetri precedentemente preparati con labbra di copertura e far crescere le cellule in due millilitri di terreno completo.Sostituire il terreno di coltura ogni 24 ore con un terreno di preriscaldamento fresco Dopo 44 ore. Sostituire il terreno di coltura con un terreno completo contenente 0,05% di DMSO o MG 1 15 a una concentrazione finale di cinque micromolari e contemporaneamente aggiungere BRDU alle cellule a una concentrazione finale di 40 micromolari, incubare le cellule per quattro ore. Quindi, trasferire ciascun vetrino di copertura su una piastra a 24 pozzetti.Aggiungere 500 microlitri di metanolo pre-lavorato a ciascun pozzetto e incubare la piastra a meno 20 gradi Celsius per fissare le cellule. Dopo 10 minuti, lavare immediatamente i vetrini coprioggetto tre volte con 500 microlitri di tampone di lavaggio. Incubare le cellule fissate sul coperchio, infilare 200 microlitri di tampone bloccante per 30 minuti mentre le cellule sono in incubazione.Preparare una camera umidificata posizionando un tovagliolo di carta bagnato nella metà inferiore di una scatola vuota di puntali per pipette da 1000 microlitri. Stendere una striscia di profumo sulla superficie del rack e aggiungere sulla paraforma una goccia da 20 microlitri di anticorpo rabbit anti V DDA three e mouse anti gamma tubulina diluito in tampone bloccante. Dopo il blocco, capovolgere un vetrino coprioggetti su ciascuna gocciolina di soluzione anticorpale.Assicurarsi che le celle siano immerse e chiudere il coperchio della scatola dei puntali. Incubare le cellule con anticorpi primari per una notte a quattro gradi Celsius nella camera umidificata. Capovolgere nuovamente i vetrini coprioggetto e rimetterli al 24.Lavare bene i vetrini coprioggetti, quindi incubarli in una soluzione da 150 microlitri di anticorpi secondari, diluiti in tampone bloccante per un'ora a temperatura ambiente Dopo l'incubazione, lavare i vetrini coprioggetti tre volte con tampone di lavaggio. Fissare le cellule RPE colorate con 500 microlitri di metanolo raffreddato a meno 20 gradi Celsius. Dopo che le celle si sono fissate per 10 minuti, lavarle tre volte nel tampone di lavaggio.Successivamente, incubare le cellule in 200 microlitri di due HCL normali per 30 minuti. A temperatura ambiente, neutralizzare le cellule con 300 microlitri di tris CL a pH otto di un molare e lavare le cellule tre volte. Con il tampone di lavaggio bloccare le celle con 200 microlitri di tampone bloccante per 30 minuti a temperatura ambiente.Dopo il blocco, incubare le cellule con l'anticorpo anti BRDU di ratto e il tampone bloccante per 45 minuti a 37 gradi Celsius nella camera umidificata. Restituire i vetrini di copertura al 24. Lavare bene le cellule.Successivamente, incubarli con anticorpi secondari diluiti in 150 microlitri di tampone bloccante. In una pirofila a 24 pozzetti per un'ora a temperatura ambiente. Quindi lavare i vetrini coprioggetti tre volte con un punto XPBS, una gocciolina da sei microlitri di una soluzione di montaggio contenente reagente Antifa su un microscopio di vetro.Far scorrere un vetrino coprioggetti con il lato della cella rivolto verso il basso sulla soluzione di montaggio. Con un panno morbido, premere delicatamente il vetrino coprioggetti contro il vetrino per rimuovere il liquido in eccesso, sigillare il vetrino coprioggetti sul microscopio. Far scorrere applicando lo smalto lungo il bordo del vetrino coprioggetti.Utilizzare un obiettivo a immersione in olio APO 100 x plan con un'apertura numerica di 1,4 per acquisire le immagini di una cella di RPE positiva BRDU a temperatura ambiente. Determinare il piano focale superiore e inferiore appropriato lungo l'asse Z con una dimensione del passo di 0,2 micron e acquisire immagini lungo l'asse Z. Successivamente, eseguire la deconvoluzione di tutte le pile di immagini acquisite lungo l'asse Z.Ottenere la proiezione dell'intensità totale di ciascuna immagine. Impilare lungo l'asse Z per le cellule i cui centrosomi sono separati da meno di due micron. Disegna un quadratino di 20-30 pixel per lato attorno a entrambi i centrosomi e segna l'area selezionata.Disegna un quadrato più grande di 24-35 pixel per lato attorno al primo quadrato e segna l'area selezionata del quadrato grande. Quindi ottenere l'area e l'intensità totale di fluorescenza di ciascun fluoro quattro. In ogni casella, calcolare l'intensità di fluorescenza corretta per lo sfondo di ciascun fluoro. Quattro.Infine ottenere l'intensità di fluorescenza normalizzata di VDA C3 calcolando il rapporto tra l'intensità di fluorescenza corretta di fondo del suo fluoro. Quattro a quello dei quattro fluoro utilizzati per le immagini standard interne scelte sono state catturate di campi casuali di RPE in crescita asincrona, una cellula incubata con BRDU e l'inibitore del proteasoma MG one 15 o il solvente di controllo DMSO e display DNA e BRDU. L'intensità di fluorescenza corretta del fondo corrispondente al Centro Somal.La VD 3 era circa 2,5 volte superiore nelle cellule trattate MG 1 15 rispetto alle cellule di controllo, come dimostrato da questo diagramma a scatola e baffi. Quando i dati sono stati normalizzati per la fluorescenza totale di VD 3 rispetto a quella della gamma tubulina, la piega è aumentata, è scesa leggermente a circa il doppio. La colorazione VD C3 a livello di citi non romali o il livello cellulare totale di VD 3 non è stato influenzato dall'inibizione del proteasoma.Pertanto, il pool romico di VDA C3 è regolato dalla degradazione mediata dal proteasoma. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che gli anticorpi contro la proteina in esame e lo standard interno devono essere aumentati in diverse specie ospiti e che le immagini di entrambi i campioni devono essere acquisite utilizzando parametri di imaging identici, come il numero di tagli cesarei e i tempi di esposizione, al fine di ridurre al minimo l'effetto dell'imaging digitale.

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Questo video mostra un metodo per monitorare il traffico di cellule infette da proteina 0, ICP0 nell'infezione da virus dell'herpes simplex-1. Dopo la sintesi de novo, ICP0 trasloca nel nucleo, spostandosi successivamente nel citoplasma durante la progressione dell'infezione. La microscopia a immunofluorescenza rivela e analizza la localizzazione subcellulare della proteina, offrendo informazioni sul suo traffico nelle fasi dell'infezione.

Una tecnica di immunofluorescenza per la localizzazione di proteine virali in cellule infette

Presentato è un flusso di lavoro flessibile, l'informatica che consente l'analisi di immagini basata multiplex di cellule fluorescente. Il flusso di lavoro quantifica marcatori nucleari e citoplasmatici e calcola marcatore traslocazione tra questi compartimenti. Le procedure sono previste per la perturbazione di cellule utilizzando siRNA e metodologia affidabile per il rilevamento marcatore mediante immunofluorescenza indiretta in formati da 96 pozzetti.

Flusso di lavoro per High-contenuti, Quantificazione singola cella di fluorescenti Marcatori da Universal Microscopio dati, supportati da Open Source Software

Qui riportiamo protocolli per rilevare proteine centromero-cinetocore endogene ed esogene nelle cellule umane e quantificare questi livelli di proteine a centromeri-cinetocori mediante colorazione immunofluorescente indiretta attraverso l'uso di fissazione (paraformaldeide, acetone o metanolo).

Le proteine ​​immunofluorescenza di endogeni ed esogeni Centromere-cinetocoro

Questo manoscritto descrive un metodo per visualizzare e quantificare gli eventi di conversione localizzata in compartimenti subcellulari. L'approccio proposto in questo manoscritto richiede un sistema di imaging confocale base e reagenti ed è rapido ed economico.

Quantitativa immunofluorescenza su misura globale localizzato traduzione

Abbiamo sviluppato una strategia per purificare e un gran numero di centrioli in diversi orientamenti suscettibili per microscopia di Super-risoluzione e con una media di singola particella di immagine.

Isolamento e formazione immagine di fluorescenza per la ricostruzione di singola particella di Chlamydomonas centrioli

Questo protocollo descrive un approccio di basato su spettroscopia di fluorescenza fluttuazione per indagare le interazioni tra proteine che mediano interazioni cellula-cellula, cioè proteine localizzate nelle giunzioni delle cellule, direttamente nelle cellule viventi. Forniamo le linee guida dettagliate sulla calibrazione dello strumento, acquisizione dati e analisi, comprese le correzioni al fonti possibili manufatto.

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

Descriviamo l'uso di quantitativi immunoblotting per convalidare l'istologia di immunofluorescenza accoppiato con analisi dell'immagine come mezzo di quantificare una proteina di interesse nei campioni di tessuto formalina-fisse, paraffina (FFPE). I nostri risultati dimostrano l'utilità dell'istologia di immunofluorescenza per accertare la quantità relativa di proteine biomarcatore nei campioni di biopsia di routine.

Immunoblotting quantitativa delle linee cellulari come Standard per convalidare l'immunofluorescenza per quantificare le proteine biomarcatore nei campioni di tessuto di Routine

Qui, descriviamo un approccio quantitativo per determinare la distribuzione di una proteina sinaptica rispetto una proteina marker mediante immunofluorescenza, microscopia confocale e analisi computerizzata.

Quantificare la distribuzione eterogenea di una proteina sinaptica nel cervello del Mouse mediante immunofluorescenza

Descriviamo un protocollo che utilizza la fluorescenza nell'ibridazione situ (FISH) per visualizzare più RNA herpesvirali all'interno di cellule umane lytically infette, sia in sospensione che aderenti. Questo protocollo include la quantificazione della fluorescenza producendo un rapporto nucleocitoplasmatica e può essere esteso per la visualizzazione simultanea di proteine ospite e virali con immunofluorescenza (IF).

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) e Immunofluorescence (IF) di prodotti genici specifici nelle cellule infette da KSHV

L'ubiquilazione CENP-A è un requisito importante per la deposizione ceNP-A al centromero, ereditata attraverso la dimerizzazione tra la divisione cellulare e indispensabile per la vitalità cellulare. Qui descriviamo l'analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione della proteina CENP-A (EYFP-CENP-A) marcata con EYFP.

Analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione del CENP-A con tag EYFP (EYFP-CENP-A)

Questo metodo descrive un protocollo di immunofluorescenza e una pipeline di quantificazione per valutare la distribuzione proteica con vari modelli di organizzazione nucleare nei linfociti T umani. Questo protocollo fornisce una guida passo dopo passo, a partire dalla preparazione del campione e proseguendo attraverso l'esecuzione di analisi semi-automatizzate nelle Fiji, concludendo con la gestione dei dati da parte di un taccuino Google Colab.

Una pipeline versatile per l'analisi dei cambiamenti dinamici nei corpi nucleari in una varietà di tipi di cellule

Impara a quantificare i livelli proteici ai centrosomi con immunofluorescenza quantitativa. Questo metodo utilizza RPE1 e normalizzazione a gamma-tubulina per misurare con precisione le variazioni di proteine come VDAC3 nel ciclo cellulare.

Quantitative Immunofluorescence Assay misurare la variazione dei livelli di proteine ​​ad centrosomi

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