Stereologica e Citometria a Flusso Caratterizzazione dei leucociti sottopopolazioni in modelli di transitori o permanenti Cerebral Ischemia

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di caratterizzare sottogruppi di cellule mieloidi di topo del cervello ischemico con due diverse metodologie. In primo luogo, un modello permanente di ischemia cerebrale viene introdotto occludendo sia l'arteria carotide comune o CCA che il tronco distale dell'arteria cerebrale media o MCA generando infarto che colpisce principalmente la corteccia cerebrale. Quindi, per la quantificazione stereologica dei sottogruppi di cellule mieloidi, le sezioni coronali seriali del cervello vengono colorate immunologicamente per le cellule di interesse, e quindi le cellule infiltrate vengono quantificate con l'approccio del frazionamento ottico.

In alternativa, le cellule mieloidi possono essere isolate dal tessuto cerebrale fresco mediante dissociazione meccanica, quindi colorate e analizzate mediante citometria a flusso. In definitiva, una quantificazione accurata e una caratterizzazione qualitativa dettagliata degli specifici sottogruppi di cellule mieloidi che si infiltrano nel cervello del topo dopo l'ischemia cerebrale possono essere ottenute rispettivamente mediante stereoquantificazione e citometria a flusso multiparametrica. Il vantaggio principale di questo modello seriale di ischemia rispetto ad altri esistenti è che la nostra tecnica ha tassi di mortalità significativamente più bassi rispetto ad altri metodi, riducendo al minimo il numero di animali necessari per lo studio.

Questo settore è un metodo che può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ictus, come ad esempio quali sono i ruoli della micro riattivazione, dello stravaso di macrofagi ematogeni o dei neutrofili nelle lesioni cerebrali? L'accurata quantificazione teologica degli approcci citometrici multiparametrici dimostrati in questo articolo può fornire informazioni sul numero, sul fenotipo e sulla funzione della popolazione di cellule mieloidi nella risposta immunitaria innata all'ischemia CE. Per legare prima il CCA, praticare un'incisione della linea mediana di un centimetro attorno alla superficie ventrale del collo dell'animale sotto un microscopio chirurgico.

Una volta sezionato, utilizzare una sutura di nylon a sei zero per occludere il CCA sinistro con un nodo permanente per legare l'MCA distale. Quindi, praticare un'incisione orizzontale sul muscolo temporale da destra a sinistra. Quindi praticare una seconda incisione verticale sul lato destro del muscolo temporale.

Facendo attenzione a non tagliare la vena temporale. Separa il muscolo temporale dal cranio e tienilo con una sutura per mantenere una superficie cranica pulita. Quindi pulire il cranio con soluzione fisiologica sterile fredda per rilevare l'esatta posizione dell'MCA sinistro tramite la trasparenza del cranio.

Una volta identificato l'MCA, utilizzare una fresa in acciaio inossidabile per eseguire una craniotomia rotonda di un millimetro nel lobo frontale tra l'arco zigomatico e l'osso squamale. Rimuovere con cautela il teschio esponendo l'MCA. Quindi utilizzare una sutura di nylon nove zero per occludere l'MCA sinistro nel tronco distale appena prima della biforcazione tra i rami MCA frontale e posteriore con un nodo permanente.

Per rimuovere il cervello, decapitare il topo soppresso appena sopra il midollo spinale e praticare un'incisione anteriore posteriore nella pelle per esporre il cranio. Quindi fai due tagli laterali all'incrocio delle pareti laterali e della base del cranio e rimuovi il piccolo pezzo di osso. Quindi, fai un taglio attraverso il cranio lungo la sutura sagittale e usa una pinza per rimuovere il cranio sovrastante ogni emisfero per esporre il cervello.

Usa una spatola per separare il cervello dal cranio e trasferiscilo in una soluzione di PFA al 4%. Dopo tre ore, rimuovere il PFA e incubare il cervello in una soluzione di saccarosio al 30% per crioproteggere il cervello. Dopo 48 ore, rimuovere la soluzione di saccarosio e congelare rapidamente il cervello a 40 gradi Celsius isop pentano, quindi utilizzare un microtomo di congelamento per creare sezioni di cervello coronale di 30 micrometri.

Raccolta di 10 set seriali in una soluzione conservante criogenica. Ogni set seriale è composto da circa 14-16 fette coronali con una distanza tra le fette di 300 micrometri. Garantire un adeguato campionamento del cervello di topo tra 1,94 e 2,46 negativi posteriormente al bgma per stimare il numero totale di neutrofili infiltrati.

Dopo l'occlusione dell'MCA mediante un frazionamento ottico, prima immunocolorare i neutrofili con l'anticorpo anti-LY six G di ratto e l'anticorpo secondario appropriato su sezioni fluttuanti con tecnica di immunofluorescenza convenzionale. Quindi montare le sezioni cerebrali sui vetrini del microscopio super frosts con l'area infartuata posizionata a destra e aprire il software di ricerca stereo. Successivamente, fai clic sul menu di gestione della sezione seriale degli strumenti e aggiungi una nuova sezione con il pulsante della nuova sezione.

Impostare l'intervallo di valutazione su 10 per una frazione di campionamento di una decima fetta. E poi dal menu del contorno verso il basso, seleziona lo strumento contorno dell'area infartuata. Disegna un contorno per delineare l'area infartuata sotto l'obiettivo 10x.

Quindi passare all'obiettivo 100 x sul microscopio e nel menu dell'obiettivo. Per quantificare i neutrofili nel menu delle sonde, selezionare il frazionatore ottico e impostare il posizionamento XY dei fotogrammi di conteggio su 230 per entrambe le dimensioni della griglia X e Y. Ora seleziona il pulsante dei neutrofili dalla barra dei marcatori e contrassegna i neutrofili colorati nell'area infartuata.

Esporta i risultati della quantificazione in un foglio di calcolo per dissociare il cervello in una singola sospensione cellulare. Dopo aver rimosso il cervello come appena dimostrato, sezionare il nucleo e le aree per infarto della corteccia omolaterale dal cervello di un topo ischemico cerebrale. Pesare il tessuto cerebrale e metterlo in cinque millilitri di RPMI ghiacciato per ogni richiesta di normalizzazione tra i gruppi sperimentali, quindi utilizzare un tritatessuti con pestelli di teflon per dissociare il tessuto in una singola sospensione cellulare.

Trasferire le sospensioni cellulari in una provetta per ultracentrifuga da 50 millilitri e aggiungere ai campioni altri cinque millilitri di RPMI per soluzione di chiamata. Quindi, dopo aver centrifugato, le sospensioni cellulari per 30 minuti a 7, 800 GS e 25 gradi Celsius. Assicurarsi che nella parte superiore della soluzione appaia uno strato di colore bianco corrispondente alla mielina.

Rimuovere con cautela lo strato di mielina e filtrare l'intera sospensione cellulare, comprese le cellule pellettate, attraverso un filtro a rete di nylon da 40 micrometri. Lavare il colino con 10 millilitri di RPMI per assicurarsi che tutte le cellule vengano filtrate attraverso la rete, quindi trasferire la soluzione in una provetta da 50 millilitri. Aggiungere 20 millilitri di RPMI alle cellule e poi, dopo aver centrifugato le cellule, risospendere il pellet di leucociti.

In un millilitro di PBS, incubare le cellule per due o tre minuti in quattro millilitri di tampone di lisi a temperatura ambiente per licitare gli eritrociti e poi far girare le cellule. Etichettare le cellule con 200 microlitri di PBS contenente l'1% di BSA e gli anticorpi appropriati su ghiaccio. Quindi, dopo 45 minuti, lavare i campioni con un millilitro di PBS freddo e Resus risospendere i pellet in 100 microlitri di tampone di flusso fax per l'analisi citofluorimetrica.

Questo modello è caratterizzato da volumi di infarto altamente riproducibili a 24 ore dopo l'occlusione dell'arteria cerebrale media, come stimato dal metodo Cavalieri. Nelle sezioni colorate in nial in accordo con studi precedenti, l'infiltrazione di neutrofili è direttamente correlata con la dimensione dell'infarto. Inoltre, l'isolamento dei leucociti e la caratterizzazione citofluorimetrica consentono l'isolamento delle cellule mieloidi dalla corteccia dell'emisfero lesionato IPS di topi ischemici, che comprendono dal 10 al 30% degli eventi totali trovati nella sospensione cellulare e presentano un basso parametro di dispersione diretta associato ai detriti cellulari.

Le cellule CD 11 B positive hanno un valore di dispersione diretta più elevato, suggerendo che i detriti cellulari non sono marcati con questo marcatore e, come precedentemente indicato, che possono essere esclusi da ulteriori analisi impostando la soglia FSC a 200 neutrofili caratterizzati come LY: sei cellule G positive sono la popolazione di cellule infiltrate più numerosa trovata a 24 ore dopo l'occlusione MCA nel cervello ischemico del topo utilizzando questo modello di ischemia cerebrale e comprendono dal 70 all'80% delle cellule CD 11 B positive CD 45 alte. Il resto delle cellule è per lo più una sottopopolazione di MC 11 B, CD 45 positivo, LY alto sei G, sei C negativo monociti pro-infiammatori, che si trovano in numero elevato nelle aree cerebrali ischemiche da 24 a 48 ore dopo l'occlusione dell'arteria cerebrale media. Questo modello P-M-C-A-O può essere eseguito in 30 minuti se eseguito correttamente Seguendo la procedura di citometria a flusso.

Altri metodi, come l'ordinamento di un sottoinsieme cellulare specifico, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive come quali sono i modelli di espressione, i cambiamenti metabolici o le attività acetiche delle cellule mieloidi in questo sistema modello. Dopo aver visto questo video solo per avere una buona comprensione di come creare un modello di ischemia e, soprattutto, come caratterizzare il numero e il fenotipo delle cellule mieloidi infiltranti con due diversi approcci in un modello di lesione cerebrale di topo o tpe dopo il modello di ischemia cerica.