Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da distrofia muscolare di pazienti: Efficient Riprogrammazione senza integrazione di origine urinaria Cells

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di generare in modo efficiente cellule staminali pluripotenti indotte o IPSC da pazienti con distrofia muscolare a partire da colture cellulari derivate dalle urine e da un metodo di riprogrammazione senza integrazione. Ciò si ottiene raccogliendo prima campioni di urina da pazienti con distrofia muscolare. In una seconda fase, le cellule urinarie vengono isolate ed espanse in colture cellulari derivate dalle urine.

Successivamente, le cellule derivate dall'urina vengono trasdotte con il virus Sendai contenente i fattori Yamanaka e le tipiche colonie pluripotenti emergono dopo 12 giorni. In definitiva, con il passaggio 13, lo stato libero da transgene delle cellule staminali pluripotenti può essere confermato dall'analisi R-T-P-C-R. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la riprogrammazione di fibroblasti cutanei isolati utilizzando vettori lentivirali è che con questa tecnica, le cellule somatiche possono essere ottenute in modo non invasivo dai pazienti e utilizzate per generare in modo efficiente le IPC utilizzando un metodo di riprogrammazione virale a impronta zero.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della distrofia muscolare, come ad esempio come queste condizioni possono essere modellate in vitro senza problemi di sicurezza per l'applicazione umana. A dimostrare le procedure saranno Mohammad Zishan Al, un collega post-dottorato Courtney Guesting, un tecnico, e Melanie Ryder, tutti e tre del mio laboratorio. Per raccogliere un campione di urina, iniziare consigliando al paziente di bere liquidi 30 minuti prima della raccolta per garantire che possano essere raccolti circa 30-40 millilitri di urina. Quando il paziente è pronto, consegnargli un kit per la raccolta delle urine contenente i seguenti elementi, istruzioni scritte su come ottenere servizi igienici antibatterici sterili o puliti e più umidi e una tazza sterile per la raccolta dei campioni da 100 millilitri.

Una volta raccolto il campione, posizionare immediatamente la tazza di raccolta sul ghiaccio e trasferire il campione in laboratorio in un refrigeratore. Quindi utilizzare pipette sterili per trasferire il campione di urina in provette da centrifuga sterili da 50 millilitri e centrifugare le provette a 400 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, in una cabina di sicurezza biologica BSL due aspirare tutto tranne l'ultimo, millilitro di surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet.

Quindi lavare le cellule in sette millilitri di tampone di lavaggio e centrifugare nuovamente le cellule. Questa volta aspirando tutto, tranne l'ultimo, circa 0,2-0,5 millilitri di surnatante. Ora riutilizza il pellet in due o tre millilitri di cellula progenitrice urinaria o terreno UPC e trasferisci la sospensione in quattro o sei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti non rivestita dopo 72 ore, integra la coltura con 0,5 millilitri di terreno UPC fresco per pozzetto.

Monitora la coltura per un periodo compreso tra i quattro e i sei giorni di incubazione. Dovrebbero iniziare a comparire piccole colonie da due a quattro cellule di cellule arrotondate o allungate, che rappresentano rispettivamente cellule epiteliali renali di tipo uno o due. Continuare a cambiare il mezzo ogni due o tre giorni.

Poiché le colonie subiranno una rapida fase di espansione a circa 9-15 giorni di coltura, le cellule dovrebbero essere confluenti all'80-90% a questo punto, dividere le cellule su due o quattro pozzetti di una piastra a 24 pozzetti per un'ulteriore espansione. Contrassegnando questa coltura come passaggio cellulare, le cellule urinarie possono quindi essere caratterizzate per marcatori specifici del lignaggio attraverso l'analisi citofluorimetrica, la colorazione immunoistochimica o attraverso la reazione a catena della polimerasi trascrittasi inversa per garantire una riprogrammazione ad alta efficienza a giorni prima del seme di trasduzione, 60.000 cellule per pozzetto. Da un passaggio uno a cinque colture in due pozzetti di una piastra a sei pozzetti il giorno zero.

Preparare il vettore di riprogrammazione Sendai aggiungendo ciascuno dei quattro fattori OSKM a un MLI appropriato per la riprogrammazione a un millilitro di terreno UPC di preriscaldamento, aspirare il terreno di sospensione e aggiungere lentamente la sospensione virale a un pozzetto delle cellule urinarie per i successivi sei giorni. Sostituire il surnatante ogni giorno con un terreno UPC fresco su piastra del quinto giorno MES trattato con semi di mitomicina su piastre di coltura quadrate da 100 millimetri rivestite di gelatina il sesto giorno. Dissociare le cellule urinarie con la tripsina, risospenderle in terreno UPC e pianarle a cinque volte 10 del quarto o due volte 10 del quinto cellulare per piastra di alimentazione della metanfetamina.

Il giorno successivo, sostituire il terreno UPC con uno stadio embrionale umano o terreno HES e monitorare le cellule al microscopio per osservare le cellule trasformate intorno ai 12-18 giorni. Dopo la trasduzione, le cellule dovrebbero formare aggregati clonali con una caratteristica morfologia a ciottoli e un rapporto nucleo/citoplasma più elevato. Per identificare i cloni IPSC riprogrammati, eseguire la colorazione con cellule vive per un anticorpo TRA 180 1.

Quindi utilizzare un ago da mezzo pollice calibro 26 per tratteggiare gli aggregati clonali positivi TRA 180 1 in quattro o sei piccoli pezzi di uguali dimensioni per clone. Successivamente, utilizzare una punta per pipetta sterile per prelevare e trasferire da 10 a 20 pezzi tratteggiati da più cloni in ciascun pozzetto Una piastra rivestita in matrigel a 24 pozzetti con HESC. Medio, da 24 a 48 ore dopo che i cloni riprogrammati sono stati placcati sulla superficie del matrigel.

Sostituire il supporto con un supporto IPSC. Utilizzare la punta di una pipetta per raschiare manualmente eventuali cellule differenziate o contaminanti cellule di alimentazione della metanfetamina per facilitare la purificazione dei cloni IPSC distrofici pluripotenti e completamente riprogrammati. Dopo che i cloni hanno raggiunto una dimensione di circa 100 micrometri, dissociare le cellule con EDTA per tre minuti, quindi placcare piccoli aggregati cellulari dell'IPSC distrofico riprogrammato, sospesi in terreno IPSC integrato con inibitore della chinasi RO su una piastra di 12 fogli rivestita di matrigel fresca.

Infine, confermare la pluripotenza di ciascun clone sia mediante analisi dell'espressione genica che mediante colorazione immunoistochimica. Per i marcatori pluripotenti, la maggior parte delle cellule isolate dalle urine umane sono positive per i marcatori progenitori e delle cellule staminali come CD 44, CD 73 e CD 1 46. Le cellule mostrano anche marcatori mesenchimali come l'alfa actina della muscolatura liscia e il mentone.

R-T-P-C-R delle cellule isolate fornisce la prova di una popolazione mista di cellule nelle colture. In questo c'è una debole espressione della citocheratina sette e dell'UIN uno A e tre marcatori a delle cellule euroepiteliali. Le cellule dell'urina si trasformano da cellule di tipo 2 allungate il giorno zero in un modello di ciottoli entro il quarto giorno di riprogrammazione.

Entro il 12° giorno, vengono osservati cloni pluripotenti tipici e sono in grado di mantenere la loro morfologia pluripotente in condizioni di assenza di alimentatore. La colorazione di cellule vive per TRA 180 1 può essere utilizzata per identificare i cloni riprogrammati. Per confermare la generazione di vettori e transgeni, cloni pluripotenti liberi, R-T-P-C-R può essere eseguito utilizzando primer contro il genoma del virus Sendai e ciascuno dei fattori OSKM esogeni.

L'espressione genica esogena non viene più rilevata dal passaggio 13, ma si può osservare una sovraregolazione dei fattori endogeni. La colorazione con immunofluorescenza conferma l'espressione di marcatori pluripotenti sulle IPC ma non sulle cellule urinarie. L'espressione della proteina e del gene della distrofina può quindi essere verificata mediante ulteriori colorazioni immunofluorescenti, western blotting e R-T-P-C-R, rispettivamente, come dimostrato da queste immagini rappresentative da un controllo wild type e da linee cellulari distrofiche.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere impiegata per ottenere una riprogrammazione libera di ucs. Entro poche settimane dopo questa procedura, possiamo differenziare gli IPC in cardiomiociti o miociti scheletrici al fine di approfondire i meccanismi alla base della distrofia muscolare.