Name: Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da distrofia muscolare di pazienti: Efficient Riprogrammazione senza integrazione di origine urinaria Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Impara a generare cellule staminali pluripotenti indotte da pazienti con distrofia muscolare utilizzando cellule urinarie e virus Sendai senza integrazione. Questo metodo non invasivo conferma lo stato privo di transgene al passaggio 13.

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Lo sviluppo di questo protocollo è stato supportato da Advancing a Healthier Wisconsin e dal National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, attraverso il numero di sovvenzione 8UL1TR000055. I suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni ufficiali del NIH.

NOTA: I pazienti e / oi loro tutori dovrebbero dare il consenso informato a partecipare a un Institutional Review Board ha approvato lo studio. 1. Tamponi e preparati media <ol><li> Tampone di lavaggio: Per preparare 100 ml di soluzione di lavaggio, aggiungere 1 ml di 100x penna / Soluzione strep (100 U / ml penicillina + 100 mg / ml di streptomicina) a 99 ml di soluzione fisiologica tampone fosfato (PBS). </li><li> Urinario cellule progenitrici (UPC) Media: Per preparare UPC media, mescolare volumi uguali di cheratinociti siero libero (KSF) Medium + Progenitor cellulare Medium. <ol><li> KSF Medium: Per preparare media dei cheratinociti, aggiungere 5 ng / ml di fattore di crescita epidermico (EGF), 50 ng / ml di estratto pituitario bovino (BPE), 30 ng / ml di tossina del colera, e la soluzione penna / strep (100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina) a 500 ml medie KSF. </li><li> Progenitor cellulare Medium: Aggiungere tre quarti di DMEM con un quarto dei mezzi Ham-F12 e integrare con il 10% FBS, 0,4 mg / ml idrocortisone, 0,1nM tossina del colera, 5 ng / ml di insulina, 1,8 x 10 -4 M adenina, 5 mg / ml di transferrina, 2 x 10 -9 M triiodo thyronine, 10 ng / ml EGF, e la penna / strep soluzione. </li></ol></li><li> hES Media: Aggiungi il 20% di sostituzione KO siero (K-SR), aminoacidi non essenziali 1x MEM, 2 mm L-glutammina, 100 micron β-mercaptoetanolo, 20 ng / ml bFGF e penna / strep a 400 ml DMEM / F12. </li></ol> 2. Campione di urine Collection <ol><li> Istruire i pazienti di bere liquidi 30 min prima della raccolta delle urine per garantire che una quantità adeguata (~ 30-40 ml) di urina possono essere raccolti. </li><li> Dare i pazienti e / o dei loro tutori un kit di raccolta delle urine, contenente i seguenti elementi: (1) istruzioni scritte su come ottenere campione di urina cattura sterile o pulite, (2) toilettes antibatteriche umide, e (3) un 100 ml sterile bicchiere di raccolta dei campioni. Informare i pazienti di raccogliere campioni. </li><li> Porre immediatamente i campioni di urina sul ghiaccio e trasferimento laboraTory in un dispositivo di raffreddamento. Processo immediatamente l&#39;urina per l&#39;isolamento delle cellule. Se il ritardo è inevitabile, conservare i campioni in ghiaccio per un massimo di 4 ore con una minima perdita di vitalità cellulare. </li></ol> 3. Isolamento ed espansione di cellule urina NOTA: eseguire le seguenti operazioni in condizioni di sterilità in un BSL2 Cappa di sicurezza biologica. <ol><li> Usando pipette sterili, i campioni di urina trasferimento sterilizzato provette da 50 ml. Centrifugare a 400 xg per 10 min a RT. </li><li> Aspirare il surnatante lasciando 1 ml nel tubo; fare attenzione a non disturbare il pellet. </li><li> Risospendere e combinare i pellets da più tubi in 7 ml di tampone di lavaggio e ripetere centrifugazione a 400 xg per 10 min a RT. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante, lasciando il pellet e ~ 0,2-0,5 ml di surnatante. Risospendere in 2-3 ml di urinario Progenitor cellulare (UPC) di medie e trasferire la sospensione in 4-6 pozzetti di una nonrivestito 24-pozzetti. </li><li> Dopo 72 ore, integrare la cultura con 0,5 ml di fresco UPC medie per bene e cambiare media ogni 2-3 giorni dopo. Gli eritrociti e cellule squamose che non si attaccano alla piastra saranno rimossi con il mezzo modifiche. </li><li> Monitorare cultura dopo 4-6 giorni. NOTA: Piccole 2-4 colonie di cellule inizieranno ad apparire. Le cellule saranno arrotondati o allungata, che rappresentano di tipo I o di tipo II di epiteliale renale (RE) le cellule rispettivamente 3. </li><li> Cambiare la media ogni 2-3 giorni dal momento che, una volta compaiono le cellule, che sarà oggetto di una fase di rapida espansione. </li><li> Una volta che le cellule raggiungono 80-90% di confluenza, circa 9-15 giorni dopo la placcatura, dissociare e il passaggio delle cellule (15,000-18,000 cellule / cm 2) sul 2-4 pozzetti di 24 pozzetti per un&#39;ulteriore espansione. Segna questo come cellulare di passaggio 1 (P1). </li><li> Caratterizzare cellule di urina per le specifiche lignaggio attraverso l&#39;analisi di citometria di flusso, immunohistochemcolorazione ical o tramite reazione inversa a catena transcriptasi-polimerasi (RT-PCR). </li><li> Riprogrammare cellule urina isolate (sezione 4) o congelare giù a congelamento (DMEM integrato con il 10% di siero e il 10% DMSO) per crioconservazione a lungo termine. </li></ol> 4. Urine Riprogrammazione cellulare Utilizzando Sendai Virus NOTA: La corretta gestione e l&#39;uso di DPI (dispositivi di protezione individuale) è raccomandato durante la manipolazione degli agenti trasfettando. Effettuare le seguenti operazioni in condizioni sterili in un BSL2 Biological Safety Cabinet. Il corretto smaltimento dei trasfezione cellule agente e / o transfettate si consiglia di evitare il rischio di pericoli per l&#39;ambiente e per la salute. Per urine riprogrammazione cellulare, utilizzare un Sendai Riprogrammazione Kit con modifiche al protocollo alimentatore-dipendente dal produttore, come descritto di seguito. <ol><li> Per garantire un&#39;elevata efficienza riprogrammazione utilizzando il Sendai, uso passaggi 1-5 di cellule di urina che sono rapidily dividendo. Se le cellule non replicano bene o diventano senescenti, disfarsene in quanto non riprogrammare in modo efficiente. </li><li> Seed 60.000 cellule per pozzetto in due pozzetti di una piastra 6 bene. Segna questo come giorno -2. Regolare la densità di semina delle cellule (5 x 4-9 OTTOBRE x 10 4 cellule per pozzetto) come necessario per raggiungere 80-90% di confluenza di giorno 0. </li><li> Il giorno 0 (48 ore dopo la placcatura le cellule), preparare i vettori di riprogrammazione Sendai (SEV) contenenti ciascuno dei quattro fattori OSKM. Aggiungere ognuno dei vettori a 1 ml di pre-riscaldato a medio UPC. Utilizzare un MOI di 1-1,5 (5-7.5 x 10 5 CIU), che è sufficiente per cellule urina riprogrammazione. Aspirare il medio e aggiungere lentamente il 1 ml UPC + SeV ad un pozzetto delle celle di urina. Utilizzare il secondo e il controllo negativo trasduzione. </li><li> Il giorno 1, sostituire il mezzo di UPC + SeV fresca media UPC. Alcuni morte cellulare è visto dopo 24 ore a causa di citotossicità virale. </li><li> A seconda dell&#39;efficienza di clon riprogrammatoe formazioni e la morfologia compatta, continuano a cambiare il mezzo di tutti i giorni fino al giorno 6 o 7. </li><li> Un giorno prima della dissociazione di cellule trasdotte (giorno 5 o 6), preparare piastre alimentatore MEF placcando mitomicina-C (10 ug / ml per 3 ore) trattati-MEF a densità di 5 x 10 4 cellule / cm 2, su 0.1 % di gelatina rivestito 100 mm 2 piatti di coltura. </li><li> Il giorno successivo (giorno 6 o 7), dissociare le cellule con 0,25% tripsina, risospendere le cellule in UPC medio e piastra 5 x 10 4 - Piastra alimentatore 2 x 10 5 cellule / 100 mm 2 MEF. </li><li> Il giorno seguente, passare hES medie e cambiare il mezzo ogni giorno. Osservare le cellule al microscopio per monitorare le cellule trasformate. NOTA: Le cellule formano aggregati clonali con morfologia caratteristica ciottoli e avere maggiore nucleo rapporto citoplasmatica (12-18 giorni dopo trasduzione). </li><li> Entro due o tre settimane dopo la trasduzione, raccogliere le colonie e il trasferimento di nuove piastre per clonespansione al. </li><li> Eseguire colorazione delle cellule in tempo reale per la selezione dei cloni IPSC incubando le cellule con TRA-1-81 anticorpi per 1 ora a 37 ° C in incubatore CO 2 seguita dal contatore colorazione con colorante fluorescente specifico anticorpo secondario coniugato per 1 ora a 37 ° C in incubatore CO 2. </li><li> Utilizzare un pollice G 1½ ago 26 a tratteggio incrociato più grandi TRA-1-81 positivi cloni IPSC in piccoli pezzi uguali dimensioni (4-6 pezzi per clone). </li><li> Utilizzare una pipetta punta sterile per raccogliere e trasferire 10-20 pezzi cross-nati da più cloni in tutti i pozzetti di Matrigel (10 mg / cm 2) Rivestiti 24 pozzetti con HES media. NOTA: Pezzi di un singolo clone placcato singolarmente in un unico pozzo non si espandono o mantenere pluripotenza. </li><li> Cambiare dal hES all&#39;IPSC medio 24-48 ore dopo i cloni riprogrammati sono attaccati alla superficie Matrigel. </li><li> Durante la manutenzione su piastre Matrigel rivestite, SCRA manualmentepe-off tutte le cellule differenziate o contaminanti cellule di alimentazione MEF con una pipetta punta ad arricchire per distrofici iPSC (MD-IPSC) cloni pienamente riprogrammate e pluripotenti. </li><li> Dopo i singoli cloni hanno raggiunto ~ 100 micron dimensioni, espandere i cloni dissociandosi con EDTA 0,48 mm (etilendiamminotetraacetico) soluzione per 3 min e placcatura piccoli aggregati di cellule di MD-iPSCs sospese in iPSC medio (integrato con 5 micron Y27632, Rho Kinase inibitore ) su Matrigel freschi (10 mg / cm 2) rivestito 12 pozzetti. Cambiare iPSC media giornaliera. </li><li> Riprogrammazione completa di ogni clone può essere determinata sia da analisi di espressione genica di geni OSKM e colorazione immunoistochimica di marcatori pluripotenza (Oct3 / 4 e TRA-1-81). Una valutazione rigorosa del potenziale pluripotenza dovrebbe essere impiegato per confermare le linee IPSC completamente riprogrammati in grado di differenziare in tre foglietti embrionali. Ciò può essere eseguito mediante corpo embrioide (EB) formazione e differenziazione dosaggio o terAtoma test formazione. </li></ol>

<ol><li>Guan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin-deficient+cardiomyocytes+derived+from+human+urine%3A+New+biologic+reagents+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery.</a> Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).</li>
<li>Dick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+Skipping+and+Gene+Transfer+Restore+Dystrophin+Expression+in+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Cardiomyocytes+Harboring+DMD+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations.</a> Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).</li>
<li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+the+new+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).</li>
<li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).</li>
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<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+derived+cells+are+a+potential+source+for+urological+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction.</a> J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).</li>
<li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells.</a> Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).</li>
<li>Malik, N., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+methods+for+human+iPSC+derivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A review of the methods for human iPSC derivation.</a> Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).</li>
<li>Nakanishi, M., Otsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Sendai+virus+vectors+and+their+potential+applications+in+gene+therapy+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine.</a> Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).</li>
<li>González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+nuclear+envelope+localization+of+dystrophin+Dp71+and+dystrophin-associated+proteins+%28DAPs%29+in+the+C2C12+muscle+cells%3A+DAPs+nuclear+localization+is+modulated+during+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis.</a> J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).</li>
<li>Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+dystrophin+Dp71+impairs+PC12+cells+cycle%3A+localization+in+the+spindle+and+cytokinesis+structures+implies+a+role+for+Dp71+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division.</a> PloS One. 6 (8), e23504(2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Modellazione malattie cardiovascolari utilizzando iPSCs sta diventando un approccio comune per capire il contributo genetico 4-6. Alcune difficoltà impreviste di ottenere campioni di cellule da pazienti, soprattutto bambini, possono essere evitati, offrendo la possibilità di un approccio non invasiva come una raccolta di urina. In questo giovane popolazione di pazienti, è spesso difficile raccogliere un volume di urina sufficiente per produrre cellule urina sufficiente per la riprogrammazione. Coaching i picc...

Cardiomiopatia è la seconda causa di morte nei pazienti con Duchenne e Becker distrofia muscolare (MD). Sebbene mutazioni nel gene della distrofina X-linked si verificano in 1: 3.500 nati maschi, si sa molto poco circa gli eventi molecolari e cellulari che portano alla progressiva danni muscolo cardiaco. Cellule staminali pluripotenti indotte umane derivate da pazienti distrofia muscolare sono emersi come un nuovo strumento per studiare i meccanismi della malattia sottostante e da utilizzare per lo screening di stupefacenti 1,2. Il disagio anticipata di biopsie cutanee o campioni di sangue possono dissuadere i pazienti giovani e / oi loro tutori a dare il consenso per la partecipazione allo studio. I campioni di urina sono una fonte non invasiva di cellule somatiche che sono modificabili a metodi di riprogrammazione. Abbiamo recentemente dimostrato che le cellule di urina raccolti da pazienti distrofia muscolare possono essere colta ed efficiente riprogrammati in iPSCs utilizzando trasduzione retrovirale con i fattori di Yamanaka (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, e c-Myc; OSKM) 1. Lo svantaggio di consegna del gene retrovirale è l&#39;integrazione casuale dei geni riprogrammazione nei cromosomi dell&#39;ospite. Per superare questo limite, abbiamo usato il Sendai non-integrazione per la riprogrammazione delle cellule urine. Dettagli Questo protocollo virus riprogrammazione Sendai di cellule di urina isolate da pazienti distrofia muscolare, che possono poi essere differenziati in cardiomiociti o altri tipi di cellule per ulteriori studi. Questo protocollo può anche essere adattato per altre malattie specifiche del paziente.

<table><tr><tbody><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>4 Oz. Tazza per campioni con coperchio</td><td>STL Medical Supply</td><td>M9AMSAS340</td><td>per la raccolta di campioni di urina</td></tr><tr><td>Provette BD-Falcon da 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Provette BD-Falcon da 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti rotondi</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>Kit di riprogrammazione CytoTune-iPS Sendai</td><td>Life Technologies</td><td>A1378-001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep senza glutammina&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Supplemento di B-27 con insulina (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Caldo in 37 gradi; C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Integratore B-27 senza insulina (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>0050129SA</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Versene, 1:5.000</td><td>Life Technologies</td><td>15040066</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>bFGF (10 &micro; g)</td><td>Life Technologies</td><td>13256-029</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Cartucce contacellule</td><td>Life Technologies</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum (500&nbsp; Tecnologie di</td> <td>vita</td><td>10828-028</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Congelamento di colture cellulari di recupero Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>Cheratinocita-SFM (1x), Liquid</td><td>Life Technologies</td><td>17005-042</td><td>Caldo in 37 gradi; C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>DMEM, glucosio alto, Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10566-016</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima</td></tr><tr><td>dell'uso Ham's F-12 Nutrient Mix&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11765-054</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>EGF proteina umana ricombinante, forma liquida</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0311L</td><td>caldo in 37 gradi C bagno d'acqua prima dell'uso</td></tr><tr><td>Insulina, ricombinante umano, zinco Soln</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>Caldo in 37 &deg; C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>TeSR-E8</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5940</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor (Y-27632)</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td> matrice <td>qualificata hESC, LVED</td></tr><tr><td>Free RNeasy Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Kit di sintesi iScript cDNA</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8890</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>FBS-Qualificato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Caldo in 37 gradi ... C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Bioreagente Adenina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2786-5G</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Tossina del colera da Vibrio cholerae</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8052-.5MG</td><td>Caldo in 37 &deg; C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888-1G</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Olo-transferrina da Sigma</td><td>Aldrich</td><td>T0665-50MG</td><td>umano caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>3,3',5-Triiodo-L-tironina sale sodico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6397-100MG</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-3598</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Aquous mount medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldeide</td><td>Alfa-Aesar</td><td>43368<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Antibodies</td></tr><tr><td>Mouse anti CD44 - marcato con FITC&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>560977</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti CD146 - marcato con PE</td><td>BD Biosciences</td><td>561013</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti CD73 - marcato con PE</td><td>BD Biosciences</td><td>561014</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-alfa;-actina muscolare liscia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2547</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-Vimentina</td><td>Abcam</td><td>ab8978-100</td><td></td></tr><tr><td>Topo Anti - TRA-1-81</td><td>Life Technologies</td><td>411100</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio anti 3/4 ottobre</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti distrofina</td><td>Leica Biosystems</td><td>NCL-DYSB</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da distrofia muscolare di pazienti: efficient riprogrammazione senza integrazione di origine urinaria cells

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Cardiomiopatia distrofico è una conseguenza poco conosciuta di distrofia muscolare. Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) di pazienti con distrofia muscolare è una fonte preziosa per cellulari in vitro sistemi modello di malattia in e può essere utilizzato per gli studi di screening di stupefacenti. Cellule urina paziente derivate sono stati utilizzati in riprogrammazione successo in cellule staminali pluripotenti indotte per modellare cardiomiopatia distrofica 1. Affrontare i problemi di sicurezza di integrazione di sistemi vettoriali, vi presentiamo un protocollo con un non-integrazione di Sendai virus vettore per la trasduzione di Yamanaka fattori in cellule di urina raccolti da pazienti affetti da distrofia muscolare. Questo protocollo genera completamente riprogrammato cloni entro 2-3 settimane. Le cellule pluripotenti sono esenti da vettore per il passaggio-13. Questi iPSCs distrofiche possono essere differenziati in cardiomiociti e utilizzati sia per studiare i meccanismi di malattia o per lo screening di stupefacenti.

La maggior parte delle cellule progenitrici isolate da urina umana sono positivi per uroepithelial progenitrici e periciti marcatori quali CD44, CD73 e CD146 (97.37%, 97.09% e 97,3% rispettivamente; la figura 1A e 1B). Queste cellule hanno espresso altri marcatori mesenchimali come alfa-actina del muscolo liscio e vimentina (Figura 1B). RT-PCR dà prova di una popolazione mista di cellule nelle culture che non è debole espressione di Cytokeratin-7 (CK-7) e Uroplakin (UP)...

Questo protocollo prevede procedure dettagliate per l'isolamento di cellule derivate dalle urine da pazienti con distrofia muscolare; la loro riprogrammazione efficiente e rapida attraverso la trasduzione del virus Sendai.

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da distrofia muscolare di pazienti: Efficient Riprogrammazione senza integrazione di origine urinaria Cells

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di generare in modo efficiente cellule staminali pluripotenti indotte o IPSC da pazienti con distrofia muscolare a partire da colture cellulari derivate dalle urine e da un metodo di riprogrammazione senza integrazione. Ciò si ottiene raccogliendo prima campioni di urina da pazienti con distrofia muscolare. In una seconda fase, le cellule urinarie vengono isolate ed espanse in colture cellulari derivate dalle urine.Successivamente, le cellule derivate dall'urina vengono trasdotte con il virus Sendai contenente i fattori Yamanaka e le tipiche colonie pluripotenti emergono dopo 12 giorni. In definitiva, con il passaggio 13, lo stato libero da transgene delle cellule staminali pluripotenti può essere confermato dall'analisi R-T-P-C-R. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la riprogrammazione di fibroblasti cutanei isolati utilizzando vettori lentivirali è che con questa tecnica, le cellule somatiche possono essere ottenute in modo non invasivo dai pazienti e utilizzate per generare in modo efficiente le IPC utilizzando un metodo di riprogrammazione virale a impronta zero.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della distrofia muscolare, come ad esempio come queste condizioni possono essere modellate in vitro senza problemi di sicurezza per l'applicazione umana. A dimostrare le procedure saranno Mohammad Zishan Al, un collega post-dottorato Courtney Guesting, un tecnico, e Melanie Ryder, tutti e tre del mio laboratorio. Per raccogliere un campione di urina, iniziare consigliando al paziente di bere liquidi 30 minuti prima della raccolta per garantire che possano essere raccolti circa 30-40 millilitri di urina. Quando il paziente è pronto, consegnargli un kit per la raccolta delle urine contenente i seguenti elementi, istruzioni scritte su come ottenere servizi igienici antibatterici sterili o puliti e più umidi e una tazza sterile per la raccolta dei campioni da 100 millilitri.Una volta raccolto il campione, posizionare immediatamente la tazza di raccolta sul ghiaccio e trasferire il campione in laboratorio in un refrigeratore. Quindi utilizzare pipette sterili per trasferire il campione di urina in provette da centrifuga sterili da 50 millilitri e centrifugare le provette a 400 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, in una cabina di sicurezza biologica BSL due aspirare tutto tranne l'ultimo, millilitro di surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet.Quindi lavare le cellule in sette millilitri di tampone di lavaggio e centrifugare nuovamente le cellule. Questa volta aspirando tutto, tranne l'ultimo, circa 0,2-0,5 millilitri di surnatante. Ora riutilizza il pellet in due o tre millilitri di cellula progenitrice urinaria o terreno UPC e trasferisci la sospensione in quattro o sei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti non rivestita dopo 72 ore, integra la coltura con 0,5 millilitri di terreno UPC fresco per pozzetto.Monitora la coltura per un periodo compreso tra i quattro e i sei giorni di incubazione. Dovrebbero iniziare a comparire piccole colonie da due a quattro cellule di cellule arrotondate o allungate, che rappresentano rispettivamente cellule epiteliali renali di tipo uno o due. Continuare a cambiare il mezzo ogni due o tre giorni.Poiché le colonie subiranno una rapida fase di espansione a circa 9-15 giorni di coltura, le cellule dovrebbero essere confluenti all'80-90% a questo punto, dividere le cellule su due o quattro pozzetti di una piastra a 24 pozzetti per un'ulteriore espansione. Contrassegnando questa coltura come passaggio cellulare, le cellule urinarie possono quindi essere caratterizzate per marcatori specifici del lignaggio attraverso l'analisi citofluorimetrica, la colorazione immunoistochimica o attraverso la reazione a catena della polimerasi trascrittasi inversa per garantire una riprogrammazione ad alta efficienza a giorni prima del seme di trasduzione, 60.000 cellule per pozzetto. Da un passaggio uno a cinque colture in due pozzetti di una piastra a sei pozzetti il giorno zero.Preparare il vettore di riprogrammazione Sendai aggiungendo ciascuno dei quattro fattori OSKM a un MLI appropriato per la riprogrammazione a un millilitro di terreno UPC di preriscaldamento, aspirare il terreno di sospensione e aggiungere lentamente la sospensione virale a un pozzetto delle cellule urinarie per i successivi sei giorni. Sostituire il surnatante ogni giorno con un terreno UPC fresco su piastra del quinto giorno MES trattato con semi di mitomicina su piastre di coltura quadrate da 100 millimetri rivestite di gelatina il sesto giorno. Dissociare le cellule urinarie con la tripsina, risospenderle in terreno UPC e pianarle a cinque volte 10 del quarto o due volte 10 del quinto cellulare per piastra di alimentazione della metanfetamina.Il giorno successivo, sostituire il terreno UPC con uno stadio embrionale umano o terreno HES e monitorare le cellule al microscopio per osservare le cellule trasformate intorno ai 12-18 giorni. Dopo la trasduzione, le cellule dovrebbero formare aggregati clonali con una caratteristica morfologia a ciottoli e un rapporto nucleo/citoplasma più elevato. Per identificare i cloni IPSC riprogrammati, eseguire la colorazione con cellule vive per un anticorpo TRA 180 1.Quindi utilizzare un ago da mezzo pollice calibro 26 per tratteggiare gli aggregati clonali positivi TRA 180 1 in quattro o sei piccoli pezzi di uguali dimensioni per clone. Successivamente, utilizzare una punta per pipetta sterile per prelevare e trasferire da 10 a 20 pezzi tratteggiati da più cloni in ciascun pozzetto Una piastra rivestita in matrigel a 24 pozzetti con HESC. Medio, da 24 a 48 ore dopo che i cloni riprogrammati sono stati placcati sulla superficie del matrigel.Sostituire il supporto con un supporto IPSC. Utilizzare la punta di una pipetta per raschiare manualmente eventuali cellule differenziate o contaminanti cellule di alimentazione della metanfetamina per facilitare la purificazione dei cloni IPSC distrofici pluripotenti e completamente riprogrammati. Dopo che i cloni hanno raggiunto una dimensione di circa 100 micrometri, dissociare le cellule con EDTA per tre minuti, quindi placcare piccoli aggregati cellulari dell'IPSC distrofico riprogrammato, sospesi in terreno IPSC integrato con inibitore della chinasi RO su una piastra di 12 fogli rivestita di matrigel fresca.Infine, confermare la pluripotenza di ciascun clone sia mediante analisi dell'espressione genica che mediante colorazione immunoistochimica. Per i marcatori pluripotenti, la maggior parte delle cellule isolate dalle urine umane sono positive per i marcatori progenitori e delle cellule staminali come CD 44, CD 73 e CD 1 46. Le cellule mostrano anche marcatori mesenchimali come l'alfa actina della muscolatura liscia e il mentone.R-T-P-C-R delle cellule isolate fornisce la prova di una popolazione mista di cellule nelle colture. In questo c'è una debole espressione della citocheratina sette e dell'UIN uno A e tre marcatori a delle cellule euroepiteliali. Le cellule dell'urina si trasformano da cellule di tipo 2 allungate il giorno zero in un modello di ciottoli entro il quarto giorno di riprogrammazione.Entro il 12° giorno, vengono osservati cloni pluripotenti tipici e sono in grado di mantenere la loro morfologia pluripotente in condizioni di assenza di alimentatore. La colorazione di cellule vive per TRA 180 1 può essere utilizzata per identificare i cloni riprogrammati. Per confermare la generazione di vettori e transgeni, cloni pluripotenti liberi, R-T-P-C-R può essere eseguito utilizzando primer contro il genoma del virus Sendai e ciascuno dei fattori OSKM esogeni.L'espressione genica esogena non viene più rilevata dal passaggio 13, ma si può osservare una sovraregolazione dei fattori endogeni. La colorazione con immunofluorescenza conferma l'espressione di marcatori pluripotenti sulle IPC ma non sulle cellule urinarie. L'espressione della proteina e del gene della distrofina può quindi essere verificata mediante ulteriori colorazioni immunofluorescenti, western blotting e R-T-P-C-R, rispettivamente, come dimostrato da queste immagini rappresentative da un controllo wild type e da linee cellulari distrofiche.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere impiegata per ottenere una riprogrammazione libera di ucs. Entro poche settimane dopo questa procedura, possiamo differenziare gli IPC in cardiomiociti o miociti scheletrici al fine di approfondire i meccanismi alla base della distrofia muscolare.

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Selezione e isolamento di colonie di cellule pluripotenti indotte umane staminali riprogrammato da fibroblasti adulti

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Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da distrofia muscolare di pazienti: Efficient Riprogrammazione senza integrazione di origine urinaria Cells (Video) | JoVE Journal

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da distrofia muscolare di pazienti: Efficient Riprogrammazione senza integrazione di origine urinaria Cells

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