Name: Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da distrofia muscolare di pazienti: Efficient Riprogrammazione senza integrazione di origine urinaria Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Impara a generare cellule staminali pluripotenti indotte da pazienti con distrofia muscolare utilizzando cellule urinarie e virus Sendai senza integrazione. Questo metodo non invasivo conferma lo stato privo di transgene al passaggio 13.

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Lo sviluppo di questo protocollo è stato supportato da Advancing a Healthier Wisconsin e dal National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, attraverso il numero di sovvenzione 8UL1TR000055. I suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni ufficiali del NIH.

NOTA: I pazienti e / oi loro tutori dovrebbero dare il consenso informato a partecipare a un Institutional Review Board ha approvato lo studio. 1. Tamponi e preparati media <ol><li> Tampone di lavaggio: Per preparare 100 ml di soluzione di lavaggio, aggiungere 1 ml di 100x penna / Soluzione strep (100 U / ml penicillina + 100 mg / ml di streptomicina) a 99 ml di soluzione fisiologica tampone fosfato (PBS). </li><li> Urinario cellule progenitrici (UPC) Media: Per preparare UPC media, mescolare volumi uguali di cheratinociti siero libero (KSF) Medium + Progenitor cellulare Medium. <ol><li> KSF Medium: Per preparare media dei cheratinociti, aggiungere 5 ng / ml di fattore di crescita epidermico (EGF), 50 ng / ml di estratto pituitario bovino (BPE), 30 ng / ml di tossina del colera, e la soluzione penna / strep (100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina) a 500 ml medie KSF. </li><li> Progenitor cellulare Medium: Aggiungere tre quarti di DMEM con un quarto dei mezzi Ham-F12 e integrare con il 10% FBS, 0,4 mg / ml idrocortisone, 0,1nM tossina del colera, 5 ng / ml di insulina, 1,8 x 10 -4 M adenina, 5 mg / ml di transferrina, 2 x 10 -9 M triiodo thyronine, 10 ng / ml EGF, e la penna / strep soluzione. </li></ol></li><li> hES Media: Aggiungi il 20% di sostituzione KO siero (K-SR), aminoacidi non essenziali 1x MEM, 2 mm L-glutammina, 100 micron β-mercaptoetanolo, 20 ng / ml bFGF e penna / strep a 400 ml DMEM / F12. </li></ol> 2. Campione di urine Collection <ol><li> Istruire i pazienti di bere liquidi 30 min prima della raccolta delle urine per garantire che una quantità adeguata (~ 30-40 ml) di urina possono essere raccolti. </li><li> Dare i pazienti e / o dei loro tutori un kit di raccolta delle urine, contenente i seguenti elementi: (1) istruzioni scritte su come ottenere campione di urina cattura sterile o pulite, (2) toilettes antibatteriche umide, e (3) un 100 ml sterile bicchiere di raccolta dei campioni. Informare i pazienti di raccogliere campioni. </li><li> Porre immediatamente i campioni di urina sul ghiaccio e trasferimento laboraTory in un dispositivo di raffreddamento. Processo immediatamente l&#39;urina per l&#39;isolamento delle cellule. Se il ritardo è inevitabile, conservare i campioni in ghiaccio per un massimo di 4 ore con una minima perdita di vitalità cellulare. </li></ol> 3. Isolamento ed espansione di cellule urina NOTA: eseguire le seguenti operazioni in condizioni di sterilità in un BSL2 Cappa di sicurezza biologica. <ol><li> Usando pipette sterili, i campioni di urina trasferimento sterilizzato provette da 50 ml. Centrifugare a 400 xg per 10 min a RT. </li><li> Aspirare il surnatante lasciando 1 ml nel tubo; fare attenzione a non disturbare il pellet. </li><li> Risospendere e combinare i pellets da più tubi in 7 ml di tampone di lavaggio e ripetere centrifugazione a 400 xg per 10 min a RT. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante, lasciando il pellet e ~ 0,2-0,5 ml di surnatante. Risospendere in 2-3 ml di urinario Progenitor cellulare (UPC) di medie e trasferire la sospensione in 4-6 pozzetti di una nonrivestito 24-pozzetti. </li><li> Dopo 72 ore, integrare la cultura con 0,5 ml di fresco UPC medie per bene e cambiare media ogni 2-3 giorni dopo. Gli eritrociti e cellule squamose che non si attaccano alla piastra saranno rimossi con il mezzo modifiche. </li><li> Monitorare cultura dopo 4-6 giorni. NOTA: Piccole 2-4 colonie di cellule inizieranno ad apparire. Le cellule saranno arrotondati o allungata, che rappresentano di tipo I o di tipo II di epiteliale renale (RE) le cellule rispettivamente 3. </li><li> Cambiare la media ogni 2-3 giorni dal momento che, una volta compaiono le cellule, che sarà oggetto di una fase di rapida espansione. </li><li> Una volta che le cellule raggiungono 80-90% di confluenza, circa 9-15 giorni dopo la placcatura, dissociare e il passaggio delle cellule (15,000-18,000 cellule / cm 2) sul 2-4 pozzetti di 24 pozzetti per un&#39;ulteriore espansione. Segna questo come cellulare di passaggio 1 (P1). </li><li> Caratterizzare cellule di urina per le specifiche lignaggio attraverso l&#39;analisi di citometria di flusso, immunohistochemcolorazione ical o tramite reazione inversa a catena transcriptasi-polimerasi (RT-PCR). </li><li> Riprogrammare cellule urina isolate (sezione 4) o congelare giù a congelamento (DMEM integrato con il 10% di siero e il 10% DMSO) per crioconservazione a lungo termine. </li></ol> 4. Urine Riprogrammazione cellulare Utilizzando Sendai Virus NOTA: La corretta gestione e l&#39;uso di DPI (dispositivi di protezione individuale) è raccomandato durante la manipolazione degli agenti trasfettando. Effettuare le seguenti operazioni in condizioni sterili in un BSL2 Biological Safety Cabinet. Il corretto smaltimento dei trasfezione cellule agente e / o transfettate si consiglia di evitare il rischio di pericoli per l&#39;ambiente e per la salute. Per urine riprogrammazione cellulare, utilizzare un Sendai Riprogrammazione Kit con modifiche al protocollo alimentatore-dipendente dal produttore, come descritto di seguito. <ol><li> Per garantire un&#39;elevata efficienza riprogrammazione utilizzando il Sendai, uso passaggi 1-5 di cellule di urina che sono rapidily dividendo. Se le cellule non replicano bene o diventano senescenti, disfarsene in quanto non riprogrammare in modo efficiente. </li><li> Seed 60.000 cellule per pozzetto in due pozzetti di una piastra 6 bene. Segna questo come giorno -2. Regolare la densità di semina delle cellule (5 x 4-9 OTTOBRE x 10 4 cellule per pozzetto) come necessario per raggiungere 80-90% di confluenza di giorno 0. </li><li> Il giorno 0 (48 ore dopo la placcatura le cellule), preparare i vettori di riprogrammazione Sendai (SEV) contenenti ciascuno dei quattro fattori OSKM. Aggiungere ognuno dei vettori a 1 ml di pre-riscaldato a medio UPC. Utilizzare un MOI di 1-1,5 (5-7.5 x 10 5 CIU), che è sufficiente per cellule urina riprogrammazione. Aspirare il medio e aggiungere lentamente il 1 ml UPC + SeV ad un pozzetto delle celle di urina. Utilizzare il secondo e il controllo negativo trasduzione. </li><li> Il giorno 1, sostituire il mezzo di UPC + SeV fresca media UPC. Alcuni morte cellulare è visto dopo 24 ore a causa di citotossicità virale. </li><li> A seconda dell&#39;efficienza di clon riprogrammatoe formazioni e la morfologia compatta, continuano a cambiare il mezzo di tutti i giorni fino al giorno 6 o 7. </li><li> Un giorno prima della dissociazione di cellule trasdotte (giorno 5 o 6), preparare piastre alimentatore MEF placcando mitomicina-C (10 ug / ml per 3 ore) trattati-MEF a densità di 5 x 10 4 cellule / cm 2, su 0.1 % di gelatina rivestito 100 mm 2 piatti di coltura. </li><li> Il giorno successivo (giorno 6 o 7), dissociare le cellule con 0,25% tripsina, risospendere le cellule in UPC medio e piastra 5 x 10 4 - Piastra alimentatore 2 x 10 5 cellule / 100 mm 2 MEF. </li><li> Il giorno seguente, passare hES medie e cambiare il mezzo ogni giorno. Osservare le cellule al microscopio per monitorare le cellule trasformate. NOTA: Le cellule formano aggregati clonali con morfologia caratteristica ciottoli e avere maggiore nucleo rapporto citoplasmatica (12-18 giorni dopo trasduzione). </li><li> Entro due o tre settimane dopo la trasduzione, raccogliere le colonie e il trasferimento di nuove piastre per clonespansione al. </li><li> Eseguire colorazione delle cellule in tempo reale per la selezione dei cloni IPSC incubando le cellule con TRA-1-81 anticorpi per 1 ora a 37 ° C in incubatore CO 2 seguita dal contatore colorazione con colorante fluorescente specifico anticorpo secondario coniugato per 1 ora a 37 ° C in incubatore CO 2. </li><li> Utilizzare un pollice G 1½ ago 26 a tratteggio incrociato più grandi TRA-1-81 positivi cloni IPSC in piccoli pezzi uguali dimensioni (4-6 pezzi per clone). </li><li> Utilizzare una pipetta punta sterile per raccogliere e trasferire 10-20 pezzi cross-nati da più cloni in tutti i pozzetti di Matrigel (10 mg / cm 2) Rivestiti 24 pozzetti con HES media. NOTA: Pezzi di un singolo clone placcato singolarmente in un unico pozzo non si espandono o mantenere pluripotenza. </li><li> Cambiare dal hES all&#39;IPSC medio 24-48 ore dopo i cloni riprogrammati sono attaccati alla superficie Matrigel. </li><li> Durante la manutenzione su piastre Matrigel rivestite, SCRA manualmentepe-off tutte le cellule differenziate o contaminanti cellule di alimentazione MEF con una pipetta punta ad arricchire per distrofici iPSC (MD-IPSC) cloni pienamente riprogrammate e pluripotenti. </li><li> Dopo i singoli cloni hanno raggiunto ~ 100 micron dimensioni, espandere i cloni dissociandosi con EDTA 0,48 mm (etilendiamminotetraacetico) soluzione per 3 min e placcatura piccoli aggregati di cellule di MD-iPSCs sospese in iPSC medio (integrato con 5 micron Y27632, Rho Kinase inibitore ) su Matrigel freschi (10 mg / cm 2) rivestito 12 pozzetti. Cambiare iPSC media giornaliera. </li><li> Riprogrammazione completa di ogni clone può essere determinata sia da analisi di espressione genica di geni OSKM e colorazione immunoistochimica di marcatori pluripotenza (Oct3 / 4 e TRA-1-81). Una valutazione rigorosa del potenziale pluripotenza dovrebbe essere impiegato per confermare le linee IPSC completamente riprogrammati in grado di differenziare in tre foglietti embrionali. Ciò può essere eseguito mediante corpo embrioide (EB) formazione e differenziazione dosaggio o terAtoma test formazione. </li></ol>

<ol><li>Guan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin-deficient+cardiomyocytes+derived+from+human+urine%3A+New+biologic+reagents+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery.</a> Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).</li>
<li>Dick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+Skipping+and+Gene+Transfer+Restore+Dystrophin+Expression+in+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Cardiomyocytes+Harboring+DMD+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations.</a> Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).</li>
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<li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+the+new+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).</li>
<li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).</li>
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<li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells.</a> Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).</li>
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<li>Nakanishi, M., Otsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Sendai+virus+vectors+and+their+potential+applications+in+gene+therapy+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine.</a> Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).</li>
<li>González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+nuclear+envelope+localization+of+dystrophin+Dp71+and+dystrophin-associated+proteins+%28DAPs%29+in+the+C2C12+muscle+cells%3A+DAPs+nuclear+localization+is+modulated+during+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis.</a> J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).</li>
<li>Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+dystrophin+Dp71+impairs+PC12+cells+cycle%3A+localization+in+the+spindle+and+cytokinesis+structures+implies+a+role+for+Dp71+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division.</a> PloS One. 6 (8), e23504(2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Modellazione malattie cardiovascolari utilizzando iPSCs sta diventando un approccio comune per capire il contributo genetico 4-6. Alcune difficoltà impreviste di ottenere campioni di cellule da pazienti, soprattutto bambini, possono essere evitati, offrendo la possibilità di un approccio non invasiva come una raccolta di urina. In questo giovane popolazione di pazienti, è spesso difficile raccogliere un volume di urina sufficiente per produrre cellule urina sufficiente per la riprogrammazione. Coaching i picc...

Cardiomiopatia è la seconda causa di morte nei pazienti con Duchenne e Becker distrofia muscolare (MD). Sebbene mutazioni nel gene della distrofina X-linked si verificano in 1: 3.500 nati maschi, si sa molto poco circa gli eventi molecolari e cellulari che portano alla progressiva danni muscolo cardiaco. Cellule staminali pluripotenti indotte umane derivate da pazienti distrofia muscolare sono emersi come un nuovo strumento per studiare i meccanismi della malattia sottostante e da utilizzare per lo screening di stupefacenti 1,2. Il disagio anticipata di biopsie cutanee o campioni di sangue possono dissuadere i pazienti giovani e / oi loro tutori a dare il consenso per la partecipazione allo studio. I campioni di urina sono una fonte non invasiva di cellule somatiche che sono modificabili a metodi di riprogrammazione. Abbiamo recentemente dimostrato che le cellule di urina raccolti da pazienti distrofia muscolare possono essere colta ed efficiente riprogrammati in iPSCs utilizzando trasduzione retrovirale con i fattori di Yamanaka (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, e c-Myc; OSKM) 1. Lo svantaggio di consegna del gene retrovirale è l&#39;integrazione casuale dei geni riprogrammazione nei cromosomi dell&#39;ospite. Per superare questo limite, abbiamo usato il Sendai non-integrazione per la riprogrammazione delle cellule urine. Dettagli Questo protocollo virus riprogrammazione Sendai di cellule di urina isolate da pazienti distrofia muscolare, che possono poi essere differenziati in cardiomiociti o altri tipi di cellule per ulteriori studi. Questo protocollo può anche essere adattato per altre malattie specifiche del paziente.

<table><tr><tbody><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>4 Oz. Tazza per campioni con coperchio</td><td>STL Medical Supply</td><td>M9AMSAS340</td><td>per la raccolta di campioni di urina</td></tr><tr><td>Provette BD-Falcon da 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Provette BD-Falcon da 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti rotondi</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>Kit di riprogrammazione CytoTune-iPS Sendai</td><td>Life Technologies</td><td>A1378-001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep senza glutammina&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Supplemento di B-27 con insulina (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Caldo in 37 gradi; C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Integratore B-27 senza insulina (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>0050129SA</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Versene, 1:5.000</td><td>Life Technologies</td><td>15040066</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>bFGF (10 &micro; g)</td><td>Life Technologies</td><td>13256-029</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Cartucce contacellule</td><td>Life Technologies</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum (500&nbsp; Tecnologie di</td> <td>vita</td><td>10828-028</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Congelamento di colture cellulari di recupero Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>Cheratinocita-SFM (1x), Liquid</td><td>Life Technologies</td><td>17005-042</td><td>Caldo in 37 gradi; C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>DMEM, glucosio alto, Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10566-016</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima</td></tr><tr><td>dell'uso Ham's F-12 Nutrient Mix&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11765-054</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>EGF proteina umana ricombinante, forma liquida</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0311L</td><td>caldo in 37 gradi C bagno d'acqua prima dell'uso</td></tr><tr><td>Insulina, ricombinante umano, zinco Soln</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>Caldo in 37 &deg; C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>TeSR-E8</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5940</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor (Y-27632)</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td> matrice <td>qualificata hESC, LVED</td></tr><tr><td>Free RNeasy Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Kit di sintesi iScript cDNA</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8890</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>FBS-Qualificato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Caldo in 37 gradi ... C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Bioreagente Adenina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2786-5G</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Tossina del colera da Vibrio cholerae</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8052-.5MG</td><td>Caldo in 37 &deg; C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888-1G</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Olo-transferrina da Sigma</td><td>Aldrich</td><td>T0665-50MG</td><td>umano caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>3,3',5-Triiodo-L-tironina sale sodico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6397-100MG</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-3598</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Aquous mount medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldeide</td><td>Alfa-Aesar</td><td>43368<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Antibodies</td></tr><tr><td>Mouse anti CD44 - marcato con FITC&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>560977</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti CD146 - marcato con PE</td><td>BD Biosciences</td><td>561013</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti CD73 - marcato con PE</td><td>BD Biosciences</td><td>561014</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-alfa;-actina muscolare liscia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2547</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-Vimentina</td><td>Abcam</td><td>ab8978-100</td><td></td></tr><tr><td>Topo Anti - TRA-1-81</td><td>Life Technologies</td><td>411100</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio anti 3/4 ottobre</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti distrofina</td><td>Leica Biosystems</td><td>NCL-DYSB</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da distrofia muscolare di pazienti: efficient riprogrammazione senza integrazione di origine urinaria cells

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Cardiomiopatia distrofico è una conseguenza poco conosciuta di distrofia muscolare. Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) di pazienti con distrofia muscolare è una fonte preziosa per cellulari in vitro sistemi modello di malattia in e può essere utilizzato per gli studi di screening di stupefacenti. Cellule urina paziente derivate sono stati utilizzati in riprogrammazione successo in cellule staminali pluripotenti indotte per modellare cardiomiopatia distrofica 1. Affrontare i problemi di sicurezza di integrazione di sistemi vettoriali, vi presentiamo un protocollo con un non-integrazione di Sendai virus vettore per la trasduzione di Yamanaka fattori in cellule di urina raccolti da pazienti affetti da distrofia muscolare. Questo protocollo genera completamente riprogrammato cloni entro 2-3 settimane. Le cellule pluripotenti sono esenti da vettore per il passaggio-13. Questi iPSCs distrofiche possono essere differenziati in cardiomiociti e utilizzati sia per studiare i meccanismi di malattia o per lo screening di stupefacenti.

La maggior parte delle cellule progenitrici isolate da urina umana sono positivi per uroepithelial progenitrici e periciti marcatori quali CD44, CD73 e CD146 (97.37%, 97.09% e 97,3% rispettivamente; la figura 1A e 1B). Queste cellule hanno espresso altri marcatori mesenchimali come alfa-actina del muscolo liscio e vimentina (Figura 1B). RT-PCR dà prova di una popolazione mista di cellule nelle culture che non è debole espressione di Cytokeratin-7 (CK-7) e Uroplakin (UP)...

Questo protocollo prevede procedure dettagliate per l'isolamento di cellule derivate dalle urine da pazienti con distrofia muscolare; la loro riprogrammazione efficiente e rapida attraverso la trasduzione del virus Sendai.

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da distrofia muscolare di pazienti: Efficient Riprogrammazione senza integrazione di origine urinaria Cells

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di generare in modo efficiente cellule staminali pluripotenti indotte o IPSC da pazienti con distrofia muscolare a partire da colture cellulari derivate dalle urine e da un metodo di riprogrammazione senza integrazione. Ciò si ottiene raccogliendo prima campioni di urina da pazienti con distrofia muscolare. In una seconda fase, le cellule urinarie vengono isolate ed espanse in colture cellulari derivate dalle urine.Successivamente, le cellule derivate dall'urina vengono trasdotte con il virus Sendai contenente i fattori Yamanaka e le tipiche colonie pluripotenti emergono dopo 12 giorni. In definitiva, con il passaggio 13, lo stato libero da transgene delle cellule staminali pluripotenti può essere confermato dall'analisi R-T-P-C-R. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la riprogrammazione di fibroblasti cutanei isolati utilizzando vettori lentivirali è che con questa tecnica, le cellule somatiche possono essere ottenute in modo non invasivo dai pazienti e utilizzate per generare in modo efficiente le IPC utilizzando un metodo di riprogrammazione virale a impronta zero.Questo metodo può aiut

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Vi presentiamo un protocollo efficace per la riprogrammazione di cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) che utilizzano vettori retrovirali codificanti Oct3 / 4, Sox2, Klf4 e c-myc (OSKM) e l'individuazione di hiPSC correttamente riprogrammata mediante colorazione dal vivo con Tra- 1-81 anticorpo.

Selezione e isolamento di colonie di cellule pluripotenti indotte umane staminali riprogrammato da fibroblasti adulti

I progenitori miogenici derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono promettenti candidati per le strategie di terapia cellulare per il trattamento delle distrofie muscolari. Questo protocollo descrive i trapianti e le misurazioni funzionali necessarie per valutare l'innesto e la differenziazione dei mesoangioblasti derivati dall'iPSC (un tipo di progenitori muscolari) nei modelli di topo di rigenerazione muscolare acuta e cronica.

Trapianto di progenitori miogenici pluripotenti derivati da cellule staminali indotte simili a mesoangioblasti nei modelli di topo di rigenerazione muscolare

Qui, descriviamo un protocollo basato su riprogrammazione epigenetica di cellule staminali embrionali umane (hESCs) verso generare una popolazione omogenea di progenitori muscolari scheletriche che in condizioni di coltura permissive formano cluster tridimensionali delle miofibre contrattili (myospheres), che ricapitolano caratteristiche biologiche umana muscoli scheletrici.

Generazione di Myospheres Da hESCs di epigenetica Riprogrammazione

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte fornisce prospettive affascinanti per la derivazione di trapianto autologo. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e laborioso ri-differenziazione impedisce ancora di traduzione clinica. Qui si descrive la derivazione di fibroblasti umani adulti e la loro conversione diretta in cellule progenitrici neurali indotte e la successiva differenziazione in linee neurali.

Derivazione di adulti fibroblasti umani e la loro conversione diretta in celle espandibile progenitrici neurali

Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) rappresentano una fonte di tessuti paziente-specifici per le applicazioni cliniche e di ricerca di base. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per riprogrammare le cellule umane mononucleari di sangue periferico (PBMNCs) ottenute da buffy coats congelati in iPSCs-virali gratuito utilizzando non integrano plasmidi episomiale.

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da congelata Buffy cappotti con non-integrazione episomiale Plasmidi

Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per la generazione efficiente di iPSC prive di integrazione da cellule del sangue periferico adulto umano. Con l'uso di quattro vettori episomiali basati su oriP/EBNA per esprimere i fattori di riprogrammazione, KLF4, MYC, BCL-XL o OCT4 e SOX2, è possibile ottenere migliaia di colonie di iPSC da 1 mL di sangue periferico.

Generazione di integrazione-liberi cellule staminali pluripotenti indotte dalle cellule mononucleari di sangue periferico umano Utilizzando episomiale Vettori

Qui, presentiamo un protocollo di eliminazione exon23 basato su Cas9 per ripristinare l'espressione distrofina in iPSC da fibroblasti cutanei derivati da mousemdx Dmd e differenziare direttamente gli iPSC in cellule progenitrici miogenie (MPC) utilizzando il sistema di attivazione Tet-on MyoD.

Tecnologia CRISPR/Cas9 nel ripristino dell'espressione della distrofina nei progenitori muscolari derivati da iPSC

Il protocollo presenta la riprogrammazione delle cellule mononucleari del sangue periferiche per indurre le cellule staminali neurali mediante l'infezione da virus Sendai, la differenziazione degli iNSC in neuroni dopaminergici, il trapianto di precursori DA nei precursori unilateralmente Modelli murini del morbo di Parkinson e valutazione della sicurezza e dell'efficacia dei precursori DA derivati da iNSC per il trattamento con LA PD.

Generazione di cellule staminali neurali indotte da cellule mononucleari periferiche e differenziazione verso i precursori dei neuroni dopaminergici per gli studi di trapianto

In questo articolo, descriviamo un protocollo dettagliato per la modellazione efficiente del muscolo della distrofia muscolare di Duchenne utilizzando cellule derivate da urina convertite a MYOD1per valutare il ripristino dei livelli di mRNA e proteine della distrofina dopo aver saltato l'esodio.

Esone Saltare in miotubi direttamente riprogrammati ottenuti da cellule derivate dall'urina umana

Questo protocollo descrive la conversione dei fibroblasti cutanei in mioblasti e la loro differenziazione in miotubi. Le linee cellulari sono derivate da pazienti con disturbi neuromuscolari e possono essere utilizzate per indagare meccanismi patologici e testare strategie terapeutiche.

Riprogrammazione diretta dei fibroblasti umani in mioblasti per indagare le terapie per i disturbi neuromuscolari

Il presente protocollo descrive un metodo per isolare, espandere e riprogrammare cellule derivate dall'urina di primati umani e non umani in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), nonché istruzioni per il mantenimento senza alimentatore delle iPSC appena generate.

Generazione e mantenimento di cellule staminali pluripotenti indotte da primati derivate dall'urina

Impara a generare cellule staminali pluripotenti indotte da pazienti con distrofia muscolare utilizzando cellule urinarie e virus Sendai senza integrazione. Questo metodo non invasivo conferma lo stato privo di transgene al passaggio 13.

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da distrofia muscolare di pazienti: Efficient Riprogrammazione senza integrazione di origine urinaria Cells (Video) | JoVE Journal

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da distrofia muscolare di pazienti: Efficient Riprogrammazione senza integrazione di origine urinaria Cells

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