Isolamento di distinte popolazioni cellulari dal cervelletto in via di sviluppo da Microdissection

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare specifiche popolazioni cellulari dal cervelletto in via di sviluppo. Ciò si ottiene prelevando prima il cervelletto da topi neonati portatori di proteine fluorescenti. Il secondo passo della procedura consiste nell'ottenere sezioni di tessuto vivo utilizzando un vibrato.

Il terzo passo consiste nel microsezionare lo strato germinale esterno del cervelletto sotto un microscopio da dissezione fluorescente. I passaggi finali consistono nel dissociare il tessuto in una singola sospensione cellulare e raccogliere le cellule mediante smistamento cellulare attivato fluorescente. In definitiva, i risultati possono mostrare che specifiche popolazioni cellulari possono essere isolate dal cervelletto.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la cattura laser, la microdissezione, è che le cellule sono vive e possono essere coltivate. Per ulteriori sperimentazioni Per questa procedura, sterilizzare gli strumenti chirurgici utilizzando un'autoclave. Prepara aros freschi o riscaldati al 3% a basso punto di fusione pronti per l'uso in un bagnomaria a 37 gradi Celsius.

Preparare le soluzioni necessarie per la dissociazione cellulare a base di papaia. Preparare nuovi terreni di coltura NBB 27. Quindi filtrare, sterilizzare e conservare in un'incubatrice.

Preparare il buffer fax e preparare i vetrini di copertura in polietilene. Vetrini copriente per autoclave di prima mano con 100 microgrammi di poli de lice per millilitro di acqua sterile. Quindi incubare i vetrini coprioggetti per due ore a 37 gradi Celsius o per una notte a temperatura ambiente.

Successivamente, lavare i vetrini coprioggetto con acqua distillata seguita da supporti NBB 27 prima di utilizzare i vetrini. Asciugateli completamente. Ci vorrà almeno un'ora prima di iniziare.

Preparare prima l'area di dissezione. Puliscilo con etanolo al 70%. Quindi coprirlo con un tampone assorbente.

In secondo luogo, rimuovere gli strumenti dalla busta di sterilizzazione e posizionarli per l'uso. Terzo, carica un piatto con DPBS sterile ghiacciato con striscia di penna all'1% e mettilo sul ghiaccio. Sezionare il cervello di un cucciolo di P 4 che esprime marcatori fluorescenti.

Quindi trasferiscilo nel piatto preparato di DPBS. Usa il forcipe per separare accuratamente il cervelletto dal resto del cervello. Questi cervelletti esprimono i marcatori matematici uno, GFP, e nidificano in CFP in cui l'EGL esprime GFP e lo strato molecolare è positivo per CFP.

Quindi, riempire uno stampo da inclusione a cubetti di due centimetri con la soluzione agro. Assicurati che non sia più caldo di 37 gradi Celsius. Raccogli un cervelletto con un cucchiaio perforato e asciugalo con un leggero tamponamento di tessuto.

Quindi, usando una pinza, inseriscilo nello stampo. Usa un ago per portare il cervelletto in orientamento verticale. Una volta che circa quattro vengono caricati nello stampo.

Metti lo stampo sul ghiaccio in modo che si solidifichi rapidamente usando una lama di rasoio. Tagliare il blocco per ridurre il tempo di sezionamento. Quindi incolla il blocco alla piastra orientata in modo che i cerelli siano verticali.

Caricare la vaschetta di riempimento con DPBS ghiacciato con reggia all'1% e mettere il ghiaccio sotto la vaschetta in modo che rimanga fredda. Ora seziona i blocchi con un vibratore. Tagliare e raccogliere sezioni da 600 micron.

Toglieteli dalla vaschetta del ghiaccio con un cucchiaio forato e trasferiteli in una pirofila ripiena A-D-P-B-S con ghiaccio. Al microscopio da dissezione fluorescente. Esamina le fette il più rapidamente possibile.

Separare con cura l'EGL dal resto della sezione cerebellare. Utilizzare una pinza fine per sezionare tra lo strato molecolare positivo per la CFP e l'EGL positivo per la GFP. Essere molto prudenti durante la microdissezione per evitare la contaminazione dalle regioni adiacenti.

Trasferire il tessuto EGL positivo alla GFP in un nuovo piatto riempito di DPBS con ghiaccio. Evitare di includere qualsiasi tessuto dello strato molecolare in quanto ciò contaminerebbe la coltura con nidificanti che esprimono la glia di Bergman. Quindi, rimuovere gli agro che circondano il tessuto EGL isolato.

L'EGL può ora essere dissociato utilizzando un protocollo basato su paan per una sospensione a singola cellula. Al termine, sospendere nuovamente le celle nel buffer fax. Procedere con la raccolta delle cellule CFP tramite fax.

Selezionali utilizzando un citometro ad alta velocità e un filtro CFP e inseriscili in un tampone fax ghiacciato. Si dovrebbero ottenere circa 100.000 NPS per cervelletto P quattro. Quindi centrifugare le celle raggruppate a 300 Gs per cinque minuti.

Sfrutta immediatamente le cellule per coltivarle. Sospenderli nel supporto NBB 27 di preriscaldamento. Quindi caricarli sui vetrini coprioggetti rivestiti in poli D lisina.

Le fette di cellula bella sono state preparate da P quattro matematica un nido GFP in topi CFP. L'EGL cerebellare conteneva principalmente GFP che esprimevano GMP e poteva essere facilmente separato dallo strato molecolare arricchito in glia che esprimono CFP. L'analisi dei fatti ha mostrato che oltre l'85% delle cellule nell'EGL erano GNP convenzionali. I NEP sono stati isolati dalle parti profonde dell'EGL mediante microdissezione, seguiti da fatti.

Queste cellule rappresentavano circa il 5% delle cellule nell'EGL per quattro giorni di coltivazione. I fatti isolati NPS hanno dato origine a neuroni che esprimono beta tubulina. Questa è una caratteristica delle cellule progenitrici neuronali ristrette al lignaggio.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di lavorare rapidamente e mantenere il tessuto sul ghiaccio il più possibile.