Name: Limmunoterapia sublinguale come alternativa di indurre una protezione contro le infezioni respiratorie acute (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 56 s
Description: Scopri l'immunoterapia sublinguale per potenziare la risposta immunitaria innata nei polmoni contro la polmonite pneumococcica letale nei topi. Questo metodo non invasivo offre un'alternativa sicura alla somministrazione intranasale.

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Ringraziamo il Dr. Jean-Claude Sirard del Centro per l'Infezione e l'Immunità di Lille, Istituto Pasteur de Lille-Francia, per aver gentilmente fornito la flagellina purificata e la Dr.ssa Teresa Camou, Direttore del Laboratorio Nazionale di Riferimento, Ministero della Salute dell'Uruguay per aver gentilmente fornito il ceppo pneumococcico. 
Gli autori desiderano esprimere il loro riconoscimento al Sig. Diego Acosta e al Sig. Ignacio Turel di BichoFeo Producciones-Uruguay per il loro impegno e il duro lavoro durante l'intera produzione ed edizione del video. 
Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni PR_FCE_2009_1_2783 e BE_POS_2010_1_2544 dall'Agenzia Nazionale per la Ricerca e l'Innovazione, ANII dall'Uruguay, dal Programma per lo Sviluppo delle Scienze di Base, dal PEDECIBA dell'Uruguay e dalla Commissione Settoriale per la Ricerca Scientifica, CSIC-Universidad de la República, Uruguay.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Somministrazione sublinguale di agenti terapeutici è stato dimostrato come un mezzo utile per modulare la risposta immunitaria nel tratto respiratorio. Il vantaggio principale della SLIT per il trattamento delle malattie respiratorie è che non comporta la consegna diretta dei composti nei polmoni o le narici, essendo più sicuro di trattamenti basati sulla somministrazione intranasale 31. Immunoterapia sublinguale può essere utilizzato per modulare la risposta immunitaria in modi diversi, sia per l&#39;induzione di risposte normative che possono migliorare i sintomi di infiammazione allergica e asma 32 o per indurre l&#39;attivazione transitoria dei meccanismi immunitari innati per trattare le infezioni polmonari acute come mostrato qui. Il modello di topo presentato in questo video è un metodo conveniente per lo screening di composti diversi, come agenti terapeutici per SLIT. Questo modello animale offre un utile mezzo per determinare l&#39;impattodella SLIT nella risposta immunitaria dei polmoni e in altri organi (ad es., linfonodi drenanti o siti mucose distali) che non può essere imitato con l&#39;uso di modelli in vitro. Anche se ci sono diversi documenti che descrivono i risultati ottenuti con l&#39;immunoterapia sublinguale, non sono stati resi ancora disponibili metodi dettagliati per le procedure di somministrazione sublinguale. Inoltre, il modello può essere utilizzato per la valutazione dei vaccini sublinguali inibitori a conferire protezione sistemica e locale nel tratto respiratorio. Come mostrato nel video allegato, la somministrazione sublinguale di composti è una procedura semplice che può essere facilmente eseguita senza la necessità di una formazione. In genere, una persona abile nella manipolazione degli animali richiede 1 ora per eseguire SLIT in un gruppo di 10 topi utilizzando anestetici iniettabili come descritto in questo protocollo. Se sfida pneumococco viene eseguita come pure, 90 min aggiuntivo sarà richiesto per prepararesospensione batterica ed effettuare intranasale sfida degli animali. I protocolli FACS qui presentati consentono comoda caratterizzazione dell&#39;impatto della SLIT nel sito locale di somministrazione, linfonodi, nonché i loro effetti sulla dinamica delle cellule dei polmoni. Analisi separata dei contenuti e del polmone broncoalveolare parenchima è importante per discriminare residente immunitario delle vie respiratorie &quot;e infiltrazione tipi di cellule da quelle che rimangono all&#39;interno del tessuto. L&#39;analisi del contenuto BAL consente lo studio del fatturato macrofagi alveolari nonché le dinamiche di cellule assunzione negli spazi alveolari indotte da trattamenti diversi, ad esempio., PMN, eosinofili, monociti. BAL può essere utilizzato anche per valutare la presenza di citochine e chemochine secrete da Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) o il rilevamento di anticorpi IgA secreti ottenuta dopo la vaccinazione sublinguale. Studio del tessuto dei polmonipermetterà la caratterizzazione di altri tipi di cellule, le cellule dendritiche in stile classico, le cellule T e le cellule B. Preparazione dei campioni BAL e linfonodi per l&#39;analisi FACS è semplice. Dopo la raccolta del campione, normalmente 60 minuti sono necessari per completare il protocollo di colorazione per 10-20 campioni. Al contrario, l&#39;isolamento di cellule da polmoni o tessuto sublinguale richiede più tempo in quanto è necessaria la digestione della matrice extracellulare. L&#39;assorbimento dell&#39;agente terapeutico consegnato da via sublinguale può essere affrontato il monitoraggio di molecole modo fluorescente o marcati radioattivamente utilizzando sistemi di imaging in vivo. Immunoterapia sublinguale è un metodo interessante per indurre efficacemente risposte immunitarie nel tratto respiratorio e sistemica che può essere usato per trattare o prevenire patologie respiratorie. Delucidazione dei meccanismi che determinano l&#39;attivazione vs tolleranza della risposta immunitaria nel tratto respiratorio dopo SLIT is cruciale per permettere progettazione razionale di nuove strategie terapeutiche che possono essere usati da soli o in combinazione con trattamenti contro patologie respiratorie diverse.

L'obiettivo generale di questo lavoro è illustrare i benefici dell'immunoterapia sublinguale per il trattamento delle infezioni respiratorie acute (ARI) e presentare i vantaggi di questa via di somministrazione rispetto ad altre vie di somministrazione, in particolare intranasale.
ARI causano milioni di morti ogni anno, specialmente nei bambini sotto i cinque anni. Lo Streptococcus pneumoniae rimane uno dei principali agenti eziologici della polmonite batterica nei neonati e negli anziani1,2. Ad oggi, il principale trattamento disponibile si basa sull'uso di antibiotici, ma i ceppi resistenti sono in continua crescita3,4.
SLIT induce ampie risposte a livello sistemico e anche mucoso, in particolare a livello del tratto respiratorio5. Ha dimostrato efficacia contro l'infezione influenzale, promuovendo una protezione a lungo termine con la produzione di risposte umorali e cellulari6,7. Inoltre, è stato dimostrato che il trattamento profilattico con lisati batterici somministrati per via sublinguale riduce le esacerbazioni della bronchite cronica ostruttiva negli anziani8 e previene le infezioni respiratorie ricorrenti nei bambini9. La SLIT è stata ampiamente utilizzata per il trattamento di allergie e asma. Gli studi clinici hanno dimostrato non solo la sua efficacia nel modulare la risposta immunitaria nel tratto respiratorio, ma anche la sua sicurezza10. Nonostante il crescente interesse delle aziende farmaceutiche e dei ricercatori per la SLIT, i meccanismi coinvolti nell'induzione delle risposte immunitarie della mucosa dopo la somministrazione sublinguale di composti rimangono oscuri. Recentemente, l'attenzione si è concentrata sui meccanismi che promuovono la tolleranza associati alla desensibilizzazione agli allergeni. È stato proposto che le cellule residenti e reclutate nella mucosa sublinguale, come le cellule dendritiche e i macrofagi, possano promuovere la tolleranza dopo SLIT11-13. Le cellule dendritiche della mucosa orale possono promuovere le cellule T helper11 che producono IFN-gamma e IL-10, oltre a ricircolare nella mucosa genitale distale e promuovere le cellule T CD8+ 14. Tuttavia, si sa poco sull'impatto della SLIT sulle cellule innate o sulla sua capacità di migliorare l'eliminazione dei patogeni durante le infezioni respiratorie acute.
Il controllo naturale dell'infezione da pneumococco nei polmoni dipende in gran parte dall'attivazione efficiente e rapida delle difese innate locali. In precedenza abbiamo dimostrato che il miglioramento dell'immunità innata dei polmoni con una singola dose intranasale di flagellina (FliC), un agonista di TLR5 e NLRC4, protegge il 75-100% dei topi sottoposti a test con una dose letale di un isolato clinico di Streptococcus pneumoniae sierotipo 1. È stato dimostrato che questa protezione dipende dal reclutamento locale di cellule GR1+ (probabilmente neutrofili polimorfonucleati, PMN) e non dipende da anticorpi, cellule B o T15. 
La flagellina è il componente strutturale del flagello batterico. Nella sua forma monomerica è riconosciuto da due recettori di riconoscimento dei patogeni (PRR), il TLR5 che rileva la FliC16 extracellulare e l'inflammasoma NLRC4/NAIP5 che rileva la flagellina intracellulare17,18. Quando la FliC viene rilevata dai PRR, viene innescata un'importante risposta infiammatoria. Noi e altri abbiamo dimostrato che l'instillazione di FliC purificato dal sierotipo Typhimurium di Salmonella enterica nei polmoni guida una rapida produzione di chemochine e citochine, specialmente quando riconosciute dall'epitelio polmonare che a sua volta orchestra il reclutamento di cellule immunitarie nelle vie aeree, principalmente PMN15,19-21. Sebbene transitoria, la sostanziale infiltrazione di neutrofili che avviene nelle vie aeree dopo la somministrazione nasale di FliC potrebbe essere un problema se ci si sposta verso terapie cliniche per uso umano. Un'infiammazione eccessiva potrebbe essere dannosa per la funzione polmonare. Inoltre, è stato dimostrato che la somministrazione intranasale di molecole immunostimolanti può causare paralisi facciale e/o tossicità cerebrale22-24. 
L'immunoterapia sublinguale offre un'alternativa più sicura per modulare la risposta immunitaria nel tratto respiratorio rispetto alla via intranasale. Non è invasivo, indolore, semplice e ha una buona compliance del paziente25. Inoltre, come accennato in precedenza, può indurre risposte protettive nella mucosa respiratoria senza i rischi associati alla somministrazione diretta intranasale o intrapolmonare di formulazioni. La via sublinguale potrebbe essere utilizzata in alternativa per fornire molecole che hanno grandi effetti sul sistema immunitario del polmone, ma che hanno dimostrato di essere tossiche o di provocare una grande infiammazione se somministrate per via intranasale. Oltre a questi vantaggi, le formulazioni per l'immunoterapia sublinguale hanno un costo di produzione inferiore poiché i prodotti non sterili possono essere somministrati per questa via e lo shock endotossico non è un problema per la SLIT. D'altra parte, vale la pena notare che dosi più elevate dei composti immunostimolatori rispetto a quelle utilizzate per via intranasale o parenterale sono necessarie per indurre una risposta immunitaria nei polmoni; anche quando si utilizza il modello murino di SLIT sono necessarie soluzioni altamente concentrate poiché il sito anatomico in cui vengono depositate le formulazioni è piccolo. 
Sulla base dei nostri dati pubblicati in precedenza, abbiamo sviluppato un modello di protezione utilizzando l'immunoterapia sublinguale con flagellina come immunostimolante modello. Abbiamo dimostrato che una singola dose di flagellina ha indotto una sopravvivenza del 60% contro la polmonite pneumococcica invasiva causata dal ceppo sierotipo 1, mentre tutti i topi del gruppo di controllo sono morti di infezione entro 5 giorni. L'analisi della citometria a flusso ha mostrato che un numero maggiore di PMN viene reclutato nelle vie aeree di animali protetti dopo il trattamento sublinguale con flagellina, suggerendo che queste cellule potrebbero essere coinvolte nel meccanismo di protezione indotto dall'immunoterapia sublinguale. 
Questo video mostra in dettaglio come eseguire l'immunoterapia sublinguale e anche come recuperare il tessuto rilevante dalla mucosa sublinguale, drenando i linfonodi, nonché i polmoni e le vie aeree per eseguire ulteriori analisi. Inoltre, illustra la tecnica generale di preparazione delle cellule per l'analisi FACS e mostra brevemente come preparare le sospensioni di Streptococcus pneumoniae e come eseguire infezioni intranasali nel topo per impostare il modello di infezione acuta.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di ketamina (50 mg/ml)</td><td>Pharma Service, Uruguay</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di xilacino (2 %)</td><td>Portinco S.A., Uruguay</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringa sterile da 1 ml</td><td>Modern, Uruguay</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Ago da 27 G</td><td>Modern, Uruguay</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>General Electric Health Care</td><td>E15885</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>ATCC</td><td>302020</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina/streptomicina</td><td>SIGMA</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>PBS sterile senza Ca2+/Mg2+</td><td>PAA</td><td>H21002</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo I</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>desossiribonucleasi I (DNAsi-I)</td><td>SIGMA</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>Dispasi</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 ratto coniugato anti topo IgG2b anti CD11b</td><td>BD</td><td>550993</td><td>Clone M1/70</td></tr><tr><td>APC criceto coniugato anti topo IgG1 anti CD11c</td><td>BD</td><td>550261</td><td>Clone HL3&nbsp;</td></tr><tr><td>APC-Cy7 coniugato ratto anti topo IgG2a anti Ly6G</td><td>BD</td><td>560600</td><td>Clone 1A8</td></tr><tr><td>Soluzione salina sterile</td><td>Laboratorio Farmaco Uruguayo, Uruguay</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Agar</td><td>BD Difco, France</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>Sangue di pecora defibrato</td><td>Biokey, Uruguay</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri sterili</td><td>Greiner</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>p10 Pipetta</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>p20 Pipetta</td><td>Eppendorf</td><td>3120000097</td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipetta</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipetta</td><td>Capp</td><td>C200</td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipetta</td><td>Eppendorf</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Pipetta</td><td>Eppendorf</td><td>3120000062</td><td></td></tr><tr><td>Puntali con filtro sterile p10</td><td>Greiner</td><td>771288</td><td></td></tr><tr><td>Punte filtranti sterili p200</td><td>Greiner</td><td>739288</td><td></td></tr><tr><td>Punte filtranti sterili p1000</td><td>Greiner</td><td>750288</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>BIOSAN</td><td>V1-plus</td><td></td></tr><tr><td>Pinze a punta fine in acciaio inossidabile&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>Z168785/Z168777</td><td>Pinze per</td></tr><tr><td>tessuti per medicazione</td> curve e diritte <td>SIGMA</td><td>F4392</td><td>Lunghezza 8 pollici</td></tr><tr><td>Pinze per micro-dissezione</td><td>SIGMA</td><td>F4017</td><td>Dritto&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinza per microdissezione</td><td>SIGMA</td><td>F4142&nbsp;</td><td>curvo</td></tr><tr><td>Forbici Mayo</td><td>SIGMA</td><td>Z265993&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>SAKIRA MEDICAL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punzone per biopsia sterile & Oslash; 3mm</td><td>Stiefel Laboratories Ltd.</td><td>2079D</td><td>Tubo</td></tr><tr><td>sterile da 1,5 ml</td> con diametro 5 mm <td>Tubo Deltalab</td><td>200400P</td><td></td></tr><tr><td>Tubo sterile da 15 ml</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Tubo da 50 ml</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche sterili da 5 ml</td><td>Greiner</td><td>606160</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche sterili da 10 ml</td><td>Greiner</td><td>607160</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche sterili 25 ml</td><td>Greiner</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>Cabina di sicurezza biologica, classe II</td><td>Thermo Scientific</td><td>serie 1300, tipo A2</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Isolatore Cremagliera</td><td>RAIR&nbsp; IsoSystem&nbsp;</td><td>76144W</td><td>Super&nbsp; Topo&nbsp; 1800 AllerZone&nbsp;</td></tr><tr><td>Microcentrifuga refrigerata</td><td>Eppendorf</td><td>Legend Micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Heraeus</td><td>Biofuge-pico</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorval ST40R</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubatore&nbsp;</td><td>Modello Thermo Scientific</td><td>&nbsp; 3111</td><td></td></tr><tr><td>Pipette pasteur sterili a punta sottile</td><td>Pipette</td> pasteur sterili <td>Deltalab D210022</td><td></td></tr><tr><td>Piastra sterile a 24 pozzetti</td><td>Deltalab</td> 200007 <td></td> Greiner 662160 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Soluzione blu di tripano&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>Contatore automatico di celle T10282</td><td></td></tr><tr><td>- Countess</td><td>Life Technologies</td><td>C10227&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Chamber Vetrini Life</td><td>Technologies</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Provette per citometria a flusso</td><td>BD</td><td>343675</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso - FACS Canto-II</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strumento PCR in tempo reale - Rotor Gene Q o ABI 7900</td><td>Qiagen / Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagente Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>Molecolare Grado di biologia</td></tr><tr><td>DNAse-I</td><td>Life Technologies</td><td>18068-015</td><td>Grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td>DNAse-I Buffer 10X</td><td>Life Technologies</td><td>18068015</td><td>Grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td>EDTA 25 mM</td><td>Life Technologies</td><td>18068015</td><td>Grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td>Acqua ultrapura</td><td>Life Technologies</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>RNAse di grado di</td> biologia molecolare<td>Life Technologies</td><td>100000840</td><td>Primer</td></tr> per <tr><td>esameri casuali</td> di grado di biologia molecolare Life <td>Technologies</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>tampone M-MLV-RT</td> di grado di biologia molecolare Life <td>Technologies</td><td>18057-018</td><td>enzima di biologia molecolare</td></tr><tr><td>di grado M-MLV-RT Life</td><td>Technologies</td><td>28025-021</td><td></td></tr><tr><td>Kit di PCR verde QuantiTect Syber di</td> grado di biologia molecolare <td>Qiagen</td><td>204143</td><td>Primer specifici per il grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Grado di biologia molecolare</td> Life <td>Technologies</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;immunoterapia sublinguale come alternativa di indurre una protezione contro le infezioni respiratorie acute

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

La via sublinguale è stata ampiamente utilizzata per fornire piccole molecole nel flusso sanguigno e per modulare la risposta immunitaria in diversi siti. È stato dimostrato che induce efficacemente risposte umorali e cellulari nei siti sistemici e mucosi, vale a dire i polmoni e il tratto urogenitale. La vaccinazione sublinguale può favorire la protezione contro le infezioni delle vie respiratorie inferiori e superiori; Può anche promuovere la tolleranza agli allergeni e migliorare i sintomi dell'asma. La modulazione della risposta immunitaria polmonare mediante immunoterapia sublinguale (SLIT) è più sicura della somministrazione diretta di formulazioni per via intranasale perché non richiede la somministrazione di molecole potenzialmente dannose direttamente nelle vie aeree. A differenza della somministrazione intranasale, gli effetti collaterali che coinvolgono la tossicità cerebrale o la paralisi facciale non sono promossi dalla SLIT. I meccanismi immunitari alla base della SLIT rimangono sfuggenti e il suo uso per il trattamento delle infezioni polmonari acute non è stato ancora esplorato. Pertanto, è necessario lo sviluppo di modelli animali appropriati di SLIT per esplorare ulteriormente i suoi potenziali vantaggi. 
Questo lavoro mostra come eseguire la somministrazione sublinguale di agenti terapeutici nei topi per valutare la loro capacità di proteggere dalla polmonite pneumococcica acuta. Vengono illustrati gli aspetti tecnici della manipolazione del topo durante l'inoculazione sublinguale, l'identificazione precisa della mucosa sublinguale, il drenaggio dei linfonodi e l'isolamento dei tessuti, il lavaggio broncoalveolare e i polmoni. I protocolli per la preparazione di sospensioni a singola cellula per l'analisi FACS sono descritti in dettaglio. Vengono discusse altre applicazioni a valle per l'analisi della risposta immunitaria. Vengono inoltre spiegati gli aspetti tecnici della preparazione dell'inoculo di Streptococcus pneumoniae e della provocazione intranasale dei topi.
SLIT è una tecnica semplice che consente lo screening di molecole candidate per modulare la risposta immunitaria dei polmoni. I parametri che influenzano il successo della SLIT sono legati alle dimensioni molecolari, alla suscettibilità alla degradazione e alla stabilità di formulazioni altamente concentrate.

Immunoterapia sublinguale può essere utilizzato con successo per modulare la risposta immunitaria polmoni. Abbiamo mostrato che una singola dose di flagellina, l'agonista TLR5 e NLRC4, può indurre significativo sovraregolazione del mRNA codificante la CXCL1 chemochine, CCL20 e la citochina IL-6 rispetto ai controlli trattati con soluzione salina. Fold induzione di livelli di mRNA alzato a 8 ore dopo SLIT e tornare ai livelli basali dopo 20 ore (Figura 1). Tuttavia, quando la SLIT è stata effettuata 2 ore prima infezione intranasale con S. Pneumoniae, i livelli di CXCL1 e IL6 mRNA rimasero sovraregolati significativamente anche 24 ore dopo SLIT rispetto agli animali non trattati (Figura 2). Analisi delle popolazioni cellulari in BAL e tessuto polmonare mediante FACS rivelato che gli animali trattati con FLIC per via sublinguale avevano aumentato numero di neutrofili nelle vie aeree, ma non nel tessuto dei polmoni (Figura 3). <p class='"jove_content"&gt;' infine la sopravvivenza dopo sfida pneumococcica stato confrontato in animali precedentemente trattati con flic per via sublinguale o soluzione salina come controllo. mostrato>Figura 4, SLIT con flagellin promosso protezione e aumentato la sopravvivenza contro la polmonite pneumococcica acuta. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6.7in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig1highresV2.jpg" width="680"> Figura 1: Cinetica di profilo trascrizionale dei polmoni dopo immunoterapia sublinguale con flagellina. Otto a 10 settimane di età topi BALB / c (n = 4) sono stati trattati con 10 mg di flagellin o soluzione salina per via sublinguale sotto anestesia. I polmoni sono stati raccolti in diversi momenti e posti in conservante acido nucleico. Estrazione di RNA totale è stato eseguito e cDNA è stato sintetizzato. livelli di mRNA sono stati valutati mediante real time PCR usando primer specifici elencati in Tabl1 e quantificazione relativa è stata eseguita secondo il metodo ΔCt utilizzando i livelli ACTB mRNA per la normalizzazione. I risultati sono mostrati come volte maggiore rispetto al gruppo trattato con soluzione salina come mediana ± SEM. Gli asterischi indicano differenze statisticamente significative (p &lt;0.05) calcolati in base al test di Mann-Whitney. I risultati sono rappresentativi di 2 esperimenti indipendenti. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6.2in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig2highresV2.jpg" width="660"> Profilo trascrizionale Figura 2 polmoni durante la polmonite pneumococcica dopo immunoterapia sublinguale con flagellina. Otto a 10 settimane i topi BALB / c (n = 4 per il gruppo di controllo e n = 7 per il gruppo trattato) sono stati trattati con 10 mg di flagellin o soluzione salina da via sublinguale sotto anestesia. 2 ore più tardi topi sono stati sfidati per via intranasale con la dose letale minima (MLD) causando 100% di mortalità di un isolato clinico di S. pneumoniae sierotipo 1 E1585, corrispondente a 4x10 5 CFU / 50 microlitri. I polmoni sono stati raccolti 24 ore dopo la sfida e conservati in conservante acido nucleico finché sono stati eseguiti estrazione di RNA e cDNA sintesi. Real time PCR è stata effettuata (vedi elenco in fondo Tabella 1) e relativa quantificazione è stata eseguita secondo il metodo ΔCt utilizzando i livelli ACTB mRNA per la normalizzazione. I risultati sono mostrati come volte maggiore rispetto al gruppo trattato con soluzione salina come mediana ± SEM. Gli asterischi indicano differenze statisticamente significative (p &lt;0.05) calcolati in base al test di Mann-Whitney. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig3highresV2.jpg" width="680"> Figura 3 Analisi dei polimorfonucleati neutrofili (PMN) reclutamento nel tessuto e le vie respiratorie polmoni dopo SLIT. Eight di10 settimane topi BALB / c (n = 4) sono stati trattati con 10 mg di flagellin o soluzione salina per via sublinguale sotto anestesia. 2 ore più tardi topi sono stati sfidati per via intranasale con la MLD di S. pneumoniae sierotipo 1 E1585. 24 ore dopo la sfida, BAL è stata eseguita e polmoni sono stati elaborati per l'analisi FACS. PMN sono stati identificati come cellule CD11b Ly6G alta / alta / CD11c negativi e basato sul profilo FCS-SSC. I risultati sono espressi come percentuale di PMN rispetto di numero di cellule totali in BAL o polmoni. Barre rappresentano mediana ± SEM. Gli asterischi indicano differenze statisticamente significative (p &lt;0.05) calcolati secondo senso unico test di Mann-Whitney. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5.3in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig4highresV2.jpg" width="530"> Figura 4 SLIT con flagellin protegge i topi contro la polmonite pneumococcica acuta. S. pneumoniae sierotipo 1 E1585. La sopravvivenza è stata valutata su base giornaliera. Le curve di Kaplan-Meier sono stati confrontati in base Log-rank (Mantel-Cox) test. Gli asterischi indicano differenze statisticamente significative (p &lt;0,05) .Results sono rappresentativi di 2 esperimenti indipendenti. <table align="center" border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody align="center"><tr><td> Nome </td><td> Sequenza 5'-3 ' </td><td> PCR lunghezza del prodotto (bp) </td></tr><tr><td> mB-actin_F </td><td> GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT </td><td rowspan="2"> 68 </td></tr><tr><td> mB-actin_R </td><td> CGTCATCCATGGCGAACTG </td></tr><tr><td>mCCL20_F </td><td> TTTTGGGATGGAATTGGACAC </td><td rowspan="2"> 69 </td></tr><tr><td> mCCL20_R </td><td> TGCAGGTGAAGCCTTCAACC </td></tr><tr><td> mCXCL1_F </td><td> CTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA </td><td rowspan="2"> 84 </td></tr><tr><td> mCXCL1_R </td><td> ACGGTGCCATCAGAGCAGTCT </td></tr><tr><td> mIL-6_F </td><td> GTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA </td><td rowspan="2"> 78 </td></tr><tr><td> mIL-6_R </td><td> AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA </td></tr><tr><td> mTNFalpha_F </td><td> CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA </td><td rowspan="2"> 63 </td></tr><tr><td> mTNFalpha_R </td><td> CCTCCACTTGGTGGTTTGCT </td></tr><tr><td> mCxcl2_F </td><td> CCCTCAACGGAAGAACCAAA </td><td rowspan="2"> 72 </td></tr><tr><td> mCxcl2_R </td><td> CACATCAGGTACGATCCAGGC </td></tr></tbody></table> Tabella 1 Lista Primer utilizzati per real time PCR. Sequenze di primer specifiche utilizzate per l'analisi qPCR. Avanti e indietro primer per il mouse ACTB, Cccl20, CXCL1, IL6, TNFa e CXCL1 sono presentati come sequenze 5'-3 'e la durata prevista del prodotto è indicato in paia di basi (bp).

Il presente lavoro illustra la convenienza dell'uso dell'immunoterapia sublinguale per aumentare la risposta immunitaria innata nei polmoni e conferire protezione contro la polmonite pneumococcica acuta nel topo.

L&#39;immunoterapia sublinguale come alternativa di indurre una protezione contro le infezioni respiratorie acute

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare l'immunoterapia sublinguale per aumentare la risposta immunitaria innata nei polmoni e favorire la protezione contro la polmonite pneumococcica letale. Nel topo, il primo passo consiste nella somministrazione di una soluzione con l'agente immunostimolante flag nella mucosa sublinguale del topo anestetizzato. Quindi una sospensione contenente una dose letale di un ceppo genico di polmonite da streptococco viene instillata dalla radice intranasale a topi anestetizzati precedentemente trattati con flatline o soluzione salina come controllo.La lage bronco-bilare viene eseguita per analizzare la sottopopolazione che si infiltra nelle vie aeree e il tessuto polmonare viene processato per ottenere una sospensione a singola cellula per la caratterizzazione fenotipica della popolazione cellulare. Con la citometria a flusso multiparametrica mandibolare, è possibile elaborare anche un linfonodo mandibolare accessorio e il tessuto sublinguale per eseguire la citometria a flusso o altre analisi a valle. Popolazioni cellulari che si infiltrano nelle vie aeree.I polmoni o la mucosa sublinguale possono essere identificati mediante fenotipizzazione immunitaria e citometria a flusso multiparametrica L'attivazione immunitaria in diversi tessuti dopo immunoterapia sublinguale può essere analizzata anche studiando il profilo trascrizionale mediante PCR in tempo reale. Benvenuti al Laboratorio per la Ricerca sui Vaccini presso il Dipartimento di Biotecnologia, stiamo assegnando la scuola di medicina, università di U.Uno degli interessi principali del nostro laboratorio è quello di generare nuove strategie di intervento immunitario contro le infezioni respiratorie. La via interna è stata utilizzata con successo per la somministrazione di agenti immunostimolatori per trattare o prevenire l'infezione polmonare o una diversa teologia.Abbiamo dimostrato che la somministrazione intranasale, il componente del gel batterico, può essere efficacemente utilizzata per interrompere l'infezione polmonare in corso causata dai topi STO. Sebbene la radice intranasale richieda normalmente una bassa dose dell'agente terapeutico e induca una forte risposta nel tratto respiratorio, presenta alcuni inconvenienti come la possibilità di tossicità del sistema nervoso centrale e la paralisi facciale associata all'assorbimento di composti immunostimolatori attraverso i nervi oratori. Quindi, abbiamo messo a punto un modello di immunoterapia UAL come alternativa per indurre un'immunità protettiva contro la polmonite pneumococcica.L'immunoterapia sublinguale offre un'alternativa più sicura rispetto all'installazione intranasale. È non invasivo, indolore e semplice. Sebbene possa richiedere dosi più elevate di un agente terapeutico, può essere utilizzato per somministrare NA o prodotti farmaceutici per modulare in ultima analisi la risposta immunitaria in lunghezza.Ora ti mostreremo come eseguire la somministrazione sublinguale nei topi utilizzando lusinghiero come agente terapeutico. L'immunoterapia con subina può eventualmente proteggere i topi da una sfida intranasale letale con una polmonite da streptococco innescando una risposta immunitaria innata nel polmone. Affronteremo anche la caratterizzazione della lunghezza, della risposta innata durante l'infezione e dopo l'immunoterapia sublinguale utilizzando la geometria fluida e la PCR in tempo reale.Infine, ti mostreremo come raccogliere i linfonodi a granulazione locale e il tessuto sublinguale per ulteriori analisi. Dopo aver preparato la soluzione dell'agente stimolante da testare, anestetizzare gli animali somministrando 200 microlitri della soluzione di ketamina OSI mediante iniezione interperitoneale Pet la soluzione contenente l'immunostimolante in un volume massimo di 10 microlitri. Quindi prendi il mouse con la mano sinistra e tienilo con il pollice e l'indice con la mano libera.Posiziona delicatamente la pinza chiusa sotto la lingua e tienila in posizione. Usando il medio e l'anulare, prendi la pipetta e somministra la soluzione sul pavimento della bocca e sul lato dorsale della lingua. Rimuovi la pinza e lascia riposare la bocca per tre o cinque minuti prima di rimetterla nella gabbia.Le caratteristiche principali di questa tecnica sono il volume totale utilizzato per trattare gli animali e l'anestesia. Le piccole dimensioni dei topi del cavo orale limitano il volume massimo che può essere applicato al rapporto sublinguale a 10 microlitri. Una volta decisa la dose, è necessario regolare la concentrazione del campione a quel volume massimo.Volumi maggiori potrebbero causare l'ingestione o l'aspirazione indesiderata della soluzione. L'anestesia è fondamentale per evitare la deglutizione e per consentire la penetrazione delle sostanze attraverso l'epitelio. Ti consigliamo di non usare l'inalazione per l'anestesia poiché i topi si sveglieranno troppo presto.Si noti che alcuni anestetici iniettabili potrebbero indurre salivazione nei topi. In tal caso, utilizzare un piccolo pezzo di carta o un piccolo pezzo di carta per eliminare l'eccessiva salivazione prima di applicare la soluzione con l'agente terapeutico, la dose dell'agente terapeutico deve essere regolata per massimizzarne l'effetto e si consiglia vivamente di testare diverse dosi. Se in precedenza hai usato il tuo composto per via intranasale, una dose da cinque a 10 volte superiore sarebbe un buon punto di partenza per testare.Testa il tuo agente terapeutico con la radice sublinguale. Si noti che l'assorbimento attraverso l'epitelio sarà limitato dalle dimensioni della molecola scongelare un'aliquota di stock di lavoro precedentemente preparato di polmonite da streptococcus di CFU batterica nota centrifugare per cinque minuti a 2, 500 Gs e scartare il supernat Sospendere in un millilitro di soluzione salina stere e centrifugare. Ancora una volta, scartare il surnatante e poi riposare.Sospendere il pellet nell'apposito volume di soluzione fisiologica sterile per ottenere una sospensione da quattro volte 10 alle cinque CFU in 50 microlitri, che corrisponde alla dose batterica minima del sierotipo particellare utilizzato che causa il 100% di mortalità nel bulbo C.I topi prelevano 50 microlitri della sospensione batterica e instillano con cura il volume totale nelle narici di un topo precedentemente anestetizzato. Tenere il mouse in posizione verticale per due minuti e lasciarlo riposare in posizione dorsale per altri due minuti. Dopo la sfida, ha confermato i numeri di CFU nella sospensione batterica eseguendo una diluizione seriale di dieci volte della sospensione e li ha piastrati sul sangue.Piastra di agar Incubare per una notte a 37 gradi con il 5% di CO2 di muco. Le colonie di etno possono essere distinte per l'alo verde caratteristico dei batteri alfa emolitici. Contare le unità formanti colonie e registrare l'uso della dose di provocazione.Dopo l'eutanasia dell'animale, aprire la cavità toracica fino al collo. Praticare un'incisione lungo le zampe anteriori per esporre la trachea e l'area sublinguale. Identificare i linfonodi mandibolari.Questi di solito appaiono come strutture di forma ovale biancastra che si trovano sopra le ghiandole salivari. Usando la pinza a punta fine, sollevare delicatamente il tessuto sublinguale ed esporre il lato dorsale del pavimento della bocca. Prendi i linfonodi mandibolari tirandoli delicatamente verso l'alto con la pinza a punta sottile per rilasciarli dal tessuto.Metterli in una provetta contenente C-R-P-M-I o una soluzione conservante di acido nucleico secondo la procedura a valle. Ciò sarebbe stato effettuato in seguito. Ora identifica i linfonodi più piccoli situati più in profondità su entrambi i lati della gola ed eliminali.Questi sono i linfonodi mandibolari accessori. Aprire la cavità toracica per esporre il polmone e rimuovere il timo. Tagliare il binna inferiore CVA e rimuovere l'eccesso di sangue con un tessuto assorbente per eseguire il lavaggio bronco.Innanzitutto, esponi la trachea. Quindi praticare una piccola incisione con un bisturi e introdurre una punta sottile. Trasferire peppe precedentemente riempito con un millilitro di PBS senza calcio magnesio più un millimolare EDA Instillare con cura e aspirare il volume totale almeno tre volte.Quindi aspirare e trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 1,5 millilitri. Perfondere i polmoni iniettando cinque millilitri di PBS senza calcio magnesio più un millimolare EDTA nel ventricolo destro del cuore per eliminare tutti i globuli rossi e le cellule immunitarie presenti nei vasi sanguigni dei polmoni. Se la perfusione è stata eseguita correttamente, il colore dei polmoni passerà dal rosa al bianco.Rimuovere il cuore, prelevare i polmoni perfusi e metterli in un mezzo completo o in una soluzione conservante di acido nucleico a seconda dell'analisi a valle da eseguire. Se si desidera analizzare la popolazione cellulare nella mucosa sublinguale, isolare la testa dell'animale e rimuovere le ghiandole salivari e attaccare i tessuti molli. Fai un'incisione su ciascun lato della bocca fino a raggiungere l'articolazione della mandibola e separa la mascella inferiore insieme alla lingua e al pavimento della bocca.Usando un paio di pinze smussate per denti di ratto, tira su la lingua e fai un'incisione nel punto in cui la base della lingua incontra il pavimento della bocca. Quest'area costituisce la mucosa sublinguale. Tagliare e rimuovere la lingua utilizzando un punzone per biopsia, una pinza e forbici.Tagliare il tessuto mucoso sublinguale e inserirlo in una provetta pulita. Trasferire i polmoni in una piastra a 24 pozzetti e lavorarli con un paio di forbici pulite. Aggiungere un millilitro di terreno di digestione, pipettando su e giù più volte e incubare a 37 gradi e 5% di CO2 per 40 minuti dopo l'incubazione.Pipetta su e giù di nuovo per assicurarsi che la maggior parte delle cellule fosse stata rilasciata dal tessuto. Trasferire la sospensione cellulare su un colino cellulare da 40 micro mesh e lavarla con cinque millilitri di PBA. Centrifuga EDTA da cinque millimolari a 2.500 GS per cinque minuti.Reus sospende le cellule in un millilitro fax EDTA composto da PBS senza calcio magnesio, un EDTA millimolare e 1% di siero di boing fetale. Prendi un QU e fai una doppia diluizione delle cellule con trip e blu e conta Reus, sospendi le cellule a una concentrazione di due volte 10 alle sette cellule per millilitro e aggiungi 50 microlitri per provetta. Aggiungere 50 microlitri di una miscela di anticorpi due volte a ciascuna provetta per l'analisi immunofenotipica.Incubare per 30 minuti con ghiaccio al buio dopo aver lavato tre volte con i fatti. L'EDTA risospende le cellule in 200 microlitri di fatti L'EDTA e analizza in un citometro La stessa procedura può essere utilizzata per analizzare la popolazione cellulare nel tessuto sublinguale utilizzando mezzi di digestione contenenti questo spazio. L'immunoterapia sublinguale con collagenasi e DS one utilizzando flatline purificata, un agonista di TLR 5 e LC 4, ha indotto una significativa sovraregolazione dei livelli di mRNA di chemochine e citochine coinvolte nel reclutamento dei neutrofili nei polmoni.Questo è stato osservato anche durante l'infezione. Il reclutamento di PMN nei polmoni è stato confermato dalla citometria a flusso. Il trattamento sublinguale con agonisti TLR five è correlato con un aumento della sopravvivenza degli animali e la protezione contro la polmonite pneumococcica.Abbiamo dimostrato che l'immunoterapia sublinguale è un mezzo efficace per indurre protezione nelle linee contro la polmonite pneumococcica invasiva da PNE. Ciò è stato ottenuto con l'installazione sublinguale di lain, un sarto cinque agonisti che non è prodotto da istopolmonite. L'installazione sublinguale di lain ha indotto la sovraregolazione della chemochina C Xcl L nelle linee, così come l'infiltrazione di neutrofili.Un tipo di cellule che sono cruciali per eliminare lo pneumococco, l'immunoterapia sublinguale con agonisti dei TLR potrebbe essere utilizzata per trattare le infezioni da sola o in combinazione con le attuali terapie come il trattamento antibiotico, al fine di prevenire la diffusione batterica e lo sviluppo di forme gravi di infezione. La radice sublinguale può anche essere utilizzata per somministrare il vaccino e si è dimostrata efficace nell'indurre l'immunità protettiva mucosale e sistemica. Questa strategia è di particolare interesse nel caso delle infezioni respiratorie e soprattutto per le polmoniti da bro poiché potrebbe non solo prevenire la malattia di base, ma anche la colonizzazione asal bloccando i batteri allo sport di ingresso.Nel complesso, riteniamo che la via sublinguale sia un'alternativa interessante per sviluppare nuove strategie per trattare o prevenire le infezioni respiratorie. Ti invitiamo a provare questa tecnica.

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Intubazione-mediata intratracheale (IMIT) instillazione: A non invasiva, Lung-specifico sistema di rilascio

C'è una generale mancanza di conoscenza su come funzionano i vaccini. Qui proponiamo l'uso combinato della genetica inversa e dei topi chimerici del midollo osseo per ottenere informazioni sulle risposte immunitarie precoci dell'ospite ai vaccini, con particolare attenzione alle cellule dendritiche e all'immunità delle cellule T.

Intranasale somministrazione di ricombinante Influenza vaccini nei modelli chimerico topo per studiare immunità delle mucose

Dimostriamo la procedura per l'inoculazione intra-tracheale di Haemophilus influenzae nel tratto respiratorio inferiore dei topi. Questo è uno strumento molto utile per studiare le vie di segnalazione che regolano l'infiammazione delle vie aeree nei modelli murini.

Intra-tracheale Amministrazione<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; In modelli murini per studiare infiammazione delle vie aeree

Descriviamo in dettaglio la metodologia seguita per confrontare l'efficacia protettiva e la risposta immunitaria polmonare indotta dall'immunizzazione intranasale e sottocutanea con BCG nel modello murino. I nostri risultati mostrano i benefici della vaccinazione polmonare e suggeriscono un ruolo della risposta mediata da IL17 nella protezione indotta dal vaccino.

L&#39;efficacia e la protezione polmonare risposta immunitaria seguito sottocutanea e intranasale BCG Amministrazione nei topi

Procedure sperimentali per l'estrazione successiva di tessuti linfatici per testare l'attivazione delle cellule dendritiche linfoidi sono descritti dopo il trattamento di un nanomateriale immunostimulating.

Valutazione immunostimulatory agente: Attivazione linfoide tessuto estrazione e iniezione Route-dipendente delle cellule dendritiche

Descritto è la preparazione di nanoparticelle liposomiale antigeniche e loro uso nella stimolante della B-cellula attivazione in vitro e in vivo. Risposte anticorpali coerente e stabile ha condotto allo sviluppo di un nuovo modello di allergia dell'arachide. Il protocollo per la generazione di liposomi antigenici può essere estesa a diversi antigeni e modelli di immunizzazione.

Liposomi antigenici per la generazione di anticorpi specifici per la malattia

Qui presentiamo un elegante protocollo per la valutazione in vivo di vaccino efficacia e host le risposte immunitarie. Questo protocollo può essere adattato per i modelli di vaccino che studiano virale, batterica o parassitari patogeni.

Valutazione delle risposte ospite-patogeno e l'efficacia del vaccino nei topi

Presentato qui è una procedura passo-passo per indurre lesioni polmonari acute nei topi mediante instillazione lipopolysaccharide intracheale diretta ed eseguire l'analisi FACS di campioni di sangue, liquido di lavaggio bronchoalveolar e tessuto polmonare. La minima invasività, la manipolazione semplice, la buona riproducibilità e la titolazione della gravità della malattia sono vantaggi di questo approccio.

Indurre lesioni polmonari acute nei topi mediante instillazione diretta del lipopolioaccaride intracheale

Questo articolo descrive e dimostra la somministrazione di vaccini intranasali e la raccolta di latte dai conigli in allattamento (Oryctolagus cuniculus) come mezzo per valutare l'immunità mucosa in un modello traslazionale appropriato di immunizzazione materna.

Immunizzazione intranasale e raccolta del latte negli studi sull'immunizzazione materna nei conigli bianchi della Nuova Zelanda(Oryctolagus cuniculus)

In questo studio, una tecnica di instillazione endotracheale non invasiva è dimostrata per sviluppare l'ALI nei ratti utilizzando un laringoscopio di base per garantire una precisa somministrazione di LPS ai polmoni. La LPS viene immessa tramite un tubo endotracheale tramite un laringoscopio. L'entità della lesione polmonare viene valutata in più momenti temporali.

Somministrazione endotracheale non invasiva di lipopolisaccaridi per indurre lesioni polmonari acute nei roditori

Scopri l'immunoterapia sublinguale per potenziare la risposta immunitaria innata nei polmoni contro la polmonite pneumococcica letale nei topi. Questo metodo non invasivo offre un'alternativa sicura alla somministrazione intranasale.

L'immunoterapia sublinguale come alternativa di indurre una protezione contro le infezioni respiratorie acute

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