Name: Multi-fotone intracellulare di sodio Imaging Combinato con UV-mediata uncaging focale di glutammato in neuroni piramidali CA1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Impara a evocare e analizzare la dinamica del sodio in dendriti e spine di neuroni CA1 ippocampali utilizzando imaging multifotone e uncaging UV di glutammato. Questo metodo combina patch-clamp e microscopia per studiare i segnali intracellulari.

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Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione della Science Foundation tedesco (DFG, Ro2327 / 6-1) al CRR Gli autori desiderano ringraziare S. Durry e C. Roderigo per l&#39;assistenza tecnica di esperti, e M. Dubbert (Laboratorio di Elettronica, Zoological Institute , Università di Colonia, Germania) per l&#39;aiuto nella realizzazione del controllore di cella di Pockels e l&#39;interruttore HF.

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</ol>

Gli autori dichiarano senza interessi in competizione. Gli autori hanno ricevuto un sostegno finanziario che consenta di pubblicazione Open Access da Rapp optoelettronico (Wedel, Germania), che produce uno strumento utilizzato in questo articolo il video. La società è stata né coinvolta negli esperimenti, né nella gestione dei dati, né nella scrittura manoscritto.

Il presente studio dimostra che SBFI è adatto per due fotoni di imaging di transitori di sodio intracellulari in piccoli compartimenti cellulari. Va tenuto presente, tuttavia, che l&#39;efficienza quantica di SBFI è piuttosto bassa 15 e relativi cambiamenti nella concentrazione di sodio è piuttosto piccola con attività fisiologica. Pertanto, la misurazione ad alta risoluzione di transitori Na + nei processi sottili è un compito relativamente noioso, e binning o media di diversi studi può essere necessario per ottenere segnali soddisfacenti. Inoltre, la cinetica di transienti sodio sono sorprendentemente lento, rendendo obbligatoria registrare per periodi di tempo prolungati. Questa osservazione corrisponde a quelle in studi precedenti, in cui il decadimento monoesponenziale dei transitori di sodio in dendriti neuronali e in astrociti è stata caratterizzata da grandi costanti di tempo di decadimento dell&#39;ordine di 10 secondi a temperatura ambiente 1,2,6. Transitori di sodio sembrano quindi esercitare un tempo molto più lento coUrse e molto più grandi costanti di tempo di decadimento rispetto ai transienti di calcio 16. Mettere da parte questi inconvenienti, l&#39;imaging di sodio dimostra di essere un valido strumento per lo studio delle proprietà fisiologiche dei sottodomini neuronali. Ad esempio, l&#39;imaging di sodio può servire per monitorare l&#39;attività sinaptica eccitatoria in o vicino alla sinapsi attive. Poiché il sodio è essenzialmente non tamponato 8,17, transitori sodio attività indotte sono linearmente correlate a una vasta gamma di rilascio di glutammato sinaptico o esogena glutammato applicati. Essi rappresentano quindi indicatori diretti e imparziali di attività glutamatergico neuronale. Inoltre, indicatore di sodio coloranti presentano s &#39;alta K d (di SBFI K d è nel range di 25 mm 1). Anche a concentrazioni relativamente alte di colorante intracellulari utilizzati per raggiungere la luminosità sufficiente (di solito 0,5-1 mM), l&#39;elevato K d &#39;s implica che i coloranti stessi non agiscono come buffer per sodium. Di conseguenza, essi non distorcano l&#39;ampiezza né il tempo corso di transitori di sodio, che è sempre una preoccupazione quando coloranti calcio-sensibili vengono introdotti nelle cellule 18. Si può pertanto ritenere che i segnali rilevati rappresentano una buona misura delle variazioni &quot;reale&quot; in sodio intracellulare. Il loro decorso lento quindi implica che la velocità di diffusione intracellulare del sodio nei neuroni è molto più piccolo di quanto precedentemente ipotizzato 19. Un requisito fondamentale per la corretta esecuzione di esperimenti che riguardano le proprietà di eccitatori vie di trasmissione e afflusso di sodio sinaptiche nelle spine e dendriti è l&#39;induzione di una attivazione veloce e altamente localizzata di strutture post-sinaptici. Questo può essere ottenuta con l&#39;applicazione facile e locale di glutammato o glutammato agonisti nelle immediate vicinanze di una colonna vertebrale o un dendrite dalla fotolisi lampo di composti gabbia. Fotolisi Flash non dama non meccanicamentege il tessuto, è privo di artefatti da movimento ed è ben stabilito per lo studio di questioni connesse (ad esempio la segnalazione di calcio locale). Il diametro dello spot uncaging è stato di 1,5 micron nel piano xy. Uncaging quasi un segnale di sodio spinosi dendrite indotti in entrambe le spine e il dendrite genitore. Considerando che i segnali tendevano ad essere più grande di spine più vicini al posto uncaging, le ampiezze della dendrite genitore e spine più lontano erano ancora piuttosto simili a quelle nelle immediate vicinanze del punto uncaging. Uncaging è stata eseguita per 300 msec durante il quale le correnti interiori aumentate in ampiezza. Glutammato Uncaged avrebbe diffuso nel tessuto durante lo stesso periodo di tempo, l&#39;attivazione di recettori ionotropici del glutammato e afflusso di sodio sulle regioni dendritiche e le spine più lontano dal punto uncaging. Un problema intrinseco che si verifica quando si utilizza un laser UV per fotolisi di composti in gabbia somministrati attraverso la soluzione di balneazione cellulareè &#39;filtraggio interiore&#39;. A causa del tasso di assorbimento elevato della gabbia, la luce UV si attenua fortemente lungo la strada dall&#39;obiettivo al sito di stimolazione 20,21. Un modo pratico per evitare questo è perfusione locale con la gabbia che è limitato solo per il sito di stimolazione, che riduce inoltre la quantità di composto in gabbia necessaria al minimo. Rispetto al uncaging UV scansione laser-mediata, vicino-infrarossi a due fotoni uncaging 22 è spazialmente più precisa, soprattutto perché la precisione della stimolazione aumenta in asse z. D&#39;altra parte, a causa della piccola sezione di gabbie comunemente usati per le lunghezze d&#39;onda più lunghe come impiegati con eccitazione a due fotoni, sia una elevata concentrazione del composto in gabbia o molto elevato, richiedono intensità luminose potenzialmente fototossiche. Inoltre, due fotoni uncaging richiede un investimento molto maggiore nelle attrezzature; tra gli altri, un laser IR supplementare oltre ai componenti ottici richiesti, sono necessari. Sia SBFI e MNI-glutammato sono eccitabili nella gamma di lunghezze d&#39;onda identica. Questo può portare a una interdipendenza involontaria di laser UV uncaging e SBFI o laser per immagini IR e MNI-glutammato, con conseguente sbiancamento della SBFI dal flash uncaging e / o una uncaging continuo di glutammato dal fascio IR. Tuttavia, come mostrato nella Figura 6C, né un lampo UV per sé né la formazione immagine a più fotoni causato tali influenze reciproche nelle nostre condizioni sperimentali. Sistemi UV-in flash simili a quello qui descritto sono utilizzati di routine in molti altri laboratori e possono essere relativamente facilmente incorporati in nessuna microscopio di imaging multi-fotone esistente. Esso offre il vantaggio che il fascio laser per fotolisi può essere posizionato liberamente nel campo visivo. Inoltre, il sistema permette un riposizionamento rapido ed automatico del fascio laser e il volume di rilascio, rispettivamente, nel campo visivo durante un esperimento. Oumodifica r semplifica e migliora il posizionamento accurato dello spot uncaging, in modo che i frame del software di imaging possono servire per regolare fotogrammi di imaging e uncaging congruente. Nel loro insieme, whole-cell patch-clamp e l&#39;imaging di sodio multi-fotone in dendriti e spine dei neuroni centrali, unita ad una procedura modificata per uncaging UV-luce-indotta di glutammato, permette l&#39;attivazione affidabile e focale dei recettori del glutammato nel tessuto. Si può quindi servire per analizzare le proprietà di trasmissione sinaptica eccitatoria e segnali di sodio nei neuroni postsinaptici nel tessuto intatto.

Recenti miglioramenti nelle tecniche microscopiche leggeri quali microscopia multi-fotone hanno consentito lo studio dei parametri morfologici e fisiologici delle cellule cerebrali nel tessuto intatto con elevata risoluzione spaziale e temporale. Combinato con elettrofisiologia, queste tecniche sono ora ampiamente utilizzati per analizzare i segnali elettrici di attività legate sui neuroni e segnali di calcio concomitanti in piccoli compartimenti subcellulari, vale a dire in dendriti sottili e spine dendritiche. Oltre a transienti di calcio, attività sinaptica induce anche i segnali di sodio in dendriti e spine, le cui proprietà sono in gran parte inesplorate. Tali segnali possono essere analizzati da due fotoni di imaging di sodio intracellulare ([Na +] i) che permette la misurazione on-line di [Na +] i transienti per periodi prolungati senza significativo sbiancamento colorante o foto-danno 1,2. Per l&#39;imaging di i [Na +] </sub&gt;, a pochi coloranti indicatore chimico sono disponibili, ad esempio Corona Verde o Asante Natrium Verde 3,4. La sonda fluorescente più comunemente usato per Na + imaging è sodio-binding isoftalato benzofuran (SBFI). Si tratta di un raziometrica, colorante UV-eccitato simile al noto colorante calcio-sensibile fura-2 ed è stato impiegato per l&#39;imaging convenzionale Na + in molti tipi di cellule (ad esempio 5,6). Ci sono diverse possibilità di emozionanti del colorante e raccogliendo sua fluorescenza. Se è richiesta alta risoluzione temporale (cioè un frame rate elevato di imaging) in combinazione con le informazioni spaziali, SBFI può essere eccitato con una lampada allo xeno ad arco o un diodo dispositivo ad alta potenza di uscita della luce (LED) e la sua emissione rilevato con una carica ad alta velocità Dispositivo -coupled (CCD), fotocamera 7,8. Per la risoluzione spaziale massima profondità nel tessuto, microscopia a scansione laser multi-fotone è il metodo di scelta 9. Il relativamente basso efficie quantisticaNCY di SBFI richiede concentrazioni relativamente alte di colorante (0,5-2 mm), e il caricamento diretto del modulo membrana impermeabile di SBFI tramite un forte microelettrodo 10 o la patch pipetta 1. Utilizzando SBFI, precedenti lavori eseguiti in fettine di tessuto acute dell&#39;ippocampo roditori hanno dimostrato attività legate transitori di sodio in dendriti e spine dei neuroni CA1 piramidali che sono causati principalmente da afflusso di sodio attraverso ionotropici NMDA recettori 1,2. Per lo studio delle proprietà di tali segnali sodio locali in maggior dettaglio, l&#39;attivazione di specifici recettori postsinaptici di applicazione di agonisti del recettore è un metodo adatto di scelta. Per simulare l&#39;attività presinaptica e rilascio del trasmettitore, l&#39;applicazione dovrebbe essere relativamente breve e focalizzato per consentire la stimolazione locale. Questo, tuttavia, risulta essere molto impegnativo nel tessuto intatto. Applicazione di pressione locale di agonisti del recettore con una pipetta a punta fine permette di ap molto focaleplicatura, ma ospita il rischio potenziale per produrre il movimento della struttura di interesse (ad esempio, come un dendrite o spine dendritiche), e quindi ostacola imaging ad alta risoluzione. L&#39;idoneità di ionoforesi di sostanze neuro-attivi dipende dalle loro proprietà elettriche e alte ampiezze di corrente può produrre artefatti cellulari pure. Un modo per aggirare questi ostacoli è l&#39;impiego di composti foto-attivati ​​e la loro fotolisi del flash. Fondamentalmente, due principi differenti vengono utilizzati per la foto-attivazione di sostanze in gabbia: I) a largo campo del flash fotolisi 11 e II) uncaging focale impiegando moduli di scansione in combinazione con il laser 12. Mentre in tutto il campo del flash fotolisi viene utilizzato per attivare più grandi regioni di interesse, ad esempio, un intera cella, uncaging focale è impiegata per stimolare in particolare i piccoli compartimenti cellulari. In questo studio dimostriamo una procedura per whole-cell patch-clamp e multi-pImaging sodio Hoton in dendriti e spine di neuroni centrali, unita ad una procedura modificata per uncaging luce UV-indotta di glutammato, che permette l&#39;attivazione affidabile e focale dei recettori del glutammato nel tessuto.

<table><tbody><tr><td>Capillari in vetro borosilicato</td><td>Hilgenberg</td><td>1405059</td><td>75 x 2 mm, spessore della parete 0,3 mm</td></tr><tr><td>Fotocamera</td><td>Jenoptik</td><td>ProgRes MF</td><td>Telecamera compatibile con IR-DIC</td></tr><tr><td>Software di deconvoluzione</td><td>SVI</td><td>Huygens Pofessional X11</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro a fibre ottiche</td><td>Ocean Optics</td><td>USB 4000</td><td>Spettrometro miniaturizzato a fibra ottica</td></tr><tr><td>Tubi filtranti</td><td>Filtro centrale VWR</td><td></td><td>, 0,2 &; micro; m</td></tr><tr><td>Software di imaging</td><td>Olympus Europe</td><td>Flowview Ver 5.0c,</td> controller di potenza del fascio IR Tiempo <td></td></tr><tr><td></td><td>Costruito</td><td></td> su misura <td>Controllo dell'intensità del raggio laser + passaggio rapido a zero sul flyback tramite cella pockels</td></tr><tr><td>laser IR</td><td>SpectraPhysics</td><td>Mai-Tai</td><td>laser sintonizzabile Ti:Sa pulsato (710 - 990 nm); ATTENZIONE</td></tr><tr><td>Monitor di potenza IR</td><td></td> Micromanipolatore personalizzato <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Burleigh</td><td>PCS 5000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio/Sistema di imaging</td><td>Olympus Europe</td><td>BX51WI/FV300</td><td>Sia il microscopio che i sistemi di imaging sono stati fortemente modificati</td></tr><tr><td>Ruota portafiltri ND</td><td>Newport</td><td>50Q04AV.2</td><td>Silice fusa UV, densità ottica 0,05 - 2,0</td></tr><tr><td>Obiettivo</td><td>Nikon Instruments Europe</td><td>NIR Apo 60x/1.0w</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore a pinza patch</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per pipette</td><td>Narishige</td><td>Modello PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Sistema pneumatico di espulsione dei farmaci</td><td>NPI Electronic</td><td>PDES-DXH</td><td></td></tr><tr><td>Cella Pockels</td><td>Conoptics</td><td>350-80 LA-BK</td><td>EOM, utilizzata come interruttore rapido e per la regolazione della potenza</td></tr><tr><td>Cella Pockels driver</td><td>Conoptics</td><td>M302-RM</td><td>Amplificatore differenziale ad alta tensione</td></tr><tr><td>Otturatore</td><td>Vincent Associates</td><td>LS6ZM2</td><td>ALMgF2</second> rivestite Lame BeCu rivestite</td></tr><tr><td>Controllore per otturatore Driver per otturatore</td><td>su misura</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Vincent Associates</td><td>Uniblitz VCM D1</td><td></td></tr><tr><td>Affettatrice/Vibratomo</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>Software di sblocco</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td><td></td></tr><tr><td>UV Laser</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>DL-355/10</td><td>cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; ATTENZIONE</td></tr><tr><td>Sistema di scansione laser UV</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA 40</td><td>Sistema di scansione galvanometrica</td></tr><tr><td>Nome del composto</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments/ Description</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-127</td><td>Antagonista del recettore AMPA; AVVERTENZE</td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64210</td><td>antagonista del recettore NMDA; ATTENZIONE</td></tr><tr><td>SBFI K+ sale</td><td>Teflabs</td><td>OO32</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-055</td><td>Inibitore dei canali Na+ voltaggio-dipendenti; ATTENZIONE</td></tr><tr><td>NMI-caged-L-Glutamate</td><td>Torcis</td><td>1490</td><td>Glutammato in gabbia rilasciato dopo l'assorbimento UV</td></tr></tbody></table>

multi-fotone intracellulare di sodio imaging combinato con uv-mediata uncaging focale di glutammato in neuroni piramidali ca1

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-fotone microscopia a fluorescenza ha permesso l&#39;analisi dei parametri morfologici e fisiologici delle cellule cerebrali nel tessuto intatto con elevata risoluzione spaziale e temporale. Combinato con elettrofisiologia, è ampiamente usato per studiare i segnali di calcio di attività legate in piccoli compartimenti subcellulari come i dendriti e spine dendritiche. Oltre a transienti di calcio, attività sinaptica induce anche i segnali di sodio post-sinaptici, le cui proprietà sono solo marginalmente comprensibili. Qui, descriviamo un metodo per combinato whole-cell patch-clamp e l&#39;imaging di sodio multi-fotone in micro domini cellulari dei neuroni centrali. Inoltre, si introduce una procedura modificata per l&#39;ultra-violetta (UV) uncaging-luce-indotta di glutammato, che consente l&#39;attivazione affidabile e focale dei recettori del glutammato nel tessuto. A tal fine, le registrazioni cellule intere sono state effettuate su Cornu Ammonis suddivisione 1 (CA1) neuroni piramidali in fettine di tessuto acute dellaippocampo di topo. I neuroni sono stati riempiti con il sodio-sensibile colorante fluorescente SBFI attraverso la patch-pipetta, e multi-fotone di eccitazione del SBFI consentito la visualizzazione dei dendriti e spine adiacenti. Per stabilire uncaging focale indotta da UV, diversi parametri tra cui l&#39;intensità della luce, volume interessato dal fascio uncaging UV, posizionamento del fascio così come la concentrazione del composto in gabbia sono stati testati e ottimizzati. I nostri risultati mostrano che la perfusione locale con glutammato in gabbia (MNI-glutammato) e il suo risultato UV-uncaging focale nelle correnti interiori e transitori di sodio in dendriti e spine. Naturalmente il tempo e l&#39;ampiezza delle due correnti attivo e segnali sodio correlano con la durata dell&#39;impulso uncaging. Inoltre, i nostri risultati mostrano che i segnali di sodio intracellulari sono bloccati in presenza di bloccanti per i recettori ionotropici del glutammato, dimostrando che essi sono mediati da afflusso di sodio se questo percorso. In sintesi, il nostro metodo fornisce uno strumento affidabile per laricerca di segnali di sodio intracellulari indotti da attivazione del recettore focale nel tessuto cerebrale intatto.

Nel presente studio, abbiamo dimostrato una procedura per la microscopia multi-fotone delle dinamiche di sodio cellulari con il colorante fluorescente SBFI sodio-dipendenti nei neuroni piramidali CA1 di topo acuta fettine di tessuto ippocampale. Inoltre, mostriamo come combinare questa tecnica di imaging con uncaging a base di laser-scanning di composti neuro-attiva (ad esempio glutammato in gabbia) e la sua precisione di targeting per cellulari micro-domini. Caricamento neuroni con SBFI attraverso la patch-pipetta permesso la visualizzazione di tutta la cellula compresi dendriti e spine sottili adiacenti impiegando multi-fotone di eccitazione (Figura 6A, B, D e Figura 7a). <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500"> Figura 6 segnali di sodio e correnti sinaptiche indotte dal flash fotolisi del glutammato in gabbia. (A) MaximAl proiezione dell'immagine di un neurone piramidale CA1 caricato con SBFI tramite la pipetta di patch (PP). La casella indica l'area indicata ampliata nel B. LP indica la posizione e l'orientamento della pipetta per perfusione locale di glutammato in gabbia. (B) ad alta potenza massima proiezione di una pila di sezioni ottiche di un dendrite con spine dendritiche adiacenti. Le pile di sezioni ottiche sottoposti z-allineamento e deconvoluzione. La croce rossa indica la regione di destinazione del fascio uncaging. La linea tratteggiata arancione delimita la regione di interesse da cui è stata registrata l'emissione di fluorescenza. La casella indica l'area indicata ampliata nel D. (C) A sinistra: il segnale di sodio (riga superiore) e somatica verso l'interno di corrente (riga inferiore) indotta dal flash fotolisi del glutammato in gabbia (indicato dal lampo giallo). La linea rossa rappresenta un fit dei dati sperimentali. L'area grigia rappresenta il periodo in cui il flash uncaging (300msec) ostruito l'imaging di fluorescenza SBFI Destra:. senza pre-perfusione con glutammato in gabbia, la stessa UV-flash né evocato un cambiamento di emissione SBFI, né una corrente verso l'interno (D) A sinistra:. Immagine ad alta potenza del dendrite e adiacente spine come delineata in B. Accanto, la stessa immagine con valori di grigio invertite. Le linee tratteggiate indicano le regioni di interesse in cui è stato registrato l'emissione di fluorescenza. La croce rossa indica la localizzazione del fascio uncaging Destra:. Transienti sodio indotta da UV-flash fotolisi del glutammato in gabbia. Blu traccia: segnali di sodio nel dendrite; traccia rossa: risposta media da tre spine adiacenti al punto uncaging; traccia verde: risposta media da tre spine lontane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per una versione più grande di questa figura.</a> Dopo la perfusione locale con Cagedglutammato, applicando un UV-flash vicino ad un dendrite portato ad una diminuzione transitoria emissione di fluorescenza di SBFI, riflettendo un aumento della concentrazione di sodio intracellulare (Figura 6C, D e Figura 7B). Allo stesso tempo, una corrente verso l'interno è stato registrato al soma (Figura 6C e Figura 7B). Aumentare la durata del flash UV ha portato ad aumentare ampiezze sia della suscitato verso l'interno correnti e segnali di sodio (dati non mostrati), indicando che il sistema era ben all'interno della sua gamma dinamica e che le risposte non uncaging né cellulari erano saturi. Applicazione di un UV-lampo di identica durata o più per sezioni che non sono state pre-perfusi con glutammato in gabbia, non ha provocato cambiamenti nel SBFI fluorescenza né correnti interiori, indicando che questi segnali sono dovuti alla uncaging di glutammato (Figura 6C). Inoltre, questi risultati mostrano che nessuna interdipendenza dei componenti imaging- e uncaging si osserva under nostre condizioni sperimentali. Segnali di sodio potrebbe essere rilevato anche in spine dendritiche (Figura 6D). Anche se non abbiamo tentato di ottenere la stimolazione di un singolo colonna vertebrale solo con glutammato uncaging, ampiezze di picco tendevano ad essere leggermente superiore a spine vicino al punto uncaging, considerando spine più lontano hanno mostrato variazioni di fluorescenza praticamente identiche come il dendrite genitore (Figura 6D). Infine, abbiamo studiato il percorso per afflusso di sodio nei dendriti e spine in risposta a uncaging di glutammato. A tal fine, abbiamo impiegato CNQX e APV, che sono bloccanti selettivi per i sodio-permeabili, recettori ionotropici del glutammato del AMPA- e NMDA-sottotipo, rispettivamente. I nostri risultati mostrano che i segnali sodio intracellulare indotta da glutammato e le correnti somatici stimolate sono stati omessi in presenza di questi bloccanti (Figura 7B). Al momento del wash-out dei bloccanti, i segnali sono riacquistato. Questo dimostra that uncaging di glutammato attiva i recettori del glutammato ionotropici sui neuroni piramidali CA1, che mediano l'afflusso di sodio nei dendriti e spine, con conseguente transienti intracellulari di sodio e correnti verso l'interno. <img alt="Figura 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600"> Figura 7 profilo farmacologico dei segnali di sodio evocate e delle correnti verso l'interno. (A) SBFI pieno CA1 piramidale neuroni con la patch pipetta (PP) allegato al soma (B) A sinistra:. Transitorio di sodio e la corrente somatica indotta da foto-attivazione di glutammato in gabbia in un dendrite e spine collegate Center. Perfusione con l' ionotropici bloccanti del recettore del glutammato CNQX e APV inibisce sia il segnale di sodio e la corrente verso l'interno indotta da uncaging destra:. Su wash-out dei bloccanti, i segnali vengono ripristinati. I rappre linea rossats una misura dei dati sperimentali. L'area grigia rappresenta il periodo in cui il flash uncaging (300 msec) ostruito l'imaging di fluorescenza SBFI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per una versione più grande di questa figura.</a>

Descriviamo la combinazione di focale indotta da UV foto-attivazione di composti neuro-attivi con whole-cell patch-clamp e multi-Photon Imaging di transitori di sodio intracellulari in dendriti e spine di neuroni ippocampali in fettine di tessuto acute del cervello di topo.

Multi-fotone intracellulare di sodio Imaging Combinato con UV-mediata uncaging focale di glutammato in neuroni piramidali CA1

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di evocare e analizzare la dinamica del sodio in piccoli compartimenti cellulari, come spine e dendriti di neuroni centrali nel tessuto intatto. Ciò si ottiene preparando prima una fetta acuta dell'ippocampo di topo, caricando un neurone piramidale con il colorante fluorescente sensibile al sodio SBFI attraverso una pipetta di cerotti e visualizzando la morfologia cellulare utilizzando l'eccitazione multifotonica. I prossimi passi sono scegliere un dendrite spinoso per l'esperimento e iniettare un composto fotoattivato come il glutammato in gabbia vicino a questo dendrite.Un flash UV viene quindi applicato al glutammato di Foley non ingabbiato utilizzando un laser UV che è stato accuratamente posizionato per mirare a un piccolo volume vicino al dendrite scelto. Il passo finale consiste nel monitorare le variazioni risultanti nella fluorescenza SBFI nel dendrite e monitorare le variazioni risultanti nel sodio nelle spine adiacenti. Vengono registrate anche le correnti di membrana che le accompagnano.In definitiva, l'utilizzo di strumenti farmacologici appropriati come i bloccanti recettoriali consentirà lo studio dei meccanismi che generano i segnali intracellulari di sodio evocati. Questo metodo fornisce uno strumento affidabile per lo studio dei segnali intracellulari del sodio in piccoli compartimenti cellulari e nel tessuto cerebrale intatto. Qui combiniamo il patch clamp a cellula intera e l'imaging multifotone al sodio con una procedura modificata per l'uncaging indotto dalla luce UV.Ci permette di monitorare le risposte cellulari in caso di applicazioni precise e focali di composti neuroattivi. La procedura sarà dimostrata da Karl KA e da Kaan Kleinhans, uno studente laureato nel mio laboratorio. Per iniziare la dissezione del tessuto, posizionare immediatamente il cervello in una capsula di Petri con dissezione ghiacciata, liquido cerebrospinale artificiale o A CSF e sezionare un emisfero eseguendo un taglio sagittale lungo la linea mediana.Eseguire un secondo taglio con l'orientamento desiderato come superficie di blocco. Quindi attaccalo alla fase di taglio di un vibram con super colla. Dopo aver estratto la camera di taglio e l'elemento di raffreddamento del vibram dal congelatore, posizionare il tavolino di taglio con la sezione del cervello nella camera.Quindi inserire l'elemento di raffreddamento nella camera e immergere il tessuto nella dissezione ghiacciata A CSF. Successivamente tagliare 250 micrometri di spessore. Fette para sagittali dell'ippocampo con un vioma.Assicurarsi che i fluidi CS siano sempre gorgogliati. Dopo l'affettatura, tenere il fazzoletto su una rete in un becher con un normale A CSF e incubare a 34 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, mantenere il tessuto a temperatura ambiente.Questo esperimento dovrebbe essere eseguito in un ambiente buio, ma viene mostrato qui in condizioni di scarsa illuminazione per scopi di ripresa. Per preparare prima l'hardware, accendere i componenti del sistema multifotone e regolare l'allineamento del raggio laser a infrarossi come descritto nel protocollo di testo. Quindi regolare la lunghezza d'onda del laser multifotone e l'intensità del raggio modificando le impostazioni della cella pcal e dei moltiplicatori fotografici.Successivamente, accendere e calibrare il sistema di disingabbiamento posizionando un vetrino fluorescente per campioni sotto la lente dell'obiettivo. Avviare la routine di calibrazione del software di controllo dell'unità di disingabbiamento. Imposta il laser UV su diversi punti all'interno del suo raggio di scansione mentre la fluorescenza viene catturata con una telecamera CCD facendo clic sul punto del laser UV.In ogni punto, regolare il posizionamento degli specchi di scansione galvanica in modo che corrisponda a una determinata coordinata nel software. Il posizionamento accurato del punto di disinserimento si ottiene importando un'immagine del sistema di imaging tramite una connessione di rete tra i computer di disingabbiamento e di imaging. Utilizzando il software di cattura dello schermo, leggere continuamente i fotogrammi del software di imaging e regolare l'imaging.E al termine, i fotogrammi di ingabbiamento esportano in modo congruente ogni 10 fotogrammi dal software di imaging come immagine di riferimento nell'unità flash per garantire una corretta regolazione durante l'intero esperimento. Quindi, accendere i componenti di elettrofisiologia dei micromanipolatori e il dispositivo di applicazione della pressione per la consegna del composto in gabbia nella regione target. Estrarre le pipette per il patch clamp a cellule intere e la profusione locale utilizzando capillari in vetro silicato di boro lucidato a fuoco.Quindi posizionare la fetta nel bagno sperimentale e fissarla con una griglia, posizionare il bagno al microscopio e perfondere permanentemente la fetta con A CSF. Iniziare il bloccaggio del cerotto a cellula intera caricando la pipetta del cerotto con una soluzione intracellulare o un ICS contenente SBFI, quindi caricare la pipetta di perfusione locale con un composto in gabbia. Collegare le pipette ai micromanipolatori corrispondenti e posizionare l'elettrodo di riferimento nella vasca.Scegliere una cella piramidale CA one con un soma che si trova da 30 a 70 micrometri sotto la superficie della fetta per garantire una morfologia cellulare intatta, nonché una bassa dispersione e attenuazione del fascio di disingabbiamento. Avvicinati a questa cellula con una pipetta patch che utilizza la microscopia video IR DIC. Applicare un'aspirazione delicata fino ad ottenere una tenuta giga.Compensa la capacità rapida. Quindi rompere la membrana e aprire la cella per ottenere la configurazione cellulare. Infine, valutare la vitalità delle celle in modalità current clamp.Iniettare una corrente depolarizzante e verificare la presenza di picchi risultanti per eseguire l'imaging e la stimolazione. Innanzitutto, aggiungere tetro DOIND ad A CSF per prevenire l'attivazione dei canali del sodio voltaggio-dipendenti e la generazione di potenziali d'azione. Visualizza la morfologia cellulare utilizzando l'eccitazione multifotone e la conseguente fluorescenza SBFI.Scegli un dendrite spinoso per l'esperimento. Ingrandisci le immagini a una risoluzione più alta e posiziona una casella di ritaglio attorno al dendrite. Quindi posizionare la pipetta con il composto in gabbia vicino al dendrite.Posizionare la pipetta in modo da consentire un'efficiente perfusione locale del dendrite scelto. Regolare il laser di sblocco per posizionare il punto di sblocco vicino alla struttura di interesse. Successivamente, imposta le regioni di interesse sul dendrite scelto e sulle spine adiacenti utilizzando il software di imaging.Avvicinati alla regione di interesse e inietta il composto in gabbia per diversi secondi con registrazioni di patch di avvio a bassa pressione, clamp e fluorescenza tramite il segnale di trigger. Durante la profusione locale del composto in gabbia, il fascio di eccitazione viene completamente oscurato per evitare lo sbiancamento. Quindi, fermare la profusione locale del composto in gabbia.Quindi aumentare l'intensità del laser a due fotoni per consentire un'eccitazione efficiente di SBFI e applicare un flash UV per inizializzare sul monitor di gabbia le variazioni della fluorescenza SBFI e della corrente somatica e procedere all'interruzione della registrazione dopo che la fluorescenza SBFI è tornata alla linea di base. Per ottenere la morfologia, registrare una pila XY, Z della regione della clip box impostata per le misurazioni eseguite. Assicurarsi che questo stack sia sovracampionato spazialmente per consentire una deconvoluzione ottimale dell'immagine e aumentare la qualità e la risoluzione dell'immagine.Il caricamento dei neuroni con SBFI attraverso la pipetta patch ha permesso la visualizzazione dell'intera cellula, compresi i dendriti fini e le spine adiacenti impiegando l'eccitazione multifotone dopo la perfusione locale con glutammato in gabbia. L'applicazione di un flash UV vicino a un dendrite ha provocato una diminuzione transitoria dell'emissione fluorescente di SBFI che riflette un aumento della concentrazione intracellulare di sodio. Allo stesso tempo, è stata registrata una corrente verso l'interno durante l'applicazione SOMA di un flash UV su fette che non erano state pre-perfuse con glutammato in gabbia.Non ha mai suscitato cambiamenti nella fluorescenza SBFI né correnti interne che indichino che questi segnali siano dovuti alla disgregazione del glutammato. Le ampiezze di picco erano leggermente più alte nelle spine vicine al punto di apertura della gabbia, mentre i modelli per le spine successive assomigliavano al dendrite genitore. La via per l'afflusso di sodio nei dendriti e nelle spine in risposta allo sganciamento del glutammato è stata studiata utilizzando bloccanti selettivi per i recettori ionotropici del glutammato permeabili al sodio, i segnali intracellulari del sodio indotti dal glutammato e le correnti somatiche suscitate sono state omesse in presenza di questi bloccanti.Dopo il lavaggio dei bloccanti, i segnali vengono recuperati, dimostrando che l'ingabbiamento del glutammato attiva i recettori citotropi del glutammato sui neuroni piramidali di circa uno, con conseguente transitorio intracellulare del sodio e correnti interne. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di scegliere l'intensità più bassa possibile per il laser a infrarossi per ridurre al minimo eventuali danni alla preparazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione delle fasi critiche del nostro approccio sperimentale per studiare la segnalazione del sodio nei micro resti cellulari Una volta padroneggiata, questa tecnica consente l'imaging ad alta risoluzione dell'attività evocata dai segnali ionici intracellulari nel tessuto intatto, che è privo di artefatti di movimento come introdotto da altre tecniche.

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