Multi-fotone intracellulare di sodio Imaging Combinato con UV-mediata uncaging focale di glutammato in neuroni piramidali CA1

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di evocare e analizzare la dinamica del sodio in piccoli compartimenti cellulari, come spine e dendriti di neuroni centrali nel tessuto intatto. Ciò si ottiene preparando prima una fetta acuta dell'ippocampo di topo, caricando un neurone piramidale con il colorante fluorescente sensibile al sodio SBFI attraverso una pipetta di cerotti e visualizzando la morfologia cellulare utilizzando l'eccitazione multifotonica. I prossimi passi sono scegliere un dendrite spinoso per l'esperimento e iniettare un composto fotoattivato come il glutammato in gabbia vicino a questo dendrite.

Un flash UV viene quindi applicato al glutammato di Foley non ingabbiato utilizzando un laser UV che è stato accuratamente posizionato per mirare a un piccolo volume vicino al dendrite scelto. Il passo finale consiste nel monitorare le variazioni risultanti nella fluorescenza SBFI nel dendrite e monitorare le variazioni risultanti nel sodio nelle spine adiacenti. Vengono registrate anche le correnti di membrana che le accompagnano.

In definitiva, l'utilizzo di strumenti farmacologici appropriati come i bloccanti recettoriali consentirà lo studio dei meccanismi che generano i segnali intracellulari di sodio evocati. Questo metodo fornisce uno strumento affidabile per lo studio dei segnali intracellulari del sodio in piccoli compartimenti cellulari e nel tessuto cerebrale intatto. Qui combiniamo il patch clamp a cellula intera e l'imaging multifotone al sodio con una procedura modificata per l'uncaging indotto dalla luce UV.

Ci permette di monitorare le risposte cellulari in caso di applicazioni precise e focali di composti neuroattivi. La procedura sarà dimostrata da Karl KA e da Kaan Kleinhans, uno studente laureato nel mio laboratorio. Per iniziare la dissezione del tessuto, posizionare immediatamente il cervello in una capsula di Petri con dissezione ghiacciata, liquido cerebrospinale artificiale o A CSF e sezionare un emisfero eseguendo un taglio sagittale lungo la linea mediana.

Eseguire un secondo taglio con l'orientamento desiderato come superficie di blocco. Quindi attaccalo alla fase di taglio di un vibram con super colla. Dopo aver estratto la camera di taglio e l'elemento di raffreddamento del vibram dal congelatore, posizionare il tavolino di taglio con la sezione del cervello nella camera.

Quindi inserire l'elemento di raffreddamento nella camera e immergere il tessuto nella dissezione ghiacciata A CSF. Successivamente tagliare 250 micrometri di spessore. Fette para sagittali dell'ippocampo con un vioma.

Assicurarsi che i fluidi CS siano sempre gorgogliati. Dopo l'affettatura, tenere il fazzoletto su una rete in un becher con un normale A CSF e incubare a 34 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, mantenere il tessuto a temperatura ambiente.

Questo esperimento dovrebbe essere eseguito in un ambiente buio, ma viene mostrato qui in condizioni di scarsa illuminazione per scopi di ripresa. Per preparare prima l'hardware, accendere i componenti del sistema multifotone e regolare l'allineamento del raggio laser a infrarossi come descritto nel protocollo di testo. Quindi regolare la lunghezza d'onda del laser multifotone e l'intensità del raggio modificando le impostazioni della cella pcal e dei moltiplicatori fotografici.

Successivamente, accendere e calibrare il sistema di disingabbiamento posizionando un vetrino fluorescente per campioni sotto la lente dell'obiettivo. Avviare la routine di calibrazione del software di controllo dell'unità di disingabbiamento. Imposta il laser UV su diversi punti all'interno del suo raggio di scansione mentre la fluorescenza viene catturata con una telecamera CCD facendo clic sul punto del laser UV.

In ogni punto, regolare il posizionamento degli specchi di scansione galvanica in modo che corrisponda a una determinata coordinata nel software. Il posizionamento accurato del punto di disinserimento si ottiene importando un'immagine del sistema di imaging tramite una connessione di rete tra i computer di disingabbiamento e di imaging. Utilizzando il software di cattura dello schermo, leggere continuamente i fotogrammi del software di imaging e regolare l'imaging.

E al termine, i fotogrammi di ingabbiamento esportano in modo congruente ogni 10 fotogrammi dal software di imaging come immagine di riferimento nell'unità flash per garantire una corretta regolazione durante l'intero esperimento. Quindi, accendere i componenti di elettrofisiologia dei micromanipolatori e il dispositivo di applicazione della pressione per la consegna del composto in gabbia nella regione target. Estrarre le pipette per il patch clamp a cellule intere e la profusione locale utilizzando capillari in vetro silicato di boro lucidato a fuoco.

Quindi posizionare la fetta nel bagno sperimentale e fissarla con una griglia, posizionare il bagno al microscopio e perfondere permanentemente la fetta con A CSF. Iniziare il bloccaggio del cerotto a cellula intera caricando la pipetta del cerotto con una soluzione intracellulare o un ICS contenente SBFI, quindi caricare la pipetta di perfusione locale con un composto in gabbia. Collegare le pipette ai micromanipolatori corrispondenti e posizionare l'elettrodo di riferimento nella vasca.

Scegliere una cella piramidale CA one con un soma che si trova da 30 a 70 micrometri sotto la superficie della fetta per garantire una morfologia cellulare intatta, nonché una bassa dispersione e attenuazione del fascio di disingabbiamento. Avvicinati a questa cellula con una pipetta patch che utilizza la microscopia video IR DIC. Applicare un'aspirazione delicata fino ad ottenere una tenuta giga.

Compensa la capacità rapida. Quindi rompere la membrana e aprire la cella per ottenere la configurazione cellulare. Infine, valutare la vitalità delle celle in modalità current clamp.

Iniettare una corrente depolarizzante e verificare la presenza di picchi risultanti per eseguire l'imaging e la stimolazione. Innanzitutto, aggiungere tetro DOIND ad A CSF per prevenire l'attivazione dei canali del sodio voltaggio-dipendenti e la generazione di potenziali d'azione. Visualizza la morfologia cellulare utilizzando l'eccitazione multifotone e la conseguente fluorescenza SBFI.

Scegli un dendrite spinoso per l'esperimento. Ingrandisci le immagini a una risoluzione più alta e posiziona una casella di ritaglio attorno al dendrite. Quindi posizionare la pipetta con il composto in gabbia vicino al dendrite.

Posizionare la pipetta in modo da consentire un'efficiente perfusione locale del dendrite scelto. Regolare il laser di sblocco per posizionare il punto di sblocco vicino alla struttura di interesse. Successivamente, imposta le regioni di interesse sul dendrite scelto e sulle spine adiacenti utilizzando il software di imaging.

Avvicinati alla regione di interesse e inietta il composto in gabbia per diversi secondi con registrazioni di patch di avvio a bassa pressione, clamp e fluorescenza tramite il segnale di trigger. Durante la profusione locale del composto in gabbia, il fascio di eccitazione viene completamente oscurato per evitare lo sbiancamento. Quindi, fermare la profusione locale del composto in gabbia.

Quindi aumentare l'intensità del laser a due fotoni per consentire un'eccitazione efficiente di SBFI e applicare un flash UV per inizializzare sul monitor di gabbia le variazioni della fluorescenza SBFI e della corrente somatica e procedere all'interruzione della registrazione dopo che la fluorescenza SBFI è tornata alla linea di base. Per ottenere la morfologia, registrare una pila XY, Z della regione della clip box impostata per le misurazioni eseguite. Assicurarsi che questo stack sia sovracampionato spazialmente per consentire una deconvoluzione ottimale dell'immagine e aumentare la qualità e la risoluzione dell'immagine.

Il caricamento dei neuroni con SBFI attraverso la pipetta patch ha permesso la visualizzazione dell'intera cellula, compresi i dendriti fini e le spine adiacenti impiegando l'eccitazione multifotone dopo la perfusione locale con glutammato in gabbia. L'applicazione di un flash UV vicino a un dendrite ha provocato una diminuzione transitoria dell'emissione fluorescente di SBFI che riflette un aumento della concentrazione intracellulare di sodio. Allo stesso tempo, è stata registrata una corrente verso l'interno durante l'applicazione SOMA di un flash UV su fette che non erano state pre-perfuse con glutammato in gabbia.

Non ha mai suscitato cambiamenti nella fluorescenza SBFI né correnti interne che indichino che questi segnali siano dovuti alla disgregazione del glutammato. Le ampiezze di picco erano leggermente più alte nelle spine vicine al punto di apertura della gabbia, mentre i modelli per le spine successive assomigliavano al dendrite genitore. La via per l'afflusso di sodio nei dendriti e nelle spine in risposta allo sganciamento del glutammato è stata studiata utilizzando bloccanti selettivi per i recettori ionotropici del glutammato permeabili al sodio, i segnali intracellulari del sodio indotti dal glutammato e le correnti somatiche suscitate sono state omesse in presenza di questi bloccanti.

Dopo il lavaggio dei bloccanti, i segnali vengono recuperati, dimostrando che l'ingabbiamento del glutammato attiva i recettori citotropi del glutammato sui neuroni piramidali di circa uno, con conseguente transitorio intracellulare del sodio e correnti interne. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di scegliere l'intensità più bassa possibile per il laser a infrarossi per ridurre al minimo eventuali danni alla preparazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione delle fasi critiche del nostro approccio sperimentale per studiare la segnalazione del sodio nei micro resti cellulari Una volta padroneggiata, questa tecnica consente l'imaging ad alta risoluzione dell'attività evocata dai segnali ionici intracellulari nel tessuto intatto, che è privo di artefatti di movimento come introdotto da altre tecniche.