Name: Saggi tossicologici per gli effetti di prova di un epigenetica droga sullo sviluppo, Fecondità e Sopravvivenza di malaria zanzare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Scopri i saggi tossicologici con il farmaco epigenetico DZNep su zanzare della malaria. Valuta gli effetti su sviluppo larvale, fecondità e sopravvivenza per strategie di controllo delle popolazioni.

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Ringraziamo Victor Marquez per aver fornito DZNep.HCl e Scotty Bolling per la produzione degli alimentatori di sangue. I ceppi Mopti e SUA2La di An. gambiae sono stati ottenuti dal Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). Questo lavoro è stato sostenuto dal Fralin Life Science Institute e dalla sovvenzione del National Institutes of Health 1R21AI094289 a Igor V. Sharakhov.

NOTA: Le tre parti del protocollo descrivono l&#39;esposizione acquosa del farmaco DZNep alle zanzare larvali, un&#39;esposizione a base di sangue di DZNep per femmine adulte di studiare l&#39;effetto della fecondità, e SAH idrolasi inibizione da DZNep misurati utilizzando una semplice tecnica colorimetrica. Una rappresentazione schematica di questi test è mostrato in figura 1. 1. immaturi Mosquito sviluppo e la sopravvivenza saggi NOTA: Questa sezione spiega l&#39;uso di un farmaco solubile in acqua che colpisce lo sviluppo larve di zanzara e la sopravvivenza. <ol><li> Hatch A. uova gambiae a 28 ° C in acqua distillata (dH 2 O) e posteriore loro di 2 ° instar larve. </li><li> Prendete un DNAse sei bene, RNAse gratuito piastra di coltura cellulare e versare 10 ml dH 2 O per ogni bene. </li><li> Selezionare le larve di zanzara al 2 ° instar e aggiungere 15 larve per bene. Prima di aggiungere 2 ° instar larve alla piastra, pli ut su un tovagliolo di carta per 2-3 secondi per eliminare l&#39;acqua in eccesso. </li><li> Pozzi Label con nastri colorati di randomizzare esperimento. Etichetta 2 pozzetti per concentrazione di prova su ciascuna piastra (Figura 2). </li><li> Preparare una cloridrato 1 DZNep mm (MW = 298,73) stock soluzione sciogliendo 0,3 mg DZNep in 1 ml di dH 2 O. Aggiungere soluzione madre di DZNep.HCl ai pozzi etichettati per ottenere una concentrazione finale di 0,5 micron e 5,0 micron. NOTA: La soluzione madre può essere conservato a 4 ° C per il breve termine (1 giorno a un mese) o -20 ° C per un lungo periodo (più di un mese). NOTA: aggiunta della soluzione stock con concentrazioni suddetti non cambierà il volume di acqua nei pozzi significativamente. Tuttavia nel caso di concentrazioni molto più elevate, si consiglia di sciogliere il composto nel mezzo larvale per evitare qualsiasi diluizione inutili del composto. </li><li> Aggiungere la stessa quantità di cibo per pesci fiocco di ogni bene. Coprire la piastras e incubare a 28 ° C in un incubatore. </li><li> Registrare la mortalità per le zanzare larve DZNep-trattati e non trattati, dopo un periodo di esposizione di 24 ore. Rimuovere e scartare qualsiasi larve morte. Ripetere questa registrazione ogni giorno fino a quando tutti muoiono larve o pupate ed emergere come gli adulti. Registrare le dimensioni delle larve ogni due giorni, ossia, il giorno 0, 2, 4, 6, 8, fino pupate. </li><li> Analizzare lo sviluppo e mortalità larvale dati mediante un adeguato software di analisi statistica. NOTA: Un grafico a barre può essere utilizzato per rappresentare i dati di mortalità in Microsoft Excel. Analisi multivariata della varianza (MANOVA) eseguita con un software come JMP o SPSS rivelerà se diverse dosi del farmaco determinano sopravvivenza significativamente differente di larve di zanzara. </li></ol> 2. Fecondità Assay somministrando Drug Attraverso alimentatore artificiale a Female zanzare NOTA: Questa sezione descrive l&#39;aggiunta del farmaco al sangue unnd alimentandola a zanzare femmina adulti utilizzando un sistema di alimentazione artificiale. <ol><li> Impostare gabbie zanzara adulta, con uguale numero di zanzare maschio e femmina per il controllo e la gabbia di prova. Fornire una soluzione di zucchero del 10% imbevuto di batuffoli di cotone per entrambe le gabbie fino le femmine sono pronte per l&#39;alimentazione (3-5 giorni è ottimale per la Anopheles gambiae). </li><li> 2 ore prima della somministrazione di sangue, rimuovere le palline di cotone per assicurare le femmine sono affamati. </li><li> Assemblare due alimentatori sanguigni artificiali che consistono di un ampio imbuto rovesciato fondo di vetro (diametro = 50 mm, lunghezza = 70 mm) e una plastica circostante sigillato con colla industriale. Montare tubi di plastica (diametro = 7 mm) a due uscite alimentatori &quot;(diametro 10 mm) tramite connettori per afflusso e il deflusso delle acque. Etichettare i due alimentatori come &quot;controllo&quot; e &quot;5 micron DZNep.&quot; </li><li> Utilizzando un elemento riscaldante disponibile in commercio, impostare il programma per l&#39;alimentazione. In &quot;Menu&quot; andare su &quot;Impostazioni&quot;e selezionare &quot;Valori di riferimento&quot;; appariranno programmi precaricati. Selezionare &quot;SP1&quot; e impostare la temperatura per 37 ° C. NOTA: La resistenza assicura che il sangue somministrata viene mantenuto ad una temperatura costante. Impostazioni del programma aggiuntive possono essere utilizzate per diverse specie di zanzare o di insetti. </li><li> Riempire un secchio con acqua e immergere l&#39;elemento riscaldante in acqua. </li><li> Tagliare un pezzo quadrato di Parafilm (50 mm x 50 mm) e si estendono per fare un film sottile membranosa. Coprire il fondo delle mangiatoie artificiali con il Parafilm. Tagliare un altro pezzo di Parafilm (50 mm x 10 mm), allungare e sigillare i bordi degli alimentatori. </li><li> Assemblare il sistema, collegando gli alimentatori e resistenza dai tubi. Una volta completato, accendere il sistema e selezionare &quot;SP1&quot;. Premere &quot;Enter&quot; per avviare il sistema. NOTA: L&#39;acqua avrà riscaldata a 37 ° C e mantenuta a tale temperatura. </li><li> Monitor the la temperatura dell&#39;acqua con un termometro nel secchio d&#39;acqua. NOTA: I connettori e tubi aiutano a mantenere una costante circolazione di acqua attraverso il sistema in modo che la temperatura del sangue rimane a 37 ° C. </li><li> Riempire un vassoio fondo piatto con una soluzione di candeggina al 10% che verrà utilizzata per decontaminare eventuali sversamenti di sangue. </li><li> Aggiungere 2 ml di sangue di pecora defibrillato in una provetta. Etichettare questo come &quot;Control&quot;. Ripetere il processo per il tubo sperimentale etichettato come &quot;5 micron DZNep&quot; Add 6 ml di soluzione di riserva DZNep (vedi punto 1.5) al tubo sperimentale con l&#39;etichetta &quot;5 micron DZNep&quot; mescolare delicatamente il sangue e droga invertendo più volte. Incubare il tubo 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Utilizzando una pipetta, aggiungere 2 ml di controllo e di sangue di prova per la parte superiore di alimentatori corrispondentemente etichettati. Gettare la pipetta nella soluzione di candeggina. Coprire la gabbia con un sacchetto scuro e respirare l&#39;aria sulla gabbia periodicamente per incoraggiare females per l&#39;alimentazione. </li><li> Lasciate che le zanzare si nutrono per circa 30 min. Una volta che l&#39;alimentazione è completata, spegnere la resistenza, prendere le mangiatoie fuori e striscia la Parafilm. Mettere a bagno l&#39;alimentatore in soluzione di candeggina per circa 5 minuti e risciacquare bene con acqua deionizzata. </li><li> Rimuovere gli alimentatori e mettere batuffoli di cotone con acqua e zucchero sulle gabbie per 48 ore. Inserire un piatto di uova contenente acqua e carta da filtro nelle gabbie durante la notte per facilitare la deposizione delle uova. Etichettare ogni piatto di uova con la rispettiva concentrazione di prova o di controllo. </li><li> Rimuovere il piatto di uova giorno successivo ed esaminare il numero e la struttura di uova al microscopio stereo. Ottenere immagini utilizzando il software Q-colors5. Contare il numero di uova. Analizzare differenza nel numero di uova provenienti da test e di controllo gabbie. NOTA: Un t-test non appaiati può essere utilizzato per determinare se il numero di uova sono significativamente differenti (p ≤0.05). </li></ol> 3. biochimica Assay di Mosquito Enzyme Inhibitionby Drug NOTA: Questa sezione descrive un saggio di attività enzimatica utilizzando DTNB come indicatore per determinare l&#39;effetto di DZNep su SAH idrolasi inibizione in maschio adulto e zanzare femmina. <ol><li> Preparare una soluzione 0,1 M Na 2 HPO 4 (sodio fosfato bibasico) aggiungendo 14,19 g di Na 2 HPO 4 a 1 L di dH 2 O. Quindi, preparare una soluzione 0,1 M NaH 2 PO 4 (sodio fosfato monobasico) aggiungendo 13,79 g di NaH 2 PO 4 a 1 L di dH 2 O. </li><li> Titolare il M Na 2 HPO 4 soluzione 0.1 con la soluzione 4 0.1 M NaH 2 PO a pH 8,5. NOTA: Questa sarà la soluzione madre di lavoro di 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). </li><li> Preparare una soluzione di omogeneizzazione 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) aggiungendo 0,3% Triton X-100. NOTA: La soluzione di omogeneizzazione può essere conservato a 4 ° C. </li><li> Prepare una soluzione 1.6 mM SAH (MW = 384,4) sciogliendo 6,15 mg di SAH in 10 ml di 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). </li><li> Preparare una soluzione 1.6 mM DTNB (MW = 396.4) sciogliendo 6,3 mg di DTNB in 10 ml di 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). Mantenere la soluzione DTNB fresco sul ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Preparare una DZNep.HCl 1 mM (MW = 298,73) soluzione sciogliendo 0,3 mg di DZNep in 1 ml dH 2 O. Successivamente, diluire la soluzione 1 mM DZNep in una serie di concentrazioni da 1,000 a 0,002 mM mM in dH 2 O. </li><li> Per misurare la SAH idrolasi inibizione da DZNep, preparare un estratto enzimatico crudo di zanzare: Omogeneizzare 10 zanzare adulte non sangue-fed in 1 ml di ghiacciata 0,1 M NaH 2 PO 4 (pH 8,5), contenente 0,3% Triton X- 100, utilizzando un omogeneizzatore fibra di vetro. Trasferire l&#39;omogeneizzato in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Centrifugare l&#39;omogeneizzato per 5 minuti a 10.000 xg a 4 ° C. Trasferire il surnatante in un ambiente pulito1,5 ml provetta. Utilizzare il surnatante come fonte dell&#39;enzima per il saggio biochimico SAH. </li><li> Per il trattamento vuota (cioè non DZNep, senza enzimi), aggiungere 50 microlitri 1.6 SAH mM, 50 microlitri 1.6 DTNB mM, e 100 microlitri 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) per i singoli pozzetti di una 96 pozzetti, micropiastra fondo piatto. </li><li> Per il controllo (cioè non DZNep), aggiungere 50 microlitri 1.6 SAH mM, 50 microlitri 1.6 DTNB mM, 50 microlitri 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) e 50 microlitri enzima (SAH idrolasi ottenuto da estratto grezzo) all&#39;individuo pozzi. </li><li> Per i trattamenti DZNep, aggiungere 50 ml 1.6 SAH mm, 50 ml 1.6 DTNB mm, 50 microlitri di enzimi e 50 ml concentrazione DZNep selezionato singoli pozzi. Preparare 4 repliche per il trattamento e il controllo. </li><li> Leggere la densità ottica (OD) dei campioni enzimatici SAH a 405 nm per 5 minuti a intervalli di 20 sec utilizzando un lettore di micropiastre a 96 pozzetti. </li><li> Sottrarre la DO vuoto dal controllo di unnd trattamento OD ottenuto da ciascun pozzetto. Calcolare la percentuale rimanente attività di idrolasi SAH utilizzando la seguente equazione:% residuo attività = (Trattamento OD / controllo OD) x 100. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ci sono diversi passaggi vitali per l&#39;efficace applicazione di questo protocollo. Per il saggio larvale, occorre prestare attenzione a etichettare e replicare ogni concentrazione correttamente. Randomizzazione campioni di prova e aggiungendo la quantità di farmaco designato a rispettivi pozzetti di test è una parte importante di questo set up sperimentale. Prima di aggiungere 2 ° instar larve di zanzara ad una micropiastra a 96 pozzetti, ogni larva può essere messo su un tovagliolo di carta per 2-3 second...

La malaria è responsabile per il maggior numero di decessi insetti correlati al mondo. Si stima che circa 219 milioni di casi si verificano ogni anno in tutto il mondo, causando circa 660.000 morti, soprattutto in Africa 1. Nonostante gli sforzi concertati, la malaria programmi devono affrontare diverse sfide. Mentre insetticide trattati zanzariere e coperte componenti chiave forma irrorazione residue del programma, la resistenza agli insetticidi in popolazioni locali ostacolano questi sforzi 2. Il rapido aumento delle popolazioni di zanzare resistenti agli insetticidi è in gran parte attribuibile alla capacità delle zanzare di malaria di adattarsi rapidamente ai cambiamenti nel loro ambiente e sfruttare diverse nicchie 3,4,5. Per superare gli attuali meccanismi di resistenza agli insetticidi, l&#39;esplorazione di nuovi obiettivi insetticida e composti di nuova generazione è garantito. Un protocollo semplice, step-by-step per determinare l&#39;efficacia di insetticidi sperimentali sulle diverse fasi di vita della malaria mosquitoes avrebbero migliorare significativamente questi sforzi. Studi farmacologici di effetti dei farmaci sulle linee cellulari e modelli animali hanno stabilito l&#39;uso di farmaci epigenetici come un utile strumento per modulare la genetica e la fisiologia delle cellule e degli organismi. Metilazione del DNA e modificazione degli istoni sono due meccanismi epigenetici che influenzano l&#39;espressione genica in organismi pluricellulari senza cambiare la sequenza del DNA sottostante 6. Modificazioni post traduzionali quali metilazione svolgono un ruolo cruciale nel mantenimento dell&#39;integrità cellulare e l&#39;espressione genica, e possono influenzare alcuni processi fondamentali 7,8,9. La ricerca in alcune specie di insetti hanno evidenziato l&#39;importanza di epigenetica in processi che coinvolgono oogenesi e staminali manutenzione cella 10, così come compensazione del dosaggio 11. Tuttavia, sono ancora da esplorare questi aspetti in vettori di malattie. Utilizzo di un composto a modulare questo sistema in zanzare potrebbe fornirci inluoghi nel romanzo percorsi di destinazione insetticida. 3-Deazaneplanocin A (DZNep) è un inibitore della metilazione dell&#39;istone noto, che hanno un impatto su vari tipi di tumori sono stati studiati 12,13,14,15,16. DZNep è un farmaco stabile idrosolubile epigenetica che inibisce indirettamente istone lisina N -methyltransferase (EZH2), un componente del complesso Polycomb repressione 2 (PRC2) in cellule di mammifero. PRC2 svolge un ruolo importante nel regolare la crescita delle cellule staminali in organismi pluricellulari, e metilazione è un aspetto fondamentale della PRC2 mediato silenziamento genico. Nei topi immunocompromessi, cellule pre-trattati con DZNep hanno dimostrato di essere meno cancerogeno 17. Questo farmaco sta diventando utilizzato per lo studio di altre malattie, come la malattia del fegato grasso non-alcolica, in cui è implicato EZH2 18. DZNep è un consolidato S -adenosylhomocysteine ​​(SAH) inibitore idrolasi 19, 20. L&#39;inibizione dei risultati idrolasi SAH in unaccumulo di SAH e, a sua volta, porta alla inibizione dell&#39;attività metiltransferasi limitando gruppi donatori di metile disponibili. SAH è un derivato aminoacido utilizzato da molti organismi, inclusi gli insetti, nelle loro vie metaboliche. Un recente studio ha dimostrato che DZNep in basse dosi possono influenzare diapausa e ritardare lo sviluppo negli insetti 21. Qui, un protocollo robusto per studiare gli effetti di un composto solubile in acqua su diverse fasi di vita di zanzare si sviluppa. Le tre parti di questo protocollo sono le istruzioni per esaminare gli effetti di un composto idrosolubile sulle zanzare immaturi, adulti femmine si nutrono di sangue, e l&#39;attività enzimatica di maschio adulto e zanzare femmina. Innanzitutto, DZNep viene sciolto in acqua per studiare lo sviluppo zanzara immaturo e sopravvivenza. Questa operazione viene eseguita in due concentrazioni di confrontare le differenze derivanti da aumento di 10 volte in esposizione al farmaco. Per esplorare l&#39;effetto del farmaco sulla adulti zanzare femmina, DZNepsi aggiunge al sangue di pecora defibrillato e alimentato artificialmente il sangue alle femmine. Successivamente, il risultato del farmaco sulla fecondità viene esaminato. Infine, un saggio di attività enzimatica viene eseguita utilizzando 5,5&#39;-dithiobis- (acido 2-nitrobenzoico) (DTNB) come indicatore per determinare l&#39;effetto di DZNep sulla SAH idrolasi inibizione maschio adulto e zanzare femmina. Mentre questo protocollo è sviluppato con una zanzara malaria, Anopheles gambiae, può essere facilmente adattato per studiare gli effetti dei composti di interesse in qualsiasi specie di zanzara o altri insetti. Le tecniche descritti in questo protocollo non possono essere applicate in modo efficiente per un farmaco con limitata o nessuna solubilità in acqua o mezzi acquosi.

<table><tbody><tr><td>micropiastra a 96 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565561</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Sorvall Fresco</td><td>76003758</td><td>È possibile utilizzare una centrifuga diversa</td></tr><tr><td>Rotoli di nastro adesivo colorati</td><td>Fisher</td><td>S68134</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio di dissezione</td><td>Olympus</td><td>SZ</td><td></td></tr><tr><td>DTNB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>DZNep.HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SMLO305</td><td></td></tr><tr>Tazze <td></td><td></td><td></td><td>per piatti per uova</td></tr><tr><td>Carte da filtro</td><td>Fisher</td><td>09-795E</td><td></td></tr><tr><td>Alimentatori in vetro</td><td>Virginia Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore</td><td></td><td></td><td></td>per tessuti in vetro</tr><tr><td>Elemento riscaldante</td><td>Fisher</td><td>Scientific NC0520091</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice</td><td>Percival scientific</td><td>I36VLC8</td><td>È possibile utilizzare un'incubatrice diversa</td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga, 2&nbsp; ml</td><td>Axygen</td><td>22-283</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga, 1,5&nbsp; ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetta</td><td>Eppendorf</td><td>4910 000.069</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-3154</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-8643</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di pH&nbsp;</td><td>Mettler Toledo 7easy</td><td>S20</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di lastre</td><td>Spectramax</td><td>M2</td><td></td></tr><tr><td>SAH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9384</td><td>negozio a -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

saggi tossicologici per gli effetti di prova di un epigenetica droga sullo sviluppo, fecondità e sopravvivenza di malaria zanzare

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Resistenza insetticida pone un grave problema per i programmi di controllo della malaria. Le zanzare si adattano a una vasta gamma di cambiamenti nell&#39;ambiente rapidamente, rendendo il controllo della malaria un problema onnipresente nei paesi tropicali. L&#39;emergere di popolazioni resistenti agli insetticidi garantisce l&#39;esplorazione di nuovi percorsi di destinazione della droga e composti per il controllo del vettore zanzara. Farmaci epigenetici sono ben stabiliti nella ricerca sul cancro, tuttavia, non si sa molto circa i loro effetti sugli insetti. Questo studio fornisce un semplice protocollo per esaminare gli effetti tossicologici di 3 Deazaneplanocin A (DZNep), un farmaco epigenetico sperimentale per la terapia del cancro, sul vettore della malaria, Anopheles gambiae. Un aumento di concentrazione-dipendente della mortalità e riduzione delle dimensioni è stata osservata in zanzare immaturi esposti a DZNep, mentre il composto ha ridotto la fecondità delle zanzare adulte rispetto a controllare i trattamenti. Inoltre, c&#39;è stata una diminuzione tossicodipendenti in S -adenosilomocisteina (SAH) attività di idrolasi in zanzare in seguito all&#39;esposizione a DZNep rispetto per controllare i trattamenti. Questi protocolli forniscono il ricercatore con una semplice procedura, step-by-step per valutare più endpoint tossicologici per un farmaco sperimentale e, a sua volta, dimostrano un approccio multi-polo unico per esplorare gli effetti tossicologici di farmaci o composti di epigenetici idrosolubili interessi contro le zanzare vettore e altri insetti.

La figura 1 è una rappresentazione schematica dei saggi; descrive le varie fasi della procedura descritta in questo articolo. Poiché il protocollo si basa su diversi cicli di vita zanzare, non vi è alcuna particolare sequenza da seguire per gli esperimenti qui descritti. L'utente può scegliere di effettuare uno o più test contemporaneamente, a seconda della disponibilità di esempio. Figura 2 mostra la piastra impostato per lo sviluppo e la sopravviven...

Viene sviluppato un protocollo per esaminare gli effetti di un farmaco epigenetico DZNep sullo sviluppo, la fecondità e la sopravvivenza delle zanzare. Qui descriviamo le procedure per l'esposizione acquosa di DZNep a zanzare immature e un'esposizione ematica di DZNep a zanzare adulte, oltre a misurare l'inibizione dell'idrolasi SAH.

Saggi tossicologici per gli effetti di prova di un epigenetica droga sullo sviluppo, Fecondità e Sopravvivenza di malaria zanzare

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di esaminare gli effetti di un farmaco epigenetico su varie fasi della vita delle zanzare malariche. Ciò si ottiene sciogliendo il farmaco nell'habitat delle zanzare immature per determinarne gli effetti sulle larve, sulla sopravvivenza e sulle dimensioni corporee. Il farmaco viene anche aggiunto al sangue dei mammiferi e somministrato alle zanzare femmine adulte, che testeranno l'effetto del farmaco sulla riproduzione.Infine, viene condotto un test enzimatico per testare l'inibizione dell'enzima zanzara da parte del farmaco. I risultati mostrano gli effetti dei cambiamenti epigenetici sulla sopravvivenza della zanzara malarica e per Conti, sulla base dell'analisi del biodosaggio, abbiamo avuto l'idea di questo protocollo. Quando veniamo a conoscenza dello sviluppo di un promettente farmaco epigenetico anti-cancro, questo farmaco induce la morte apoptotica nelle cellule tumorali umane come meccanismi per l'istomodificazione sono animali ormonali conservati, abbiamo una sorta di degustazione come un'app di effetto sulla zanzara della malaria.Per iniziare, seleziona le larve di zanzara Novelis Gambi al secondo posto in stella e mettile su un tovagliolo di carta per due o tre secondi per rimuovere l'acqua in eccesso. Quindi aggiungere delicatamente 15 larve per pozzetto di una piastra di coltura cellulare priva di nucleasi a sei pozzetti contenente 10 litri di acqua distillata per pozzetto. Etichetta i pozzetti con nastri colorati per randomizzare l'esperimento.Quindi etichettare due pozzetti per concentrazione di prova su ciascuna piastra. Successivamente, preparare una soluzione madre di deasy NEP cloridrato da un millimolare sciogliendo 0,3 milligrammi di deasy nep. In un millilitro di acqua distillata, aggiungere la soluzione madre di Z NEP cloridrato ai pozzetti etichettati per ottenere una concentrazione finale di 0,5 micromolari e 5,0 micromolari.L'aggiunta della soluzione madre per le suddette concentrazioni non modificherà in modo significativo il volume dell'acqua nel pozzo. Tuttavia, in caso di concentrazioni molto più elevate, è consigliabile sciogliere il composto nel mezzo larvale per evitare qualsiasi diluizione non necessaria del composto. Dopo l'aggiunta del composto, nutrire e incubare le larve per 24 ore a 28 gradi Celsius.Quindi registrare la mortalità per le zanzare larvali trattate con DZ NEP e non trattate. Ripetendo questa registrazione ogni giorno fino a quando tutte le larve muoiono o si impupano ed emergono. Da adulti, rimuovere e scartare le larve morte ogni giorno.Inoltre, registrare le dimensioni delle larve ogni due giorni fino a quando non si preparano per eseguire il test di fecondità. Innanzitutto, assemblare il sistema di alimentazione artificiale che collega gli alimentatori e l'elemento riscaldante tramite i tubi. Una volta completato, accendi il sistema e seleziona SP one.Premere invio per avviare il sistema. Monitorare la temperatura dell'acqua utilizzando un termometro digitale nell'impianto di riscaldamento. I connettori e i tubi aiutano a mantenere una circolazione costante dell'acqua attraverso il sistema, in modo che la temperatura del sangue rimanga.A 37 gradi Celsius. Riempi un vassoio a fondo piatto con una soluzione di candeggina al 10% che verrà utilizzata per decontaminare eventuali fuoriuscite di sangue. Successivamente, aggiungere due millilitri di sangue di pecora defibrillato a una provetta per microcentrifuga ed etichettare come controllo.Ripetere il processo per la provetta sperimentale etichettata come cinque micromolari DZ nep. Quindi aggiungere sei microlitri di soluzione madre DZ NEP alla provetta sperimentale etichettata con cinque micromolari DZ nep. Mescolare delicatamente il sangue e il farmaco capovolgendolo più volte prima di incubare la provetta per 10 minuti a temperatura ambiente.Utilizzando una pipetta, aggiungere due millilitri di controllo e analizzare il sangue sulla parte superiore degli alimentatori etichettati in modo corrispondente. Gettare la pipetta nella soluzione di candeggina. Respira periodicamente l'aria sulla gabbia per incoraggiare le femmine a nutrirsi.Copri la gabbia con un sacchetto scuro. Lascia che le zanzare si nutrano per circa 30 minuti. Una volta completata l'alimentazione, spegnere l'elemento riscaldante.Estrarre gli alimentatori e rimuovere la pellicola di para dopo aver immerso l'alimentatore e la soluzione di candeggina per cinque minuti. Sciacquare bene in acqua deionizzata. Quindi, metti dei batuffoli di cotone con acqua zuccherata sulle gabbie per 48 ore.Posizionare i piatti a base di uova etichettati con la rispettiva concentrazione di prova o di controllo che contengono acqua e carta da filtro nelle gabbie per una notte. Per facilitare la deposizione delle uova, rimuovere il piatto di uova il giorno successivo ed esaminare il numero e la struttura delle uova al microscopio stereoscopico. Ottenere immagini, contare il numero di uova e analizzare la differenza nel numero di uova ottenute da gabbie di prova e di controllo.Questa parte del video mostra un saggio di attività enzimatica che utilizza DTNB come indicatore per determinare l'effetto di dz NEP sull'inibizione di SAH Hydro Lace nelle zanzare adulte. Per misurare l'inibizione di SAH Hydro Lace da parte di DZ nep, preparare l'estratto enzimatico accumulato di zanzare omogeneizzate 10 zanzare adulte non alimentate con sangue in un millilitro di fosfato di sodio monobasico molare 0,1 molare ghiacciato contenente lo 0,3% di tritton X 100. Utilizzando un omogeneizzatore di tessuti di vetro, trasferire l'omogeneizzato in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.Dopo aver centrifugato l'omogeneizzato per cinque minuti a 10.000 g e quattro gradi Celsius, trasferire il supinato in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri. Utilizzare il supinato come fonte enzimatica per il saggio biochimico SAH. Per il bianco, aggiungere 50 microlitri di SAH, 50 microlitri di DTNB e 100 microlitri di fosfato di sodio diba per ottenere una miscela master e aggiungere ai singoli pozzetti di una micropiastra a fondo piatto da 96 pozzetti.Successivamente, per il controllo, aggiungere 50 microlitri di SAH, 50 microlitri di DTNB, 50 microlitri di fosfato di sodio diba e 50 microlitri di enzima idrolace SAH ai singoli pozzetti. Infine, per i trattamenti DZ NEP, aggiungere ai singoli pozzetti 50 microlitri di SAH, 50 microlitri di DTNB, 50 microlitri di enzima e 50 microlitri della concentrazione selezionata di DZ NEP. Prepararsi per le repliche per trattamento e controllo.Leggere la densità ottica o OD dei campioni dell'enzima SAH a 405 nanometri per cinque minuti a intervalli di 22 utilizzando un lettore di micropiastre a 96 pozzetti. Infine sottrarre l'OD bianco dal controllo e dal trattamento ottenuto da ciascun pozzetto e calcolare la percentuale rimanente di attività idro SAH Utilizzando l'equazione trovata nel protocollo di testo, questi risultati dimostrano che il farmaco epigenetico DZ NEP sopprime la crescita e lo sviluppo e induce la mortalità nelle zanzare immature. La maggior parte delle zanzare esposte a 0,5 micromolari è morta entro il decimo giorno dell'esperimento, mentre un gran numero di zanzare esposte a cinque micromolari è morta entro l'ottavo giorno.Al contrario, la mortalità delle zanzare nel trattamento di controllo è rimasta inalterata e molte sono emerse come adulte l'ottavo giorno dell'esperimento. L'effetto della DZ NEP sulla fecondità delle zanzare è illustrato qui. Le zanzare femmine adulte alimentate con sangue contenente DZ NEP hanno mostrato una significativa riduzione del numero di uova vitali rispetto al controllo.Un gran numero di uova ottenute dalla gabbia di prova erano di colore più scuro e mancavano di galleggianti e assemblaggi simili a coccarde rispetto alle uova ottenute da zanzare femmine alimentate con sangue normale. L'assenza di galleggianti insieme a uova di colore più scuro indica il ruolo potenziale dell'epigenetica nella formazione dell'esocorion. Qui è dimostrato l'effetto di DZ NEP sull'attività dell'idrolace SAH nelle zanzare adulte della malaria maschi e femmine.Per ogni trattamento farmacologico si osserva una diminuzione della OD dipendente da DZ NEP rispetto al trattamento di controllo, indicando che la dz NP inibisce l'attività dell'idrolace SAH dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dei vettori per esplorare gli effetti dei farmaci epigenetici sulla zanzara della malaria.

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In questa intervista, George Dimopoulos si concentra sui meccanismi fisiologici utilizzato dalle zanzare per combattere Plasmodium falciparum e infezioni da virus dengue. Spiegazione è data per come i geni chiave refrattari, quei geni che conferiscono resistenza agli agenti patogeni vettore, sono identificati nella zanzara e come questa conoscenza può essere utilizzata per generare le zanzare transgeniche che sono in grado di trasportare il parassita della malaria o il virus dengue.

Costruire un Mosquito migliore: l&#39;identificazione dei geni Abilitazione malaria e febbre dengue Resistenza in A. gambiae e A. aegypti zanzare

In questo video, dimostriamo il test topico per determinare la tossicità di un potenziale insetticida su zanzare femmine adulte. Utilizzando un antagonista del recettore della dopamina che causa l'inibizione letale della neurotrasmissione nelle zanzare, questo metodo descrive un modo per valutare gli effetti tossici degli insetticidi dopo l'applicazione topica.

Test topico: una tecnica per valutare il potenziale insetticida degli antagonisti del recettore della dopamina su zanzare femmine adulte mediante applicazione topica

Questo video mostra un test di alimentazione del sangue per valutare la mortalità e la fecondità dei composti in esame con nuove modalità d'azione sulle zanzare femmine. Questa tecnica aiuta nello screening di nuove classi di insetticidi per uccidere la popolazione resistente di zanzare e controllare la diffusione della malattia.

Test di alimentazione delle zanzare: un metodo per valutare gli effetti dei composti di prova sulla mortalità e la fecondità delle zanzare femmine adulte

A causa delle sorprendenti somiglianze del ciclo di vita e della biologia dei parassiti della malaria dei roditori con i parassiti della malaria umana, i modelli di malaria dei roditori sono diventati indispensabili per la ricerca sulla malaria. Qui, abbiamo standardizzato alcune delle tecniche più importanti utilizzate nell'analisi fenotipica di specie di malaria roditore selvatico e transgenico.

Phenotypic Analisi del roditore Malaria Parassita Sessuale e Sessuale Fasi Sangue e Mosquito Fasi

Protocolli sono descritti per valutare la tossicità delle chimiche alle zanzare immature e adulte per lo sviluppo come nuove classi di larvicidi, adulticides ed endectocidi. I protocolli consentono un elevato throughput test delle chimiche multiple a punto singolo dose e successiva valutazione tramite test di risposta dose per determinare la tossicità per contatto o ingestione.

Protocolli per testare la tossicità di romanzo chimiche insetticide per le zanzare

Descritto è un metodo di risparmio di tempo e spazio per contare le uova e determinare i tassi di schiusa delle singole zanzare utilizzando 24 piastre di coltura tissutale del pozzo, che possono aumentare sostanzialmente la scala e la velocità dei test di fecondità e fertilità.

Test migliorato di fecondità e fertilità per Aedes aegypti utilizzando 24 piastre di coltura dei tessuti dei pozzi (piastre EAgaL)

Descriviamo la metodologia e l'importanza del biotest di applicazione topica per misurare la suscettibilità agli insetticidi nelle zanzare e nei moscerini della frutta. Il test presentato è ad alto rendimento, utilizza la massa degli insetti, consentendo così di calcolare una dose letale relativizzata alla massa anziché la concentrazione, e probabilmente ha una variabilità inferiore rispetto ad altri metodi simili.

Biotest di applicazione topica per quantificare la tossicità degli insetticidi per zanzare e moscerini della frutta

Il test standard di alimentazione a membrana (SMFA) è considerato il gold standard per la valutazione e l'identificazione di potenziali composti antimalarici. Questo sistema di alimentazione artificiale viene utilizzato per infettare le zanzare per valutare ulteriormente gli effetti di tali composti sull'intensità e la prevalenza del parassita Plasmodium falciparum .

Test standard di alimentazione a membrana per la rilevazione dell'infezione da Plasmodium falciparum in vettori di zanzare Anopheles

Data la loro semplice anatomia, i testicoli Anopheles offrono un buon modello citologico per lo studio della spermatogenesi. Questo protocollo descrive l'ibridazione in situ a fluorescenza intera , una tecnica utilizzata per studiare questo processo biologico, nonché il fenotipo di ceppi transgenici che ospitano mutazioni nei geni coinvolti nella produzione di spermatozoi.

Ibridazione in situ a fluorescenza a montaggio intero per studiare la spermatogenesi nella zanzara Anopheles

La genetica chimica prevede la sostituzione di un residuo gatekeeper con un amminoacido contenente una catena laterale diversa nel locus bersaglio. Qui, abbiamo generato un parassita mutante contenente un allele ipomorfico di cdpk1 e identificato le vie compensatorie adottate dal parassita nel background mutante.

Comprensione dello sviluppo di vie compensatorie in un parassita mutante della malaria che ospita allele ipomorfico di chinasi simili alle piante

Lo sviluppo sessuale del Plasmodium avviene nell'intestino medio della zanzara. Prendere di mira le fasi sessuali del parassita è una strategia promettente per bloccare la trasmissione. Abbiamo sviluppato Ookluc, un P. berghei transgenico che esprime nanoluciferasi dopo la formazione dello zigote, consentendo lo screening ad alto rendimento di composti che bloccano la trasmissione. Questo articolo descrive in dettaglio i metodi per lo screening utilizzando Ookluc.

Ookluc: una linea di Plasmodium berghei per l'identificazione di composti che bloccano la trasmissione

Scopri i saggi tossicologici con il farmaco epigenetico DZNep su zanzare della malaria. Valuta gli effetti su sviluppo larvale, fecondità e sopravvivenza per strategie di controllo delle popolazioni.

Saggi tossicologici per gli effetti di prova di un epigenetica droga sullo sviluppo, Fecondità e Sopravvivenza di malaria zanzare (Video) | JoVE Journal

Saggi tossicologici per gli effetti di prova di un epigenetica droga sullo sviluppo, Fecondità e Sopravvivenza di malaria zanzare

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