L'espressione di proteine ​​fluorescenti in Branchiostoma lanceolatum By mRNA iniezione in ovociti non fecondate

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di introdurre l'mRNA, codificante una proteina fluorescente negli ovociti di bronchos stoma lancia latam per consentire l'imaging fluorescente in vivo degli embrioni in via di sviluppo. Ciò si ottiene inducendo prima la deposizione delle uova di amfi ais, maschi e femmine maturi mediante uno shock termico di 24 ore. Dopo lo shock termico, le femmine e i maschi vengono posti in vasche di deposizione delle uova individuali, consentendo la raccolta rispettivamente di ovociti e spermatozoi.

Una volta che i citi sono allineati in un piatto rivestito di polilisina, viene utilizzato un ago per microiniezione appositamente preparato per iniettare la soluzione all'interno del nucleo del citato. La fase finale è la fecondazione del cita con una o cinque gocce di sperma. In definitiva, scansione laser a due fotoni.

La microscopia viene utilizzata per mostrare l'espressione ubiquitaria delle proteine fluorescenti prodotte dal micro mRNA iniettato. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi della microiniezione sono difficili da apprendere a causa delle competenze tecniche richieste che sono impossibili da dettagliare e coprire in stampa. Per iniziare, preparare i piatti rivestiti di polilisina utilizzati per immobilizzare i citi durante l'iniezione.

Per ogni capsula di Petri per colture cellulari da 35 millimetri, coprire il fondo con una soluzione di polilisina e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, trasferisci la soluzione di polilisina in un altro piatto e incuba nuovamente a temperatura ambiente per cinque minuti. Scartare la soluzione e lasciare asciugare le piastre di Petri a testa in giù a temperatura ambiente per due ore.

Una volta asciutti, conservare i piatti rivestiti avvolti in un involucro di plastica a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Per preparare i piatti rivestiti di aros utilizzati per coltivare gli embrioni iniettati, produrre acqua di mare artificiale e acqua ad osmosi inversa. Successivamente, sciogliere gli aros a una concentrazione dell'1% in un SW filtrato ha versato rapidamente la soluzione calda di aros da una piastra di Petri all'altra per garantire un rivestimento molto sottile della capsula.

Avvolgere i piatti ricoperti in Saran wrap e conservare a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Innanzitutto, preparare la miscela per iniezione in RNA e DNA free water phenol. Il rosso colora la soluzione e consente l'identificazione degli embrioni iniettati con successo.

Centrifugare quindi la miscela per pellettare i cristalli e tenerla in ghiaccio fino al momento dell'uso. Quando è pronta, caricare una pipetta da 10 microlitri con 0,5 microlitri della miscela per iniezione, evitando il fondo della provetta dove sono stati pellettati i cristalli. Riempire l'ago per iniezione pipettando la goccia da 0,5 microlitri di iniezione.

Mescolare nell'ampia apertura dell'ago. Preparare due aghi nel caso in cui uno si rompa durante l'iniezione. Conservare gli aghi in un barattolo con acqua sul fondo per evitare l'evaporazione dell'iniezione.

Mescolare e posizionare a quattro gradi Celsius. Lasciare che la miscela per iniezione viaggi lentamente verso la punta dell'ago per iniezione per almeno un'ora per ridurre al minimo la creazione di bolle. Per iniziare la raccolta degli ovociti e degli spermatozoi, maschi e femmine vengono sottoposti a shock in SW per 24 ore e poi trasferiti in coppette individuali una o due ore prima della deposizione delle uova.

Dopo la deposizione delle uova, raccogli immediatamente spermatozoi e citi. Fare attenzione a non spaventare gli adulti durante la raccolta. Un movimento aggiuntivo può dissipare e quindi diluire sia gli spermatozoi che i citi dopo la raccolta.

Conservare lo sperma in ghiaccio in una provetta da 1,5 millilitri e trasferire i citi in un SW filtrato in piastre di Petri pre-risciacquate. Trasferire da 100 a 500 citi in un'altra piastra di Petri da 35 millimetri per eseguire le iniezioni. Infine, fecondare il resto della frizione di citi come controllo per la qualità dello sperma e del cito o per altri esperimenti.

Per iniziare la procedura di iniezione, installare l'ago sul micromanipolatore con un angolo di 50 gradi rispetto al piano orizzontale sotto un cannocchiale da dissezione fluorescente con 25 ex oculari, trasferire 30 citi in un piatto rivestito di polilisina e filtrare un SW per aiutare a tenere traccia dei citi iniettati. Depositali lungo una linea in modo ordinato. Iniettare sempre piccoli numeri per ridurre al minimo l'esposizione.

È il momento della polilisina, che tende a deformare gli embrioni in via di sviluppo. Usa l'illuminazione del campo scuro per rendere i citi il più traslucidi possibile. Quindi, con la manopola del movimento grossolano, avvicinare l'ago da iniezione a un cyte con una pinza fine. Tagliare.

Aprire l'ago al livello in cui la punta inizia a curvarsi pulsando con l'iniettore. Verificare che la miscela rossa per iniezione fuoriesca dall'ago con un ingrandimento di 200x. E con la manopola di movimento fine, muovi delicatamente l'ago per iniezione all'interno del nucleo del citato.

Se inserita in due superficialmente, la soluzione iniettata non rimarrà all'interno del sito dell'UO. Se inserito troppo in profondità, il sito UO verrà distrutto. Iniettare con uno o tre impulsi.

Se l'ago è abbastanza sottile, iniettare con flusso continuo a pressione costante. Assicurarsi che il volume di iniezione corrisponda a un quinto-un terzo del volume di un singolo ovocita dopo l'iniezione. Estrarre rapidamente l'ago per evitare perdite.

Verificare che la soluzione iniettata rimanga all'interno del cita e che dopo alcuni secondi la soluzione iniettata si diffonda in tutto il citato. Passa al cyte successivo della riga. Conservare alcuni embrioni non iniettati di ogni serie come controlli negativi per stimare la fluorescenza di fondo durante la scansione degli embrioni iniettati fecondare gli ovociti non appena la serie è stata iniettata.

Poiché la qualità degli ovociti diminuisce con il tempo, iniettare e fecondare i citi entro un'ora. Dopo la deposizione delle uova. A seconda della concentrazione di spermatozoi, aggiungere da una a cinque gocce di spermatozoi all'UY e agitare il piatto.

L'involucro di fecondazione dovrebbe diventare evidente sugli embrioni. Dopo circa un minuto, lasciare che gli embrioni si stacchino dal piatto rivestito di polilisina mentre iniettano un'altra serie di ovociti. Una volta staccati, trasferire gli embrioni in una capsula di Petri rivestita di aros.

Rimuovere gli embrioni dal piatto rivestito di polilisina, se possibile. Prima dello stadio a due cellule. Nella fase da due a quattro cellule, selezionare gli embrioni iniettati con successo con l'aiuto di un endoscopio da dissezione fluorescente.

Con un filtro DSR, un'iniezione riuscita è indicata dalla normale morfologia che mostra un segnale fluorescente rosso derivato dal rosso fenolo. Conservare gli embrioni e filtrare un SW in piastre di Petri rivestite di agros a 19 gradi Celsius fino allo stadio desiderato per l'imaging in vivo, queste immagini rappresentative di embrioni di bronchos stoma lancia lato sono state scattate dopo la microiniezione di mRNA e il rivestimento di proteine fluorescenti. Questa prima immagine mostra che l'espressione di EGFP nucleare ottenuta mediante microiniezione di un costrutto H due B-E-G-F-P può essere rilevata negli embrioni già nello stadio di 16 cellule.

Questo embrione allo stadio gastro è un esempio di co-espressione ubiquitaria di ciliegia nucleare e EGFP mirata alla membrana. Il segnale nucleare deriva dalla microiniezione di un costrutto di ciliegia H due BM, mentre la fluorescenza sulle membrane cellulari è ottenuta mediante microiniezione di un costrutto di scatola CAAX EFG FP. Una sezione ottica di questo embrione allo stadio gastro mostra come i nuclei e i contorni cellulari siano evidenziati rispettivamente da mCherry a bersaglio nucleare e EGFP associato alla membrana.

La dimostrazione visiva di questa tecnica di microiniezione supporterà i ricercatori nello sviluppo evolutivo della comunità biologica per migliorare l'esistente e sviluppare nuovi approcci per l'imaging individuale, la manipolazione genica specifica e stabile in afi, un modello importante per la comprensione dell'evoluzione animale.