Name: Lespressione di proteine fluorescenti in Branchiostoma lanceolatum By mRNA iniezione in ovociti non fecondate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T12:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Scopri la microiniezione di mRNA in ovociti di Branchiostoma lanceolatum per l'imaging fluorescente in vivo. Questa tecnica consente l'espressione di proteine fluorescenti e facilita studi di biologia dello sviluppo.

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Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno da parte del &quot;Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette&quot; per la zootecnia. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi da ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 e ANR-11-JSV2-002-01) a Michael Schubert, dalla sovvenzione dell&#39;Unione Europea FP6 &quot;Embryomics&quot; e dalla concessione ANR &quot;ANR- 10-BLAN-121801 Dev-Process &quot;di Jean-François Nicolas e Nadine Peyrieras. João Emanuel Carvalho è finanziato da una borsa di studio di dottorato FCT (SFRH / BD / 86878/2012). Le richieste di vettori qui descritte possono essere indirizzate direttamente agli autori.

1. Preparazione di strumenti e reagenti <ol style="margin-left: 40px;"><li> Trasferimento pipette Pasteur <ol><li> Generare una serie di pipette Pasteur transfer con diversi diametri di punta tirando 230 millimetri lunghi pipette Pasteur sopra una fiamma a velocità diverse. Assicurarsi che il cono è più a lungo possibile per un controllo più fini di aspirazione. </li><li> Con un scrivano diamante, graffiare la pipetta lungo una linea perpendicolare alla lunghezza della pipetta. Con entrambe le mani estrarre la pipetta parallelamente alla sua lunghezza per generare un taglio smussato. Rapidamente fiamma lucidare la pipetta senza incollarsi la punta. </li><li> Variare il diametro della punta con la fase degli ovociti / embrioni essere pipettati: 300-400 micron per ovociti non fecondati (circa 150 micron di diametro), 600 micron per le uova fecondate (circa 500 micron di diametro), 200-400 micron per neurulae tratteggiata. Utilizzare pipette con un tubo di aspirazione bocca monitorati per trasferire ovociti / embrioni da un piattoall&#39;altro. </li></ol></li><li> Gli aghi da iniezione <ol><li> Manipolare i capillari con i guanti per garantire condizioni di assenza di RNasi. Utilizzare vetro borosilicato capillari filamento con dimensioni di 1,20 millimetri OD, ID 0,94 millimetri, lunghezza 10 mm. </li><li> Se capillari sono tirati al tipo di riscaldamento-filamento ago estrattore descritto nella lista dei materiali, utilizzare le seguenti impostazioni: Heat 600, Pull 50, Velocity 80, Tempo 60, pressione 200 o 300. In caso contrario, assicurarsi che la forma, che è cruciale per iniezioni successo, è come mostrato in figura 2 con le seguenti proprietà: 4-8 micron di diametro punta esterna 2 cm lunghezza del cono. NOTA: aghi può essere tirato prima che la stagione riproduttiva e usato per tutta la stagione. </li></ol></li><li> Soluzione di fenolo Rosso stock 5% (4x) <ol><li> Preparare fresco prima di ogni stagione riproduttiva. </li><li> In un tubo micron filtrazione 0.22, pesare 25 mg di fenolo polvere rossa. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di DNase- e RNase-free acquala provetta contenente la polvere. </li><li> Spin per 3-5 min a 18.000 xg a temperatura ambiente per filtrare sterilizzare la soluzione e rimuovere i cristalli che potrebbero ostruire l&#39;ago di iniezione. </li><li> Conservare a 4 ° C o memorizzare 250 microlitri aliquote a -20 ° C. </li></ol></li><li> 0,25 mg soluzione di poli-lisina / ml <ol><li> Preparare fresco prima di ogni stagione riproduttiva. </li><li> Disciogliere 5 mg di poli-L-lisina in 20 ml di acqua distillata. Conservare 5 ml aliquote a -20 ° C. </li><li> Utilizzare un&#39;aliquota scongelati immediatamente e solo una volta per assicurare l&#39;adesione riproducibili e robusto degli ovociti al piatto poli-lisina rivestite. </li></ol></li><li> sintesi di mRNA <ol><li> Preparare fresco prima di ogni stagione riproduttiva. </li><li> Linearizza 5 pg di DNA di interesse con l&#39;enzima adeguata (di solito per 2 ore, a 37 ° C). Per controllare la completezza della digestione, eseguire 2% in volume della miscela di digestione su un 1% agarosio-TBE gel in tampone TBE a 150 W per 20 min. </li><li> Estrarre la lineaDNA rized con 25: 24: 1 fenolo (pH 8.0): cloroformio: alcool isoamilico. Vortex per 20 sec, centrifugare 10 min a 18.000 xg e raccogliere la fase acquosa (superiore). </li><li> Estrarre la fase acquosa nuovo con 24: 1 di cloroformio: alcool isoamilico. Vortex per 20 sec, centrifugare 10 min a 18.000 xg e raccogliere la fase acquosa. </li><li> Precipitare il DNA linearizzato con 100: 10: 300 DNA linearizzato: 3 M acetato di sodio (pH 5.2): 100% di etanolo per una notte a -20 ° C. </li><li> Centrifugare 20 min a 18.000 xga 4 ° C. Sciacquare in 70% di etanolo. </li><li> Centrifugare 10 min a 18.000 xga 4 ° C. Lasciate asciugare e risospendere in acqua RNase-free ad una concentrazione finale di 0,5 mg / mL. </li><li> Trascrivere 1 mg di DNA linearizzato utilizzando un kit di sintesi di mRNA con la polimerasi del caso, secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Estrarre il mRNA con 5: 1 fenolo (pH 4,7): soluzione di arresto cloroformio e acetato di ammonio fornito con il kit. </li><li> Vortex per 20 secondi, centrifuge 10 min a 18.000 xg e raccogliere la fase acquosa. </li><li> Estrarre la fase acquosa nuovo con 24: 1 di cloroformio: alcool isoamilico. Vortex per 20 sec, centrifugare 10 min a 18.000 xg e raccogliere la fase acquosa. </li><li> Precipitare il mRNA con 100% di isopropanolo notte a -20 ° C. </li><li> Centrifugare 20 min a 18.000 xga 4 ° C. Risciacquare in 80% di etanolo. </li><li> Centrifugare 10 min a 18.000 xga 4 ° C. Lasciare pellet asciugare a temperatura ambiente per non più di 5-10 min come sarà poi difficile risospendere. Risospendere in DNase- e acqua RNase-free per una concentrazione finale di almeno 2 mg / mL per assicurare un dignitoso concentrazione mRNA finale nel mix di iniezione. </li><li> Per controllare la qualità e le dimensioni del prodotto di trascrizione, eseguire 0,5 ml di mRNA su un 1% agarosio-TBE gel senza RNasi in tampone TBE a 150 W per 20 min. Negozio 2 aliquote microlitri a -80 ° C. </li></ol></li><li> Piatti Poly-lisina rivestite NOTA: Poly-lisina coapiatti ted sono utilizzati per immobilizzare gli oociti durante l&#39;iniezione. <ol><li> Per ciascuna piastra di Petri coltura cellulare 35 mm (5 in totale), coprire il fondo del piatto Petri con 1 ml della / soluzione di poli-lisina ml 0,25 mg scongelati. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Per ogni piatto Petri coltura cellulare 35 mm (5 in totale), trasferire la soluzione 0,25 mg / ml di poli-lisina in un&#39;altra cella-cultura piastra di Petri da 35 mm. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Eliminare il / soluzione poli-lisina ml 0,25 mg. </li><li> Lasciare le piastre di Petri a secco, capovolto a temperatura ambiente per 2 ore. </li><li> Memorizzare i piatti poli-lisina rivestite avvolto in un involucro di plastica a 4 ° C per evitare la contaminazione per una settimana massimo. </li></ol></li><li> Piatti agarosio rivestite NOTA: Sono usati per cultura iniettato embrioni. L&#39;agarosio fornisce un ammortizzatore per gli embrioni iniettati e impedisce loro di attaccarsi al fondo del piatto. <ol><li> Fare acqua di mare artificiale (ASW) con 37-38 g / L commsali erciali + 0,25 NaHCO mm 3 in acqua ad osmosi inversa. </li><li> Sciogliere agarosio ad una concentrazione 1% in 0,22 micron ASW filtrata riscaldando la soluzione in un forno a microonde. </li><li> Rapidamente versare la soluzione di agarosio calda da una piastra da 35 mm Petri in un altro per assicurare un rivestimento molto sottile agarosio del piatto. </li><li> Conservare i piatti agarosio rivestite avvolto in Saran avvolgono a 4 ° C per evitare la contaminazione per una settimana massimo. </li></ol></li><li> Mix iniezione e caricamento degli aghi di iniezione <ol><li> Circa 2 ore prima di iniziare le iniezioni, fare un mix di iniezione 2 ml in RNase e acqua priva di DNase con concentrazioni finali di 1-1,8 mg / mL di mRNA, 15% glicerolo, 1,25% rosso fenolo. NOTA: I colori rosso fenolo della soluzione, che consente il monitoraggio dell&#39;efficienza di iniezione e l&#39;identificazione degli embrioni iniettati con successo. Glicerolo favorisce mRNA diffusione all&#39;interno dell&#39;ovocita. </li><li> Centrifugare 4 minuti a 18.000 xg percristalli pellet. Tenere in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Con una pipetta 10 microlitri, raccogliere 0,5 microlitri della miscela di iniezione, evitando il fondo del tubo, dove sono stati pellettato i cristalli. </li><li> Backfill almeno due aghi da iniezione (in caso si rompe durante l&#39;iniezione) pipettando il calo di 0,5 ml di miscela di iniezione alla grande apertura dell&#39;ago. </li><li> Installare gli aghi in un barattolo di archiviazione con liquido nella parte inferiore a 4 ° C per evitare l&#39;evaporazione della miscela di iniezione. Che il mix iniezione lentamente viaggiare alla punta dell&#39;ago di iniezione per almeno 1 ora per minimizzare la formazione di bolle. </li><li> Conservare mix iniezione aggiuntiva a -80 ° C per un massimo di tre altri usi, dopo di che la qualità mRNA deteriora (dati non mostrati). </li></ol></li></ol> 2. Raccolta di materiale biologico, microiniezione e Cultura Embrione <ol style="margin-left: 40px;"><li> Ovociti e spermatozoi collezione NOTA: Vedere Theodosiouet al. 12 per un protocollo dettagliato per indurre la deposizione delle uova e per la raccolta dei gameti. <ol><li> Shock maschi e femmine in ASW a 23 ° C per 24 ore. </li><li> Una o due ore prima del tramonto, trasferire il numero di adulti in singoli tazze in ASW a 19 ° C, perché la maggior parte degli adulti si riproducono 1-2 ore dopo il tramonto. </li><li> Risciacquare 35 millimetri piatti Petri in ASW filtrato e lasciarli asciugare capovolto per evitare gli ovociti di attaccarsi al fondo del piatto. </li><li> Dopo la deposizione delle uova, raccogliere immediatamente spermatozoi e ovociti con una pipetta 1000 ml. <ol><li> Tenere spermatozoi e ovociti separato da anfiosso adulti perché il contatto è dannoso per la salute dei gameti (dati non riportati). </li><li> Inoltre, evitare di sorprendente adulti, che porta a movimenti che dissipano, e quindi diluite, sia spermatozoi e ovociti. Per mantenere lo sperma attiva più a lungo possibile e ottimizzare tasso di fecondazione, raccogliere lo sperma come concentrato possibile. </li></ol></li><li> Manteneresperma su ghiaccio in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Trasferimento ovociti in filtrato ASW nelle 35 millimetri piatti pre-risciacquato Petri. </li><li> Trasferimento 100-500 ovociti con una già tirato 300-400 micron trasferimento pipetta Pasteur a un altro 35 millimetri piastra di Petri per eseguire le iniezioni. </li><li> Fertilizzare il resto della frizione come controllo per gli spermatozoi e qualità ovocita o per altri esperimenti. </li></ol></li><li> Iniezione di ovociti <ol><li> Installare l&#39;ago di iniezione sulla micromanipolatore a 50 ° rispetto al piano orizzontale. NOTA: Angoli di meno di 50 ° spingeranno gli ovociti in tutto sul piatto, mentre gli angoli superiori a 50 °, non potrà esercitare un controllo adeguato della posizione dell&#39;ago rispetto al ovocita. </li><li> Sotto un ambito dissezione fluorescente con 25X oculari, trasferire 30 ovociti con il 300-400 micron trasferimento pipetta Pasteur su un piatto poli-lisina rivestite contenenti filtrata ASW. </li><li> Depositare gli ovociti lungo una linea per trasportarefuori iniezioni in modo ordinato e per distinguere iniettati da ovociti non iniettato. Iniettare piccoli numeri (30 ovociti) per minimizzare il tempo di esposizione di ovociti a poli-lisina, che tende a deformare embrioni di sviluppo (dati non mostrati). </li><li> Utilizzare l&#39;illuminazione campo scuro per rendere gli ovociti quanto traslucido possibile. </li><li> Con la manopola movimento grossolano del micromanipolatore, portare l&#39;ago per l&#39;iniezione vicino a un ovocita. </li><li> Con una pinza sottile, tagliare aprire l&#39;ago al livello in cui la punta comincia ad essere curvato. Con pulsante con l&#39;iniettore, verificare che mix iniezione rosso è effettivamente defluisce dell&#39;ago. </li><li> A 200 ingrandimenti e con la manopola movimento fine del micromanipolatore, spostare delicatamente l&#39;ago di iniezione all&#39;interno del nucleo dell&#39;ovocita. NOTA: Se è inserito troppo superficialmente, la soluzione iniettata non rimarrà all&#39;interno dell&#39;ovocita. Se inserita troppo lontano, l&#39;ovocita sarà distrutto. </li><li> Iniettare con 1-3 impulsi di 120 msec DURATion e 1-10 pressione psi. Se l&#39;ago è abbastanza bene, iniettare con flusso continuo a pressione costante. Assicurarsi che il volume di iniezione corrisponde a 1/5 a 1/3 del volume di un singolo ovocita. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, estrarre l&#39;ago rapidamente per evitare perdite dell&#39;ovocita. </li><li> Verificare che la soluzione iniettata rimane all&#39;interno dell&#39;ovocita e che dopo un paio di secondi, la soluzione iniettata si diffonde in tutto l&#39;ovocita. </li><li> Passare al prossimo ovocita in linea. </li><li> Mantenere alcuni embrioni uninjected di ogni serie come controllo negativo per stimare la fluorescenza di fondo durante la scansione per gli embrioni iniettati. </li></ol></li><li> Fecondazione, selezione degli embrioni iniettati e della cultura degli embrioni <ol><li> Fertilizzare gli ovociti non appena una serie è stata iniettata. Come qualità ovocitaria diminuisce con il tempo, l&#39;iniezione e fecondare ovociti entro 1 ora dopo la deposizione delle uova 12. </li><li> A seconda della concentrazione degli spermatozoi, aggiungere 1-5 gocce di sperma di ovociti eagitare il piatto. NOTA: La busta concimazione dovrebbe risulteranno sulle embrioni dopo circa 1 min. </li><li> Lasciare gli embrioni di staccarsi dal piatto poli-lisina rivestite, mentre l&#39;iniezione di un&#39;altra serie di ovociti. </li><li> Trasferire gli embrioni con il micron trasferimento pipetta Pasteur 600 in una piastra di Petri agarosio rivestite. Rimuovere gli embrioni dal piatto poli-lisina rivestite appena possibile, se possibile prima della fase 2 cellule. NOTA: In caso di prolungata esposizione al poli-lisina, gli embrioni tendono a diventare blastulae densamente imballato, appiattita sul lato toccare il fondo del piatto. </li><li> Al 2-cell a 4 celle stage, selezionate con un ambito dissezione fluorescenza con filtro DSR embrioni successo-iniettati, vale a dire, quelli con una morfologia normale che presentano un segnale rosso fluorescente rosso fenolo-derivato. </li><li> Mantenere gli embrioni in cultura in filtrato ASW in piastre di Petri agarosio rivestite a 19 ° C fino allo stadio desiderato perimaging in vivo. </li></ol></li></ol>

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<li>Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+expression+of+FoxD+reporter+constructs+in+amphioxus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos.</a> Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).</li>
<li>Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis-regulation+of+the+amphioxus+engrailed+gene%3A+insights+into+evolution+of+a+muscle-specific+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer.</a> Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).</li>
<li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amphioxus+genome+illuminates+vertebrate+origins+and+cephalochordate+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology.</a> Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).</li>
<li>Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+the+vertebrate+Tol2+transposable+element+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster.</a> Gene. 425, 64-68 (2008).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+at+specific+genomic+loci+of+amphioxus+Branchiostoma+belcheri+using+TALEN+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method.</a> J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).</li>
<li>Zhang, Q. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+culture+of+two+lancelets+and+production+of+the+second+filial+generations+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool.+B%22%5BJournal%5D)">Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory.</a> J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).</li>
<li>Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+aquaculture+of+the+Japanese+lancelet+Branchiostoma+japonicum+for+7+years%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool.+B%22%5BJournal%5D)">Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years.</a> J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).</li>
<li>Benito-Gutiérrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+generating+year-round+access+to+amphioxus+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory.</a> PLoS One. 8, e71599(1371).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo articolo, presentiamo, per la prima volta, un protocollo dettagliato e riproducibile per l&#39;iniezione di B. ovociti lanceolatum, che, dopo il B. floridae 13,14 e B. belcheri 15, è quindi la terza specie anfiosso, per cui tale tecnica è stata descritta. È importante sottolineare che il protocollo qui descritto comprende inoltre la descrizione di sistemi vettore adatto per la produzione di proteine ​​fluorescenti in B. lanceolatum da mRNA inie...

Durante lo sviluppo, una singola cellula dà origine ad un intero organismo in un processo altamente complesso che coinvolge entrambi divisioni e movimenti delle cellule. Per comprendere meglio i principi biologici alla base delle dinamiche del comportamento delle cellule, i biologi dello sviluppo hanno iniziato ad utilizzare in tecniche di imaging in vivo basato sulla fluorescenza. Compartimenti specifici di cellule, come le membrane cellulari, possono sia essere etichettati da trattamenti con coloranti fluorescenti, un approccio ostacolato dalla mancanza di specificità e di penetrazione del tessuto 1, o dall&#39;introduzione specifica negli embrioni di mRNA esogeni codificanti proteine ​​fluorescenti 2. Diverse tecniche possono essere utilizzate per l&#39;erogazione efficace dei composti esogeni, quali mRNA. Questi includono, ma non sono limitati a, microiniezione, elettroporazione, bombardamenti con microparticelle, lipofezione e trasduzione 3,4. Sebbene tutti questi approcci possono essere utilizzati per introdurre composti esogeni in unsviluppo dell&#39;embrione, solo microiniezione consente l&#39;applicazione di quantità predefinite e precisi in ogni cella 3. Tecniche di microiniezione sono stati descritti per tutti i principali sistemi di modelli di sviluppo 4 (ad esempio, i moscerini della frutta, vermi nematodi, zebrafish, rane, topi), oltre che per alcuni modelli alternativi di 4, compresi quelli utilizzati per gli studi comparativi volti a comprendere l&#39;evoluzione dei meccanismi di sviluppo (ad esempio, anemoni di mare, vermi anellidi, ricci di mare, tunicati ascidie, l&#39;anfiosso Cephalochordata). Cephalochordates, che insieme con i tunicati e vertebrati stabiliscono il phylum cordati, particolarmente modelli adatto per studiare l&#39;evoluzione dei Cordati e la diversificazione dei vertebrati da un antenato invertebrato 5-8. Il lignaggio Cephalochordata discostato molto presto durante l&#39;evoluzione dei cordati; e cephalochordates esistenti, che si suddividono in tre generi (Branchiostoma, Asymmetron e Epigonichthys), assomigliano vertebrati sia in termini di anatomia generale e l&#39;architettura del genoma 5-8. Delle circa 30 specie di cephalochordates che sono stati descritti finora, cinque sono disponibili per gli studi embriologici e sviluppo 6,9: Asymmetron lucayanum (il lancelet Bahama), Branchiostoma floridae (l&#39;anfiosso Florida), Branchiostoma lanceolatum (l&#39;anfiosso europeo), Branchiostoma belcheri (l&#39;anfiosso cinese) e Branchiostoma japonicum (l&#39;anfiosso giapponese). Adulti maturi di tre di queste specie (B. lanceolatum, B. belcheri e B. japonicum) possono essere indotti a deporre le uova su richiesta durante la stagione riproduttiva 10,11. Inoltre, almeno per B. lanceolatum, la deposizione delle uova efficiente può anche essere indotta in acqua di mare artificiale 12, rendendo in tal modo questa particolare specie Cephalochordata accessibile per laboratorIES che non hanno accesso ad acqua di mare naturale. La combinazione, in B. lanceolatum, di un accesso comodo e affidabile per gli embrioni con un metodo di consegna efficiente, come ad esempio la microiniezione, finora l&#39;unica tecnica di consegna sviluppata in anfiosso (sia in B. floridae e B. belcheri) 13-15, consentirà lo sviluppo di un romanzo suite di tecniche manipolative, tra cui lignaggio tracing- e approcci basati sul comportamento di cellule dinamica. Un protocollo per la microiniezione di mRNA efficace per esprimere le proteine ​​fluorescenti in B. lanceolatum embrione è stato sviluppato di conseguenza. Inoltre, per fornire un kit di strumenti di base per l&#39;imaging dal vivo di B. embrioni lanceolatum, sistemi di vettori sono stati sviluppati che permettono associata alla membrana ed espressione nucleare di proteine ​​fluorescenti. Per membrane targeting, maggiore proteina fluorescente verde (eGFP) è stato fuso con la casella CAAX umana HRAS e localizzazione nucleare di mCherry e eGFP eraottenute per fusione alla esone zebrafish istone 2B (H2B) (Figura 1, File supplementare 1). Inoltre, con lo scopo di ottimizzare la traduzione della proteina, le sequenze Kozak e codoni dei costrutti sono stati modificati e adattati all&#39;uso in B. lanceolatum. Nel loro insieme, il metodo di iniezione e di espressione vettori qui presentati serviranno da base per la generazione di nuovi approcci sperimentali per cephalochordates, in particolare analisi utilizzando la più recente a fluorescenza a base di tecniche di imaging in vivo.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Consumabili</td></tr><tr><td>35 mm Piastre di Petri</td><td>Falcon</td><td>353001</td> Unità di filtrazione <td>trattata con coltura</td></tr><tr><td>(Stericup 1 L)</td><td>Fisher</td><td>W21719</td><td>0.22 &#956; m</td></tr><tr><td>Tubi Spin-X</td><td>Costar</td><td>8160</td><td>0.22 &#956; m</td></tr><tr><td>Barattolo per aghi per capillari da 1,2 mm di diametro</td><td>WPI</td><td>E212</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td></td><td></td> Pasteur <td>lunghe 230 mm</td></tr><tr><td>Tubo di aspirazione</td><td>Dutscher</td><td>75056</td><td></td></tr><tr><td>Capillari per aghi da iniezione</td><td>Sutter</td><td>BF 120-94-10</td><td>Vetro borosilicato con filamento, OD 1,20 mm, ID 0,94 mm, lunghezza 10 mm</td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Agarosio a basso punto di fusione</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Rosso fenolo</td><td>Sigma</td><td>114537</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>Bromidrato di poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>H2O, senza DNasi/RNasi</td><td>Gibco</td><td>10977-035</td><td></td></tr><tr><td>mMessaggio mMachine SP6 Kit</td> <td>di trascrizioneKit</td><td>di sintesi mRNA</td>Ambion <td>AM1340</td></tr><tr><td>Fenolo pH 8</td><td>Sigma</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>24:1 cloroformio:alcool isoamilico</td><td>Sigma</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>5:1 fenolo pH 4,7:cloroformio</td><td>Sigma</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>Reef Sali cristallini (200 kg)</td><td>Europrix&nbsp;</td><td></td><td>Sali commerciali</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Telescopio da dissezione fluorescente con ingrandimento 200X Leica</td><td></td><td>MZ16F</td><td>25X oculari, filtri DSR e GFP2</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Marzhauzer</td><td>M-33</td><td></td></tr><tr><td>Iniettore</td><td>Picospritzer</td><td>modello II o III</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per aghi</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>Estrattore per aghi per filamenti riscaldanti</td></tr><tr><td>Pinze fini</td><td>Fine Science Tools GmbH</td><td>11252-30</td><td>Dumont #5</td></tr></tbody></table>

l'espressione di proteine ​​fluorescenti in branchiostoma lanceolatum by mrna iniezione in ovociti non fecondate

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Riportiamo qui un protocollo robusto ed efficiente per l'espressione di proteine fluorescenti dopo iniezione di mRNA in ovociti non fecondati dell'anfiosso cefalocordatato, Branchiostoma lanceolatum. Utilizziamo costrutti per mCherry ed eGFP a membrana e a bersaglio nucleare che sono stati modificati per adattarsi all'uso del codone dell'anfiosso e alle sequenze di consenso di Kozak. Descriviamo il tipo di aghi per iniezione da utilizzare, il protocollo di immobilizzazione per gli ovociti non fecondati e la configurazione generale dell'iniezione. Questa tecnica genera embrioni marcati in fluorescenza, in cui le dinamiche dei comportamenti cellulari durante lo sviluppo iniziale possono essere analizzate utilizzando le più recenti strategie di imaging in vivo. Lo sviluppo di una tecnica di microiniezione in questa specie di anfiosso consentirà analisi di imaging dal vivo dei comportamenti cellulari nell'embrione e manipolazioni specifiche del gene, tra cui la sovraespressione genica e il knockdown. Nel complesso, questo protocollo consoliderà ulteriormente l'anfiosso dei cordati basali come modello animale per affrontare questioni relative ai meccanismi dello sviluppo embrionale e, soprattutto, alla loro evoluzione.

Il protocollo descritto sopra fornisce la base per la microiniezione di B. ovociti lanceolatum e quindi per l'introduzione nella sviluppare B. embrioni lanceolatum di mRNA che codificano proteine ​​fluorescenti per l'imaging in vivo. Sebbene la tecnica è certamente robusto ed affidabile, il tasso di successo di iniezioni utilizzando questo protocollo rimane variabile (Tabella 1). La spiegazione molto probabile per questo fatto interessante è l'estrema variabi...

Riportiamo qui l&#39;espressione robusto ed efficiente di proteine ​​fluorescenti dopo l&#39;iniezione di mRNA in oociti fecondati di Branchiostoma lanceolatum. Lo sviluppo della tecnica microiniezione in questo chordate basale aprirà la strada di una profonda innovazioni tecniche in questo sistema modello emergente, tra cui imaging in vivo e manipolazioni gene-specifici.

L'espressione di proteine ​​fluorescenti in Branchiostoma lanceolatum By mRNA iniezione in ovociti non fecondate

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di introdurre l'mRNA, codificante una proteina fluorescente negli ovociti di bronchos stoma lancia latam per consentire l'imaging fluorescente in vivo degli embrioni in via di sviluppo. Ciò si ottiene inducendo prima la deposizione delle uova di amfi ais, maschi e femmine maturi mediante uno shock termico di 24 ore. Dopo lo shock termico, le femmine e i maschi vengono posti in vasche di deposizione delle uova individuali, consentendo la raccolta rispettivamente di ovociti e spermatozoi.Una volta che i citi sono allineati in un piatto rivestito di polilisina, viene utilizzato un ago per microiniezione appositamente preparato per iniettare la soluzione all'interno del nucleo del citato. La fase finale è la fecondazione del cita con una o cinque gocce di sperma. In definitiva, scansione laser a due fotoni.La microscopia viene utilizzata per mostrare l'espressione ubiquitaria delle proteine fluorescenti prodotte dal micro mRNA iniettato. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi della microiniezione sono difficili da apprendere a causa delle competenze tecniche richieste che sono impossibili da dettagliar

expression-fluorescent-proteins-branchiostoma-lanceolatum-mrna

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Microiniezione è un metodo consolidato ed efficace per l'introduzione di sostanze estranee in embrioni di zebrafish fecondato. Qui, dimostriamo una tecnica robusta microiniezione per l'esecuzione di sovraespressione di mRNA, e morfolino oligonucleotide studi gene knockdown in zebrafish.

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

Cellule morenti vengono estrusi da tessuti epiteliali dalla contrazione concertata delle cellule vicine senza interrompere la funzione di barriera. L'ottica degli zebrafish di sviluppo, prevede un ottimo sistema per visualizzare estrusione nel vivere epiteli. Qui si descrivono i metodi per indurre ed estrusione immagine nell'epidermide zebrafish larvale a risoluzione cellulare.

Immagini dal vivo di estrusione in cella dal Epidermide di Zebrafish in via di sviluppo

Xenopus ectoderma embrionale è diventato un modello attraente per gli studi di polarità cellulare. Un saggio è descritta, in cui la distribuzione subcellulare delle proteine ​​fluorescenti è valutata in cellule ectoderma. Questo protocollo aiuterà a trattare questioni relative al controllo spaziale della segnalazione.

Traslocazione polarizzato di proteine ​​fluorescenti in Xenopus</emEctoderma> in risposta alla segnalazione Wnt

Un metodo è descritto photoactivate singole cellule contenenti una proteina fluorescente in gabbia con assorbimento a due fotoni da un Ti: zaffiro oscillatore laser a femtosecondi. Per mappare il destino della cellula fotoattivati, immunoistochimica è usato. Questa tecnica può essere applicata a qualsiasi tipo di cellula.

Singolo Destino Mapping di celle in Zebrafish

Espressione ectopica è una tecnica per chiarire il ruolo microRNA nello sviluppo del cervello. Tuttavia, il targeting aree specifiche utilizzando in elettroporazione ovo è impegnativo. Qui vi mostriamo un modo efficiente alle regioni mesencefalo ventrale e dorsale in modo selettivo l'elettroporazione.

In Expression Ovo di MicroRNA in Ventrale Chick Mesencefalo

I livelli di proteine ​​nelle cellule e tessuti sono spesso strettamente regolati dal saldo della produzione di proteine ​​e di liquidazione. Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP), la cinetica di clearance di proteine ​​possono essere sperimentalmente misurati in vivo.

Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)

Vi presentiamo transgenesi transitori e silenziamento genico in Ciona intestinalis, un gruppo sorella chordate di vertebrati, utilizzando tecniche di microiniezione e elettroporazione. Tali metodi facilitano genomica funzionale in questo semplice invertebrato che dispone di caratteristiche rudimentali di vertebrati, tra cui notocorda e epiteli sensoriali della testa, e molti ortologhi di malattie associate geni umani.

Embrione microiniezione e elettroporazione in chordate<em&gt; Intestinalis Ciona</em

Un protocollo ottimizzato per la maturazione in vitro di oociti zebrafish utilizzati per la manipolazione di prodotti genici materni è presentato qui.

Manipolazione funzionale delle materne genica Utilizzando<em&gt; In Vitro</em&gt; La maturazione degli ovociti in Zebrafish

Imaging della morfogenesi di embrioni insetto con luce microscopio a fluorescenza foglio basata è diventato stato dell'arte. Questo protocollo descrive e confronta tre tecniche di montaggio appropriate per gli embrioni Tribolium castaneum, presenta due linee transgeniche misura romanzo ben adatto per l'imaging in tempo reale, discute controlli di qualità essenziali e indichi limitazioni dell'esperimento corrente.

Luce Scheda a base di microscopia a fluorescenza di vita o fissate e colorate<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; embrioni

Riportiamo l'elettroporazione messaggera RNA (mRNA) come un metodo che permette l'espressione rapida ed efficiente di più proteine nel sistema del modello embrionale di quaglia. Questo metodo può essere utilizzato per etichettare le cellule fluorescenti e registrare i loro movimenti in vivo mediante microscopia time-lapse poco dopo l'elettroporazione.

Espressione rapida ed efficiente di più proteine negli embrioni aviari utilizzando l'elettroporazione dell'mRNA

Qui, presentiamo un protocollo per marcare le proteine con un tag proteico di fluorescenza nelle larve di zebrafish, un sistema in vivo recentemente sviluppato e modificato particolarmente utile per visualizzare le proteine a bassa abbondanza nel zebrafish.

Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

Scopri la microiniezione di mRNA in ovociti di Branchiostoma lanceolatum per l'imaging fluorescente in vivo. Questa tecnica consente l'espressione di proteine fluorescenti e facilita studi di biologia dello sviluppo.

L'espressione di proteine fluorescenti in Branchiostoma lanceolatum By mRNA iniezione in ovociti non fecondate

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