Name: Derivazione di cellule cardiache progenitrici di cellule staminali embrionali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Impara a derivare cellule progenitrici cardiache da cellule staminali embrionali di topo e umane. Questo protocollo utilizza citometria a flusso per l'arricchimento e fattori di crescita per la differenziazione.

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Ringraziamo il Dr. Leonid Gnatovskiy per la sua lettura attenta e critica dell'articolo. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni del National Institutes of Health (HL109054) e del Samuel and Jean Frankel Cardiovascular Center, University of Michigan (Inaugural Fund) a WZ e dalla Leon H Charney Division of Cardiology, New York University School of Medicine a BL.

1. Derivazione embrionali di topo CPC da mouse CES <ol><li> Preparare il mouse fibroblasti embrionali (MEF) feeder layer. <ol><li> Medio MEF caldo (10% FBS in DMEM) a 37 ° C. </li><li> Preparare piatti gelatina rivestito. <ol><li> Aggiungere 1 ml di 0,1% di gelatina in acqua in un pozzetto della piastra da 6 pozzetti o 5 ml in un piatto 10 cm. </li><li> Lasciare piatti o piatti a 37 ° C oa temperatura ambiente per almeno 30 min. Aspirare la gelatina prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Scongelare irradiato MEF rapidamente in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C, agitando delicatamente. </li><li> Trasferire le cellule delicatamente per un tubo da 15 ml o 50 ml. Aggiungere 5 ml di terreno MEF pre-riscaldato. Agitare le cellule lentamente e centrifugare a 200 xg per 5 min. </li><li> Risospendere le cellule in terreno MEF e contare le cellule vitali. Utilizzare i seguenti volumi di MEF medio: 2 ml per cellule per bene da un 6-pozzetti e 10 ml per le cellule da un piatto di 10 cm. </li><li> Cellule piastra in 6 pozzetti o 10 piatti cm a 1-2x 10 6 per piatto / piatto. </li><li> Incubare le piastre MEF / stoviglie a 37 ° C, 5% CO 2 almeno 24 ore prima dell&#39;uso. NOTA: Eliminare MEF piatti / stoviglie più vecchi di una settimana. </li></ol></li><li> Preparare CES del mouse <ol><li> Culture del Isl1-cre; Rosa26YFP / MEF2C-cre; Rosa26YFP del mouse CES sul MEF fino al 90% confluenti. Media cell Uso ES comprende 410 ml DMEM, 75 ml FBS, 0,1 mm MEM NEAA, 2 mM L-glutammina, 0.1 mM piruvato, 100 U Pen / Strep, e 0,1 mm β-mercaptoetanolo. </li><li> Preparare 6 pozzetti gelatina rivestito come descritto al punto 1.1.2. </li><li> Aspirare media da piatti e lavare le cellule con DPBS. <ol><li> Aspirare DPBS e aggiungere 0,4 ml 0,25% tripsina in un pozzetto di 6-pozzetti. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 per 5 min. Aggiungere 1 ml di pre-riscaldato medie ES cessare reazione tripsina. </li></ol></li><li> Celle di raccolta e le cellule centrifugare a 200 xg e aspirare media. Risospendere le cellule in 1 ml di mezzo ES cellulare e contare le cellule. &lt;/ Li&gt; <li> CES piastra su piastre di gelatina rivestite a densità di 3 x 10 4 / cm 2. Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2 per circa 2 giorni in cui i CES raggiungono circa il 90% confluenti. Cambiare la media di tutti i giorni. </li><li> Quando CES sono 90% confluenti, ripetere i punti 1.2.2-1.2.5 per rimuovere completamente gli alimentatori MEF. </li></ol></li><li> Indurre CPC differenziazione dalla formazione EB <ol><li> Preparare medio differenziazione seguito: 36 ml IMDM, 12 ml F12 di Ham, 2 mM L-glutammina, 0,34 ml BSA (7,5%), 0,25 ml N2, 0,5 ml B27, 50 mg / ml AA, e 0,45 mm 1-thioglycerol. </li><li> Medio Aspirare dalle cellule e risciacquare con DPBS. Aspirare DPBS e aggiungere 0,4 ml 0,25% tripsina in un pozzetto di 6-pozzetti. Incubare a 37 ° C per 5 min. </li><li> Aggiungere 1 ml di mezzo di differenziazione di cessare la reazione e la pipetta su e giù per disperdere gruppi di cellule in cellule singole. </li><li> Centrifugare CES a 200 xg per 5 minuti e scartare il medium. <ol><li> Risospendere 1 x 10 6 &lt;/ Sup&gt; CES in 1 ml di mezzo di differenziazione. Contare le cellule, e coltura le cellule a partire distacco piatto Petri a una concentrazione di 1 x 10 5 cellule / ml in terreno di differenziamento a 37 ° C per prima aggregazione EB. </li></ol></li><li> Due giorni dopo la formazione EB, trasferire EBs dai piatti a 50 ml provette. Spin a 200 g per 1 min. Rimuovere medie e risciacquare EBs con 10 ml DPBS senza Ca 2+ e Mg 2+. </li><li> Aspirare DPBS e aggiungere 1 ml 0,25% tripsina. Incubare a 37 ° C per 5 min. Aggiungere 4,5 ml di mezzo di differenziazione per arrestare la reazione. Pipettare su e giù per dissociarsi EB in cellule singole. </li><li> Centrifugare le cellule a 200 xg per 5 min. Aspirare media e risospendere le cellule in 1 ml di mezzo di differenziazione. </li><li> Contare le cellule, e diluire 2 x 10 6 cellule per 1 x 10 5 cellule / ml in terreno di differenziamento. Aggiungere VEGF Bmp4 e Activin A al mezzo a una concentrazione finale di 5 ng / ml, 0,8 ng / ml, e 5 ng / ml, rispettivamente. Culture le cellule in capsula di Petri per la seconda formazione EB a 37 ° C. </li><li> 40 ore dopo la seconda formazione EB, trasferimento EBs a 50 ml provette. Risciacquare con DPBS una volta, dissociare EBs con 1 ml 0,25% tripsina a 37 ° C per 5 minuti. Pipettare su e giù per dissociarsi EB in cellule singole. </li><li> Risospendere le cellule in Stempro-34 media con 5 ng / ml VEGF, 10 ng / ml bFGF e 12,5 ng FGF10 / ml. Piastra le cellule a 2 x 10 5 / cm 2 in piastre rivestite di gelatina. Cultura in 37 ° C incubatore per circa 32 ore prima di isolamento CPC. </li></ol></li><li> Isolare mCPCs <ol><li> Aspirare il terreno e risciacquare con DPBS. Aggiungere 0,5 ml di 0,25% tripsina a piastre di coltura a 37 ° C per 5 min. Aggiungere 4,5 ml di mezzo di differenziazione per arrestare la reazione. Pipettare su e giù per dissociarsi EB in cellule singole. Raccogliere le cellule cellule centrifuga e risospendere in 2% FBS / PBS per FACS-purificazione. </li><li> Eseguire CES indifferenziate sul sorter come controllo negativo. Modifica tensione per regolare scat avantiter (FSC) e side scatter (SSC) per selezionare la popolazione desiderata. Utilizzare avanti spargere contro scatter lato e altezza scatter in avanti rispetto a larghezza di escludere detriti e farsetto. Nel sub-popolazione selezionata, in base alla distribuzione dei controlli ESC, elaborare un cancello di YFP positivo sulla istogramma per eliminare autofluorescenza cellule. Raccogliere YFP + CPC da YFP + gating. </li><li> Piastra i CPC purificati (cellule YFP +) a 6 pozzetti con terreno di differenziamento (1.3.1). Cultura ulteriori 3-5 giorni a 37 ° C per la differenziazione del CPC in cardiomiociti e SMC. </li></ol></li></ol> 2. Determinazione dei embrionale umano CPC dal CES umani <ol><li> Preparare Alimentatori <ol><li> Preparare topo fibroblasti embrionali (MEF) strato alimentatore come descritto sopra ad una densità di 2 x 10 4 / cm 2. </li></ol></li><li> Mantenere CES umani <ol><li> Mantenere Isl1 umana: cre; pCAG-flox-STOP-flox-GFP o RFP CES di routine su MEF utilizzando media hESC regolare (Knockout DMEM / F-12 385 ml, Knockout SR 100 ml, 2 mM L-glutammina, 0.1 NEAA mM, 0,1 mm β-mercaptoetanolo, 10 ng / ml FGF base). Prima di differenziazione cardiaca, trasferire CES umani in alimentatore condizione libera per almeno 2 passaggi. </li></ol></li><li> Preparare CES umani in condizioni di alimentazione gratuito <ol><li> Preparare piastre rivestite per la cultura CES umani. <ol><li> Scongelare matrigel a 4 ° C durante la notte. Mettere un tubo da 50 ml su ghiaccio e aggiungere 30 ml fredda terreno DMEM / F12 nel tubo. </li><li> Aggiungere 1 ml matrigel nel mezzo freddo e mescolare bene. Aggiungere 1 ml di freddo Matrigel-DMEM / 12 di media in un pozzo di 6-pozzetti o 5 ml in un piatto di 10 cm. </li><li> Lascia piatti / stoviglie a 4 ° C durante la notte o temperatura ambiente per 2 ore. Aspirare il terreno prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Split CES umane sulle piastre: Aspirare il terreno dalla piastra MEF e sciacquare CES umani con DPBS. Poi aggiungere 1 ml dispasi (1 mg / ml) in un pozzetto di piastra da 6 pozzetti. Incubare le cellule in 37 ° Cincubatrice fino bordi delle colonie cominciano a staccarsi. </li><li> Rimuovere la soluzione dispasi. Risciacquare con DPBS due volte, quindi aggiungere 2,5 ml / per medie dimensioni, ben mTeSR o medio MEF condizionata alla piastra. </li><li> Raschiare le cellule con un raschietto cellulare e con attenzione pipettare su e giù per rompere le colonie CES umani in piccoli grumi. </li><li> Trasferire i ciuffi ESC e diluire 1: 3 nelle piastre rivestite. </li><li> Aggiungere 2 ml / e medio mTeSR o medio MEF condizionata e cambiare media giornaliera. </li><li> Cultura CES umani in mTeSR medio o medio MEF condizionata su piastre rivestite per almeno 2 passaggi. </li></ol></li><li> Indurre CPC differenziazione dalla CES umani <ol><li> Quando le cellule sono ~ 90% confluenti, aspirare il terreno e risciacquare con DPBS. Poi incubare le hESC a 0,5 mg / ml dispasi a 37 ° C per 20 min. </li><li> Sciacquare le hESC con DPBS due volte, rimuovere le cellule dai piatti con sollevatore cellulare, quindi risospendere morsetti cellulari in terreno di differenziamento (DMEM / F12 contenente 18% FBS, 0.1 NEAA mm, 2 mmL-glutammina, 0,1 mM β-mercaptoetanolo e 50 ug / ml acido ascorbico). </li><li> Trasferire le cellule in piastre di fissaggio ultra-bassi 6 pozzetti per la formazione EB. </li><li> Cambiare medio differenziazione giorno successivo. </li><li> Sostituire media ogni 3 giorni e mantenere EBs in coltura in sospensione. </li></ol></li><li> Isolare HCPCS <ol><li> Raccogliere EBs entro e non oltre il giorno 9 di differenziazione per l&#39;isolamento CPC umana. </li><li> Aspirare il terreno e lavare EBs con DPBS due volte. Aggiungere 0,5 ml di 0,25% tripsina in ciascun pozzetto di piastre di coltura 6 pozzetti a 37 ° C per 5 min. </li><li> Aggiungere uguale volume di terreno di differenziamento per arrestare la reazione. Pipettare su e giù per dissociarsi EB in cellule singole. Raccogliere le cellule centrifugare a 200 xg per 5 minuti e risospendere le cellule in 2% FBS / DPBS. Celle filtranti con 40 micron filtro cellulare e FACS purificato la RFP + cellule CPC come descritto in 1.4.3. </li><li> Piatto allineati HCPCS su piastre geltin rivestite. HCPCS culturali in media di differenziazione per 7Giorni -9 a differenziarsi in cellule muscolari lisce e cardiomiociti. 7 giorni dopo la placcatura, cultura cellule con 5% Knockout SR in terreno DMEM / F12 differenziato. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li>
<li>Passier, R., van Laake, L. W., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based+therapy+and+lessons+from+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based therapy and lessons from the heart.</a> Nature. 453 (7193), 322-329 (2008).</li>
<li>Bondue, A., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesp1%3A+a+key+regulator+of+cardiovascular+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Mesp1: a key regulator of cardiovascular lineage commitment.</a> Circulation Research. 107 (12), 1414-1427 (2010).</li>
<li>Bondue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesp1+acts+as+a+master+regulator+of+multipotent+cardiovascular+progenitor+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesp1 acts as a master regulator of multipotent cardiovascular progenitor specification.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 69-84 (2008).</li>
<li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ISL1+heart+progenitors+generate+diverse+multipotent+cardiovascular+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages.</a> Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).</li>
<li>Lei, I., Gao, X., Sham, M. H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+protein+component+BAF250a+regulates+cardiac+progenitor+cell+differentiation+by+modulating+chromatin+accessibility+during+second+heart+field+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF protein component BAF250a regulates cardiac progenitor cell differentiation by modulating chromatin accessibility during second heart field development.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (29), 24255-24262 (2012).</li>
<li>Lei, I., Liu, L., Sham, M. H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+in+cardiac+progenitor+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF in cardiac progenitor cell differentiation.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 114 (11), 2437-2445 (2013).</li>
<li>Wu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origin+of+a+bipotential+myocardial+and+smooth+muscle+cell+precursor+in+the+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart.</a> Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).</li>
<li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+HCN4%2B+cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li>
<li>Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+right+ventricle%2C+outflow+tract%2C+and+ventricular+septum+comprise+a+restricted+expression+domain+within+the+secondary%2Fanterior+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field.</a> Developmental Biology. 287 (1), 134-145 (2005).</li>
<li>Boheler, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+into+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).</li>
<li>Wada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+cardiomyocyte-like+cells+from+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12667-12672 (2013).</li>
<li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+optimization+of+activin%2Fnodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+enhances+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes.</a> Circulation. 107 (14), 1912-1916 (2003).</li>
<li>Wamstad, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+coordinated+epigenetic+regulation+of+developmental+transitions+in+the+cardiac+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage.</a> Cell. 151 (1), 206-220 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li>
<li>Gaj, T., Gersbach, C. S. 3rd, Barbas, T. A. L. E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li>
<li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALENs%3A+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature. biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PloS One. 6 (4), e18293(2011).</li>
<li>Kouskoff, V., Lacaud, G., Schwantz, S., Fehling, H. J., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+development+of+hematopoietic+and+cardiac+mesoderm+during+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sequential development of hematopoietic and cardiac mesoderm during embryonic stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13170-13175 (2005).</li>
<li>Xu, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+medium+supporting+cardiomyocyte+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3A+Research+in+Biological+Diversity%22%5BJournal%5D)">Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells.</a> Differentiation: Research in Biological Diversity. 76 (9), 958-970 (2008).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-1857 (2012).</li>
<li>Bizy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+light+chain+2-based+selection+of+human+iPSC-derived+early+ventricular+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Myosin light chain 2-based selection of human iPSC-derived early ventricular cardiac myocytes.</a> Stem Cell Research. 11 (3), 1335-1347 (2013).</li>
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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo protocollo combina un metodo che utilizza fattori di crescita per guidare la differenziazione delle mESC e la differenziazione spontanea delle ESC umane in CPC. Il lignaggio delle CPC marcato con reporter fluorescente viene utilizzato per identificare e isolare in modo efficiente le CPC mediante FACS. Le CPC purificate con FACS mantengono la capacità di differenziarsi in cardiomiociti, muscolatura liscia e cellule endoteliali e hanno un profilo di espressione paragonabile alle cellule in vivo. Pertanto, questi CPC...

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The following author is now listed as a co-corresponding author:
Lei Bu

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Erratum: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Le malattie cardiache rimane la causa nel mondo leader di oggi e il tasso di mortalità sono rimasti pressoché invariati negli ultimi due decenni (American Heart Association). Vi è una necessità critica per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per prevenire o invertire l&#39;insufficienza cardiaca in modo efficace. Una strategia promettente è terapia cellulare a seguito del rapido sviluppo della biologia delle cellule staminali 1. A questo proposito, CPC multipotenti potrebbero essere una fonte eccellente cellule per la terapia a causa della loro capacità di proliferare ma impegnata solo differenziazione lineage cardiaca. Pertanto, il metodo efficiente e robusto per generare ed isolare CPC è di grande importanza per gli studi di terapia cellulare cardiaca. Questo protocollo si concentra su CPC embrionali individuati durante l&#39;embriogenesi precoce e di come la loro generazione dal CES. Vari CPC sono stati isolati dai cuori embrionali e adulte, anche da midollo osseo 2. Durante lo sviluppo embrionale, morphoge ossoproteine ​​tiche (BMP), senza ali di tipo familiari sito di integrazione MMTV (Wnts) e segnali nodali inducono l&#39;impegno della Mesp1 + mesoderma multipotenti 3. + Cellule Mesp1 poi differenziano nelle CPC embrionali 4. Questi CPC sono tipicamente caratterizzati da HCN4, NK2 homeobox 5 (NKX2-5), Isl LIM homeobox 1 (Isl1), T-box 5 (Tbx5), e dei miociti fattore enhancer 2C (MEF2C), formano campi cuore primarie e seconde, e contribuire alle principali parti del cuore durante cardiogenesis 5-10. CPC Sia NKX2-5 + e Isl1 + / MEF2C + sono in grado di differenziarsi in cardiomiociti, cellule muscolari lisce (SMC), e le cellule endoteliali 5-8. Così questi CPC daranno luogo a vascolare cardiaca così come i tessuti cardiaci e sono una fonte di cellule ideale per la terapia cardiaca cell-based. Di conseguenza, generando CPC in vitro è stato un obiettivo importante di ricerca in studi cardiovascolari. Dal CES hanno la capacità di espansione illimitata and rappresentano le cellule ICM allo stadio di blastocisti, la differenziazione dei CES in CPC embrionali seguito della embriogenesi naturale è considerato un approccio logico ed efficace per ottenere CPC. Un approccio ampiamente applicata per ottenere CPC dal CES è quello di aggregare CES in EBs 11. Per migliorare l&#39;efficienza differenziazione, fattori chimici e crescita definiti sulla base della conoscenza di sviluppo cardiaco sono stati utilizzati 12-14. Tuttavia, non ci sono marcatori CPC definitive, in particolare marcatori della superficie cellulare, che sono ampiamente accettate nel settore. Per risolvere questo problema, i CES sono progettati per contrassegnare Isl1 + o MEF2C CPC + e loro derivati, con i giornalisti fluorescenti che utilizzano il sistema / loxP Cre. Il ricombinasi cre è buttato in sotto il controllo di Isl1 / MEF2C promoter / enhancer. Modificata la proteina fluorescente o RFP gene YFP guidata da un promotore costitutivo possono essere attivate da escissione di arresto flox codone con cre ricombinasi(Isl1: cre; pCAG-flox-STOP-flox-GFP o RFP / Isl1-cre; Rosa26YFP / MEF2C-cre; Rosa26YFP) 5,6. Una volta che i CES sono differenziati in CPC secondo campo cuore, Isl1 / MEF2C promoter / enhancer cre guidato attiverà i reporter fluorescenti e CPC può essere arricchita da FACS-purificazione. In breve, il metodo di aggregazione EB viene utilizzato per avviare ESC differenziazione. Per migliorare l&#39;efficienza differenziazione, le cellule differenziate sono trattati con acido ascorbico (AA) e fattori di crescita come Bmp4, Activin A e VEGF 13,15. Questo protocollo permette robusto ed efficiente differenziamento CPC utilizzando sia il mouse e CES umani.

<table><tbody><tr><td>FBS</td><td>Thermo scentific</td><td>SH30070.03E</td><td></td></tr><tr><td>Knockout SR</td><td>Life tecnologia</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life 10829018</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life 11965118</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life 11140050</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life 35050061</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnologia N2</td><td>Life</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr>Tecnologia<td>B27</td><td>Life</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Ham' s Tecnologia F12</td><td>Life</td><td>11765062</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologia IMDM</td><td>Life</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Tecnologia</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato</td><td>Life 11360070</td><td></td><td></td></tr><tr>Tecnologia<td>Dispase</td><td>Life</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Stempro-34</td><td>Life Technology</td><td>10639011</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/ Tecnologia F12</td><td>Life</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>Tecnologia della vita</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>tripsina&nbsp;</td><td>Tecnologia di vita</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>acido ascobico</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>1-Tioglicerina</td><td>Sigma</td><td>M1753</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>R& D</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>Bmp4</td><td>R& D</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>ActivinA</td><td>R& D</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>bFgf</td><td>R& D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>Fgf10</td><td>R& D</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr></tbody></table>

derivazione di cellule cardiache progenitrici di cellule staminali embrionali

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Le cellule progenitrici cardiache (CPC) hanno la capacità di differenziarsi in cardiomiociti, cellule muscolari lisce (SMC) e cellule endoteliali e sono molto promettenti nella terapia cellulare contro le malattie cardiache. Tra i vari metodi per isolare le CPC, la differenziazione delle cellule staminali embrionali (ESC) in CPC attira grande attenzione nel campo poiché le ESC possono fornire una fonte cellulare illimitata. Di conseguenza, sono state sviluppate numerose strategie per derivare le CPC dalle ESC. In questo protocollo, viene descritta la differenziazione e la purificazione delle CPC embrionali sia da ESC di topo che da quelle umane. A causa della difficoltà di utilizzare marcatori di superficie cellulare per isolare le CPC embrionali, le ESC sono ingegnerizzate con reporter fluorescenti attivati dall'espressione della cre ricombinasi specifica per CPC. Pertanto, le CPC possono essere arricchite mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS). Questo protocollo illustra le procedure per formare corpi embrioidi (EB) da ESC per la specificazione e l'arricchimento della CPC. Le CPC isolate possono essere successivamente coltivate per la differenziazione del lignaggio cardiaco e altri saggi biologici. Questo protocollo è ottimizzato per una derivazione robusta ed efficiente di CPC da ESC sia di topo che umano.

Il protocollo mostra derivazione del CPC da diverse linee di cellule ES. CES sono aggregati per formare EB di differenziarsi in CPC. CES sono regolarmente mantenuti su alimentatori MEF (Figura 1A, F) e alimentatori vengono rimossi prima di differenziazione. Su aggregazione dei CES in EBs in terreno di differenziamento (Figura 1B, G), il secondo EBs formati vengono trattati con Bmp4 e Activin A per migliorare la differenziazione mesoderma in linee cellulari di topo (Figura 1C).</...

In questo protocollo, verrà illustrata la derivazione di cellule progenitrici cardiache da cellule staminali embrionali sia di topo che umane. Una delle principali strategie di questo protocollo consiste nell'arricchire le cellule progenitrici cardiache con la citometria a flusso utilizzando reporter fluorescenti ingegnerizzati nelle linee di cellule staminali embrionali.

Derivazione di cellule cardiache progenitrici di cellule staminali embrionali

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare cellule progenitrici cardiache umane o di topo da cellule staminali embrionali. Ciò si ottiene mediante la prima coltura in cellule staminali embrionali di alta qualità o cellule staminali embrionali o cellule nutritrici embrionali di topo o miti. Nella seconda fase, le cellule vengono trasferite in piastre di Petri rivestite di gelatina per facilitare la formazione dei primi corpi embrionali.Successivamente, le cellule vengono associate e i fattori di crescita vengono aggiunti alle colture per indurre i corpi embrionali di seconda forma. Nella fase finale, i corpi embrionali vengono nuovamente dissociati e le cellule risultanti vengono trattate con ulteriori fattori di crescita. In definitiva, le cellule della progenie cardiaca possono essere ulteriormente coltivate per la differenziazione dei cardiomiociti e delle cellule muscolari lisce.Durante il tentativo di questa procedura, è importante testare l'efficienza di differenziazione di ciascuna linea cellulare per consentire la selezione delle cellule con il miglior potenziale cardiogeno. Ora, il Dr. Inland Lamb, un borsista post-dottorato in laboratorio, dimostrerà la procedura

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questa dettagli del protocollo la derivazione di cellule staminali ematopoietiche trapiantabili da topo cellule staminali embrionali (ESC) e la loro successiva iniezione in topi irradiati letalmente destinatario. In breve, ESC si differenziano come corpi embrionali, che sono poi infettati con HoxB4 retrovirali e co-coltura con cellule stromali OP9 e citochine ematopoietiche.

Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini

Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione della cardioblasts pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di risorse umane progenitori cardiaci e funzionale cardiomiociti per la riparazione cardiovascolare.

Derivazione efficiente dei diritti dell&#39;uomo e precursori cardiaci e cardiomiociti pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

Le cellule staminali pluripotenti, sia staminali (iPS), le cellule embrionali pluripotenti o indotto, costituiscono una preziosa fonte di cellule differenziate umani, tra cardiomiociti. Qui, ci si concentrerà sulla induzione cardiaco di cellule iPS, che mostra come usarli per ottenere cardiomiociti umani funzionali attraverso un protocollo embryoid corpi-based.

Generazione di cardiomiociti umani: Un protocollo di differenziazione da alimentatore-Free umani cellule staminali pluripotenti indotte

L'articolo descrive la metodologia dettagliata per differenziare efficacemente le cellule staminali pluripotenti umane in cardiomiociti selettivamente modulando la via di Wnt, seguita da analisi citofluorimetrica di marcatori di riferimento per valutare l'omogeneità e l'identità della popolazione.

Alta efficienza differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane di cardiomiociti e Caratterizzazione mediante citometria di flusso

Qui, presentiamo un metodo per sfruttare in modo efficiente il potenziale di differenziazione cardiache di giovane fonti di cellule staminali mesenchimali umane al fine di generare cellule funzionali, contraenti, del cardiomyocyte-come in vitro.

In Vitro Differenziazione delle cellule staminali mesenchimali umane in funzionale del Cardiomyocyte-come le cellule

Qui descriviamo un metodo scalabile, usando una semplice combinazione di activina A e Id1-sovraespressione di lentivirus-mediata, per generare il primo cuore campo-come progenitori cardiaci e ventricolare-come cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti umane.

Generazione del primo cuore campo-come progenitori cardiaci e ventricolare-come cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti umane

Questo protocollo descrive una tecnica di differenziazione endoteliale di cellule progenitrici cardiache. Si concentra in particolare su come la concentrazione nel siero e la densità di semina delle cellule influenzano il potenziale di differenziazione endoteliale.

Induzione di differenziazione endoteliale in cellule progenitrici cardiache in condizioni di basso del siero

L'obiettivo generale di questo articolo è quello di standardizzare il protocollo per l'isolamento, caratterizzazione e differenziamento di cellule staminali cardiache (CSCs) dal cuore di topo adulto. Qui, descriviamo un metodo di centrifugazione su gradiente di densità per isolare murino CSCs e metodi elaborati per la cultura, la proliferazione e la differenziazione in cardiomiociti di CSC.

Isolamento, caratterizzazione e differenziamento di cellule staminali cardiache dal cuore di topo adulto

Qui, forniamo una descrizione dettagliata di un apparato sperimentale per un'analisi della valutazione dell'integrità del DNA nelle cellule staminali prima del trapianto di cellule.

Valutazione dell'integrità del DNA di cellule staminali per la terapia cellulare cardiaca

Lo scopo di questo metodo è quello di generare cellule progenitrici cardiache specifiche del campo cardiaco del campo cardiaco in vitro al fine di studiare le specifiche delle cellule progenitrici e le proprietà funzionali, e di generare cellule cardiache specifiche della camera per la modellazione delle malattie cardiache.

Generazione in vitro di cellule progenitrici cardiache specifiche del campo del cuore del mouse

Impara a derivare cellule progenitrici cardiache da cellule staminali embrionali di topo e umane. Questo protocollo utilizza citometria a flusso per l'arricchimento e fattori di crescita per la differenziazione.

Derivazione di cellule cardiache progenitrici di cellule staminali embrionali

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