Chirurgia stereotassica dei roditori

La chirurgia stereotassica è una potente tecnica utilizzata per manipolare il cervello negli animali viventi. Il targeting delle regioni in profondità all'interno del cervello intatto pone un problema unico in quanto di solito il bersaglio chirurgico non può essere localizzato visivamente. La chirurgia stereotassica o stereotassica è stata ideata per colpire regioni discrete del cervello conoscendo le loro relazioni spaziali con i punti di riferimento visibili. Utilizzando un sistema di coordinate tridimensionale, gli strumenti possono essere indirizzati a posizioni specifiche per misurare l'attività cerebrale, creare una lesione o eseguire manipolazioni genetiche. Questo video coprirà i principi della chirurgia stereotassica, dimostrerà i passaggi essenziali della procedura e discuterà varie applicazioni della tecnica.

Prima di discutere i dettagli procedurali, esaminiamo i principi e gli strumenti di base della tecnica. Per iniziare, la stereotossia dipende dalla localizzazione della regione target del cervello su un asse tridimensionale. A tale scopo viene utilizzato un atlante stereotassico. Questo documento è una ricostruzione 3D del cervello ottenuta da sezioni seriali di cervelli macchiati.

In questo sistema di riferimento, le relazioni spaziali sono espresse utilizzando un insieme di 3 assi: anteriore-posteriore, mediale-laterale e dorsale-ventrale. Per determinare la posizione di una regione di interesse, trova la regione del cervello appropriata nell'atlante e usa la griglia per calcolare le corrispondenti coordinate mediolaterali e dorsoventrali. La coordinata anteroposteriore si ottiene nella parte inferiore o superiore della pagina. Questa coordinata viene misurata da punti di riferimento sul cranio formati dalle intersezioni di placche ossee, note come punti di sutura. Il punto di riferimento più importante, il bregma, è definito come il punto di intersezione della sutura sagittale con la sutura coronale. Il punto noto come lambda è più posteriore; dove la sutura sagittale interseca la sutura lambdoide.

Per un targeting accurato alla posizione calcolata durante l'intervento chirurgico, viene utilizzato un dispositivo noto come frame stereotassico. Il telaio è costituito dal telaio principale, dal micromanipolatore e dal supporto della sonda, che è collegato al morsetto di montaggio. Incisivi e barre auricolari entrare in contatto con l'animale per tenere la testa in una posizione fissa. Il micromanipolatore viene utilizzato per il movimento preciso delle sonde chirurgiche a coordinate predeterminate all'interno del cervello ed è dotato di scale di Vernier scorrevoli per misurazioni esatte della distanza in tutte e tre le dimensioni.

Per leggere una scala di Vernier, identificare innanzitutto la posizione della linea 0 in relazione ai segni di gradazione sul lato destro della scala. Questo lato della scala è etichettato con incrementi di 10 millimetri, in modo che 1 sia 10 e 2 sia 20. La posizione del segno 0 qui mostra che la lettura è compresa tra 10 e 11 mm. Per determinare il primo numero a destra del punto decimale, trova la linea sulla scala di sinistra che si allinea meglio con un segno sul lato destro. Usa la scala di sinistra per identificare il valore di questo marchio, che in questo caso è 9, rendendo la lettura finale di 10,9 mm.

Ora hai familiarità con i principi di base della stereotassità, quindi esaminiamo come viene eseguita la procedura chirurgica. Prima dell'intervento chirurgico, il cuoio capelluto di un animale anestetizzato viene rasato e disinfettato. Per tenere l'animale in posizione sul telaio stereotassico, le barre auricolari vengono delicatamente posizionate nelle orecchie e i denti anteriori vengono posizionati nelle barre incisivo. L'unguento oculare viene applicato per prevenire l'essiccazione corneale durante l'intervento chirurgico.

Per esporre il cranio, fare una piccola incisione con un bisturi. Separare delicatamente il tessuto muscolare e pulire la superficie del cranio. Quindi, utilizzare il micromanipolatore per abbassare una sonda a bregma e prendere nota della sua coordinata dorsoventrale. Quindi sollevare la sonda e ripetere questa procedura a lambda. Se la misura lambda è inferiore a 0,1 mm dalla coordinata dorsoventrale a bregma, il cranio è considerato in piano e si è pronti a procedere. In caso contrario, alzare o abbassare la barra dell'incisivo e ripetere le misurazioni.

Ora che il cervello è in piano, torna al bregma e registra le coordinate medio-laterali e antero-posteriori. Sulla base delle coordinate target dell'atlante cerebrale, calcola i movimenti necessari per raggiungere quel sito e sposta la sonda nella posizione target. Segna questa posizione sul cranio e usa un trapano per fare con cura un foro nell'osso.

Appena sotto il cranio troverete la dura, una spessa membrana resistente che può essere sezionata delicatamente con la punta di un piccolo ago.

Successivamente, il braccio del micromanipolatore viene posizionato in posizione per abbassare la sonda alla coordinata dorsoventrale mirata, a quel punto è possibile eseguire la manipolazione desiderata.

Ora che hai compreso i passaggi di base della procedura, diamo un'occhiata ad alcuni dei molti modi in cui i neuroscienziati usano la chirurgia stereotassica per rispondere alle domande in laboratorio.

Per cominciare, la stereotassità è estremamente utile per fornire agenti sperimentali in precise regioni del cervello. Questi agenti possono includere coloranti traccianti utilizzati per visualizzare proiezioni neuronali e connettività, composti chimici o reagenti per la manipolazione genetica dei neuroni. Ad esempio, l'iniezione di virus geneticamente modificati comporterà la consegna di un gene di interesse alle cellule infette. Qui, un virus è stato iniettato nell'ippocampo, con conseguente espressione di GFP in una piccola popolazione di neuroni.

D'altra parte, la consegna virale di piccolo RNA interferente può impedire l'espressione delle proteine desiderate. In questo esempio, l'espressione della proteina SOD1 è stata soppressa in diverse regioni del cervello dopo iniezione stereotassica nel ventricolo laterale.

In alternativa, la chirurgia stereotassica può essere utilizzata per posizionare elettrodi nel cervello per la registrazione dei segnali elettrici che accompagnano l'attività neurale. Dopo che l'animale si è ripreso dalla procedura chirurgica, gli elettrodi possono essere collegati a sistemi di registrazione elettrofisiologica per osservare lo sparo neuronale mentre il topo si comporta liberamente.

Oltre a misurare l'attività neuronale, la chirurgia stereotassica è strumentale alla microdialisi. Questa tecnica consente il monitoraggio continuo delle concentrazioni di farmaci, neurotrasmettitori o metaboliti nel tessuto cerebrale degli animali svegli. Per fare questo, una piccola sonda piena di liquido con una membrana semipermeabile sulla sua punta viene impiantata in una specifica regione del cervello. Piccoli soluti tra cui neurotrasmettitori, ormoni e farmaci si diffondono nella sonda, dove possono essere raccolti per l'analisi. In questo esperimento, la concentrazione di glucosio nell'ippocampo è stata misurata come lettura per l'attività neurale locale mentre i ratti completavano un compito che richiedeva l'uso della memoria di lavoro spaziale.

Hai appena visto il video di JoVE sulla chirurgia stereotassica. In questo video, abbiamo trattato i principi e i metodi della procedura, nonché le sue numerose applicazioni nei laboratori di neuroscienze.

Grazie per l'attenzione!