Veloce fluorescente In Situ Protocollo di ibridazione per Xist RNA combinata con immunofluorescenza di istone modifica in cromosoma X inattivazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare le dinamiche dell'RNA e della modificazione epigenetica ad esso associata durante l'inattivazione del cromosoma X utilizzando una rapida ibridazione fluorescente in situ combinata con l'immunofluorescenza. Questo protocollo richiede la preparazione di vetrini con vetrini di embrione differenzianti, che vengono permeati e quindi fissati per la colorazione. Successivamente, il marcatore fluorescente localizzato da un anticorpo contro l'istone H 3 trimetillisina 27 si accumula sul cromosoma X inattivo.

La fase finale utilizza sonde oligonucleotidiche che contengono una modifica di cinque ammino prime e sono marcate con un fluoroforo reattivo medio AM per eseguire l'esistenza. Pesce a RNA. In definitiva, la microscopia a fluorescenza viene utilizzata per mostrare la localizzazione della nuvola di RNA esistente e la modifica degli istoni durante la differenziazione delle cellule E-E.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che utilizziamo più oligonucleotidi unici, che sono marcati con un singolo fluoro quattro. Questo ci fornisce un rilevamento trans specifico, che riduce lo sfondo, e questo aumenta anche la penetrazione nel nucleo e aumenta o migliora l'intensità dei segnali. Inoltre, quando aumentiamo la concentrazione delle sonde, possiamo ridurre significativamente il tempo necessario per completare questo esperimento immuno sui pesci.

Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sulla localizzazione dell'artrite reumatoide esistente sul cromosoma ex inattivo e sulla sua modificazione cromologica associata. Può essere applicato anche ad altri sistemi biologici per la rilevazione di AR e delle modificazioni epigenetiche associate, della localizzazione nucleare e della regolazione transgenerazionale. Per preparare prima le sonde, ottenere più oligo di lunghezza da 20 a 30 nucleotidi con una temperatura di fusione compresa tra 63 e 65 gradi Celsius e che contengono una sequenza antisenso unica per un RNA esistente e una modifica amminica A cinque prime.

Sospendi questi oligo in quantità equimolari di acqua pura dei vari oligo per un totale di 4,5 microgrammi di DNA. Quindi, seguendo le istruzioni del produttore, etichettare gli oligo con un colorante fluorescente reattivo am mean seguendo l'etichettatura degli oligo. Passarli attraverso una colonna G 25.

Quindi, utilizzando etanolo e acetato di sodio, precipitare gli oligo. Ciò richiede un periodo di mezz'ora a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius prima di una centrifuga di 21.000 g a quattro gradi Celsius. Quindi, lavare il pellet una volta con etanolo al 70% dopo il lavaggio.

Resus sospendere gli oligo in 50 microlitri di acqua priva di nucleasi o tris EDTA a una concentrazione finale di 10 micromolari di DNA. Ciò fa sì che la soluzione stock della sonda per utilizzare la sonda la riconcentri a 250 nano molari nel tampone di ibridazione. Per cominciare, far crescere le cellule differenzianti ES o EB in piastre a sei pozzetti, aspirare il terreno di coltura dai pozzetti e quindi lavare le cellule a temperatura ambiente.

PBS aspirare accuratamente il PBS. Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di soluzione di tripsina a ciascun pozzetto e incubare la piastra per cinque-10 minuti. Arrestare la reazione della tripsina aggiungendo cinque millilitri di terreno a ciascun pozzetto e pipettandoli delicatamente.

Quindi trasferire le cellule in una provetta da 15 millilitri. Ora centrifugare le celle per cinque minuti a 200 Gs a temperatura ambiente, rimuovere tutto il surnatante e risospendere il pallet di celle in due millilitri di PBS. Quindi contare le cellule e diluire la sospensione a 400.000 cellule per millilitro in PBS.

A questo punto, assemblare ogni diapositiva con una scheda filtro, una camera e una clip. Creane quanti ne servono e posizionali nel rotore di un cyto spin. Aggiungere 250 microlitri di sospensione cellulare a ciascun vetrino e far girare i vetrini a 1500 giri/min per 10 minuti a temperatura ambiente.

Quindi permeare e fissare. Innanzitutto, trasferire rapidamente i vetrini su PBS ghiacciato per cinque minuti come fase di risciacquo. In secondo luogo, trasferire i vetrini nel tampone CSK ghiacciato per un minuto per gonfiare, il terzo, spostare i vetrini nel tampone CSKT per cinque minuti per permeare le cellule.

In quarto luogo, lavare le cellule in un tampone CSK ghiacciato per un minuto. E infine, fissarli a temperatura ambiente al 4% di aldeide paraforma in PBS per 10 minuti. Innanzitutto, rimuovere i vetrini dalla soluzione di PFA.

Quindi trasferiscili in un barattolo coplan con PBST per alcuni secondi, quindi posizionali su un'inclinazione per scolarli. Quindi, caricare una scatola vuota dei puntali per pipette con acqua sotto l'inserto del supporto dei puntali. Quindi pulire i lati posteriori dei vetrini e trasferirli in questa scatola.

Ora sovrapporre ogni vetrino con 40 microlitri di soluzione bloccante e coprire delicatamente i vetrini con vetrini coprioggetti. Lasciateli incubare nella scatola per 10 minuti sul banco. Quindi rimuovere i vetrini coprioggetti e posizionare i vetrini su un'inclinazione.

Ora aggiungi 40 microlitri della soluzione di anticorpi primari. Riposizionare i vetrini coprioggetti e lasciare incubare i vetrini sul banco per 30 minuti dopo mezz'ora. Rimuovere gli anticorpi non legati lavando due volte i vetrini in PBST in barattoli coplan.

Agitare delicatamente e lasciare andare ogni lavaggio per cinque minuti. Quindi riportare i vetrini in inclinazione e lasciare scolare il PBST. Successivamente rimuovendo la soluzione in eccesso dal retro del vetrino e quindi rimettendo i vetrini nella scatola.

Ora applicare 40 microlitri di soluzione di anticorpi secondari da uno a 500 su ciascun vetrino. Coprire i vetrini con vetrini coprivetrini e lasciarli incubare sul banco per 15 minuti al riparo dalla luce in avanti. I vetrini devono essere sempre protetti dalla luce.

Rimuovere gli anticorpi utilizzando PBST come in precedenza, quindi posizionare i vetrini su un'inclinazione per drenare. Quando si esegue l'immunofluorescenza, preriscaldare una scatola contenente acqua a 37 gradi Celsius. Dopo aver rimosso il tampone di lavaggio dal retro del vetrino, metterli in una scatola di puntali per pipette con acqua a temperatura e applicare 500 microlitri di tampone per il lavaggio del pesce su ogni vetrino.

Lasciateli incubare per cinque minuti. Dopo cinque minuti, aspirare la soluzione dai vetrini accanto a ciascun vetrino a otto microlitri della sonda di lavoro a temperatura ambiente e applicare un vetrino coprioggetti. Ora trasferite i vetrini nella scatola dei vetrini di preriscaldamento e incubateli per una o due ore a 37 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, bagnare i vetrini nel tampone di lavaggio del pesce in un barattolo di coplan a 37 gradi Celsius. Quando i vetrini coprioggetto cadono, operazione che di solito richiede alcuni minuti, rimuovere i vetrini coprioggetto e lasciare incubare i vetrini per cinque minuti. Quindi trasferire i vetrini in un barattolo contenente un tampone per il lavaggio del pesce con 0,5 nanogrammi di colorante dappy per millilitro, sempre a 37 gradi Celsius.

Lasciare incubare i vetrini in questa soluzione per cinque minuti. Ora lava il vetrino in due XSSC cinque minuti a 37 gradi Celsius. Per finire, posizionare le diapositive su uno scarico inclinato superiore a due XSSC.

Puliscili e montali con quattro microlitri di soluzione Antifa contenente dpi. Il pesce immuno rapido è stato utilizzato per osservare la localizzazione dell'RNA esistente e la modifica degli istoni. Nella differenziazione esistono cellule EB femminili, l'RNA appare come una nuvola verde che copre l'intera lunghezza dell'unico cromosoma X inattivato In queste cellule, la modifica dell'istone H tre trimetillisina 27 è visualizzata in rosso e i nuclei sono controcolorati da DPI in blu.

Le cellule EB femmina di topo differenziate sono state elaborate al giorno 12 della differenziazione. In questo momento, più del 90% delle cellule mostrava una nuvola esistente nelle cellule Le sonde oligonucleotidiche corte dei nuclei erano in grado di penetrare in modo efficiente con conseguente colorazione di quasi tutti i segnali dell'istone H tre trimetillisina 27 Con le nuvole di RNA esistenti in 150 nuclei, il 97% dei segnali di RNA esistenti è stato trovato per co-localizzarsi con questi istoni metilati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di cinque ore per completare una leggera preparazione preparatoria.

L'immunoimmunofluorescenza per il suo è di tre trimestri in 27 ed esiste RA. Se abbiamo eseguito correttamente, questo protocollo immuno fish può essere applicato ad altre modificazioni epigenetiche dell'RNA e proteine di interesse. Per applicare questo protocollo a un sistema biologico diverso, potrebbe essere necessaria un'ottimizzazione. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.