Preparazione di Mica supportati doppi strati lipidici per alta risoluzione microscopia ottica Imaging

La procedura qui presentata mostra un metodo semplice per preparare lipidi supportati da MICA mediante strati adatti per l'imaging ad alta risoluzione, come gli studi di tracciamento di singole molecole. La superficie della MICA viene preparata spaccando un sandwich di un singolo foglio di MICA incollato tra il vetrino del microscopio e il vetrino coprioggetti utilizzando un adesivo ottico che espone una superficie di mica fresca piatta ed estremamente sottile. Montando una piccola camera di plastica ricavata da una tazza per fiala da un millilitro e mezzo, il volume delle vescicole lipidiche necessarie per la formazione del doppio strato può essere di soli 30 microlitri.

Come primo passo, prendi il foglio multistrato di MICA così come proviene dal fornitore e taglialo con le forbici in pezzi più piccoli. Distribuire il volantino in due o tre foglioline più sottili utilizzando una lama di coltello fresca. Ora pulisci accuratamente il coperchio.

Ciò comporta il posizionamento di una copertura da 0,17 millimetri. Dorme in un barattolo di vetro per l'allenamento ad ogni coperchio. Dormi in una fessura separata e sonica nel detersivo per 30 minuti a 60 gradi Celsius.

Lavare la fodera. Dorme da 10 a 20 volte con acqua mini key e asciuga con un getto d'aria o azoto. Prendi un vetrino da microscopio e puliscilo con il posto.

Una piccola goccia di circa 15 microlitri di ahe ottico a bassa viscosità sul microscopio blast e sul globo in precedenza. Tagliare il volantino su una scatola di luce UV per alcuni minuti. Usa lo scotch per staccare alcuni strati di mica.

I primi strati saranno frammentati, quindi fallo finché non vedi che gli strati attaccati allo scotch. I nastri sono uniformi e completi. Copri il nastro.

Posizionare una goccia di adesivo ottico ad alta viscosità su Micah Surface. Assicurati che non ci siano bolle d'aria laggiù. Posizionare delicatamente il sonno di copertura pulito sulla gocciolina offensiva.

Usa una pinzetta per picchiettare delicatamente il vetro per allargare l'ahe. Anche in questo caso, polimerizzare l'adesivo con luce UV per alcuni minuti. Con il coltello spaccare il panino in vetro.

Far scorrere MICA e coprire il sonno. Nella maggior parte dei casi, solo uno strato molto sottile di MICA rimarrà incollato al coperchio sleep. Usa il microscopio da dissezione per ispezionare la superficie della MICA facendo un piccolo graffio con la punta di un ago o una pinzetta.

Si può facilmente dire se la superficie è in realtà mica, dove la superficie è uniformemente graffiata, come qui o sull'adesivo ottico, come qui dove la superficie è luminosa. Prendi una tazza da una fiala di vetro da un millilitro e mezzo, rimuovi il gas e incolla il tappo sulla superficie della MICA usando lo smalto per unghie. Lasciate asciugare per qualche minuto.

Ora puoi preparare un lipide di riparazione a doppio strato lipide per strato utilizzando un protocollo standard qui. Una goccia da 30 microlitri di vescicole lipidiche viene inserita nella camera del tappo della fiala e verrà incubata per 60 minuti prima di lavare il tampone. Dopo il lavaggio, il campione è pronto per l'imaging.

In questo caso, viene montato in un portacampioni su misura. Le singole molecole possono essere facilmente osservate su tale superficie di MICA preparata. Qui confrontiamo A-D-O-P-C per strato supportato su vetro e mica.

Si noti che il tipo di movimento differisce sostanzialmente tra queste due superfici. Il percorso delle singole molecole tracciate nei colori nei pannelli di destra mostra chiaramente che il comportamento di diffusione su MICA differisce da quello sul vetro. Tuttavia, non vi è alcuna differenza significativa nella qualità dell'immagine.

La trama media della funzione rettilinea a metà dell'intensità massima per 20 spot è quasi la stessa per entrambi i substrati, indicando che la superficie della MICA è completamente penetrabile dalla luce senza introdurre aberrazioni ottiche evidenti. Nel complesso, la MSDS mostra un'evidente differenza nel comportamento di diffusione. Tuttavia, per ogni caso, si possono osservare due popolazioni di particelle che si diffondono a velocità diverse.

Due diversi coefficienti di diffusione, veloce e lento, sono stati estratti dalla doppia alimentazione esponenziale alla probabilità cumulativa di spostamento quadrato. Per questo doppio strato DOPC, entrambi i componenti di diffusione sono più veloci sulla superficie della MICA, le particelle che si muovono lentamente sulla MICA sono circa 10-20 volte più lente di quella veloce. La popolazione lenta sul vetro, tuttavia, è vicina ad essere immobile da qui.

Abbiamo dimostrato che il tipo di superficie potrebbe fare la differenza nel comportamento di diffusione dei doppi strati lipidici. Pertanto, bisogna fare attenzione quando si confrontano i risultati tra studi su doppi strati supportati su substrati diversi come la MICA e i bistrati di imaging del vetro su MICA è di solito piuttosto difficile a causa della complicata preparazione che abbiamo mostrato, tuttavia, un modo semplice ma efficace di preparare superfici di così alta qualità.