Name: Larvali interferenza RNA nella Red Farina Beetle, Tribolium castaneum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Impara la tecnica di interferenza RNA larvale in Tribolium castaneum per lo studio delle funzioni geniche. Questo metodo permette il knockdown efficiente di geni target attraverso iniezione di dsRNA nella cavità corporea.

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Ringraziamo il Centro di Bioinformatica e Genomica Funzionale (CBFG) presso l&#39;Università di Miami per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da Miami University concessione di start-up (YT), e la National Science Foundation (YT: IOS 0.950.964).

1 T. Azioni castaneum e coltura <ol><li> Decidere su un T. ceppo castaneum da utilizzare per l&#39;esperimento. NOTA: Diversi T. lab-stabilita ceppi castaneum sono disponibili. Ga-1 (Georgia-1) è il ceppo parentale di Ga-2 che è stato utilizzato per il sequenziamento del genoma 3. Dal Ga-1 parti la maggior parte dei polimorfismi del DNA (come polimorfismi a singolo nucleotide, SNPs) con Ga-2, ed è più sana di Ga-2 a causa di meno consanguineità, è ideale per esperimenti di RNAi. Pu-11 è un altro ceppo comodo da usare , come il suo unico maggiore proteina fluorescente gialla (EYFP) espressione in futuro primordi ala ci permette di distinguere l&#39;ultima instar larve di altri stadi (vedi Figura S4 di Clark-Hachtel et al. 2013 12). E &#39;importante documentare che scarabeo ceppo è stato utilizzato nell&#39;esperimento, come sfondi genetici sembrano significativamente AFFect l&#39;RNAi fenotipi 13. </li><li> Preparare T. castaneum farina cultura con l&#39;aggiunta di 5% (in peso) di lievito di birra pre-setacciato alla farina di grano intero organico (dopo la miscelazione, memorizzare la farina cultura a -20 ° C). Aliquota la farina cultura (a temperatura ambiente) in 6 bottiglie di Drosophila archivi di plastica once (circa 40 g / bottiglia). </li><li> Cultura T. castaneum a 30 ° C con 70% di umidità. Utilizzare un incubatore umidità controllata, se possibile. Aggiungere 30-40 adulti per bottiglia cultura (rapporto maschi: femmine 1: 1) per avviare la cultura. NOTA: Anche se la muffa è raramente un problema a 30 ° C, temperature più basse (ad esempio 25 ° C) con il 70% di umidità può causare la crescita di muffe nella farina cultura. Abbassare l&#39;umidità se questo si verifica. </li><li> Trasferire gli adulti ad una nuova cultura bottiglia ogni due settimane per subcoltura (vedere il passaggio 5,2-5,5 per come isolare adulti di farina cultura). NOTA: Ci vogliono circa tre settimane per ottenere l&#39;ultimo larve instar. Alternativavamente, T. culture castaneum possono essere mantenuti ad una temperatura inferiore (20-25 ° C), anche se con un periodo più lungo coltura (tempo di sviluppo a 25 ° C è circa il doppio di quella a 30 ° C). </li></ol> 2. preparazione di soluzioni e strumenti per larvale dsRNA iniezione <ol><li> Sintetizzare molecole di dsRNA omologo al gene bersaglio mediante trascrizione in vitro. Conservare a -80 ° C. Per le procedure di biologia molecolare dettagliate, vedere Filippo e Tomoyasu 2011 11. Si veda anche la discussione di una serie di parametri che devono essere considerati nella progettazione di molecole di dsRNA. </li><li> Rendere 10 ml di tampone fosfato 0,1 M di sodio (pH 7,6 a 25 ° C) miscelando 8,5 ml di 1 M Na 2 HPO 4 con 1,5 ml di 1 M NaH 2 PO 4. Controllare il pH con un pHmetro e regolare di conseguenza. </li><li> Effettuare 1 ml di tampone 10x iniezione miscelando 10 ml di tampone fosfato 0,1 M di sodio (pH 7,6 a 25 ° C), 100 _6, l 0,5 M KCl, 100 ml di colorante alimentare verde, e 790 ml di acqua bidistillata (DDH 2 O). Diluire il buffer 10x iniezione per rendere buffer di iniezione 2x (200 microlitri di buffer 10x iniezione + 800 ml DDH 2 O). Conservare entrambe 10x e 2x iniezione buffer a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Preparare Slides Vetro Sticky. <ol><li> Coprire un intero vetrino con una forma di colla riposizionabile per preparazioni iniettabili larvali. Per le iniezioni adulti o pupa, fare due sottili strisce di colla lungo i bordi più lunghi della diapositiva. </li><li> Lasciare asciugare la colla per diversi giorni, che assicura che la colla rimane abbastanza di cattivo gusto per aderire coleotteri alla diapositiva, pur rimanendo abbastanza flessibile per facilitare la loro rimozione dopo l&#39;iniezione. NOTA: Se la colla rimane troppo appiccicoso, utilizzare un dito e toccare la colla, che ridurrà il cattivo gusto. Ogni diapositiva può contenere fino a 40 o 50 coleotteri, e può essere riutilizzata fino a quando non riesce a tenere saldamente gli animali. Alterntivamente, nastro biadesivo può anche essere utilizzato, anche se il nastro adesivo non è talvolta sufficiente per contenere le larve. </li></ol></li><li> Fare un eterizzazione Basket. <ol><li> Rimuovere lo stantuffo di una siringa monouso 10 ml, e tagliare la siringa a metà intorno alla linea 6 ml. </li><li> Eliminare la metà inferiore della siringa. Brevemente riscaldare la superficie di taglio della parte superiore della siringa con un bruciatore a gas, e spingere rapidamente la plastica fusa su un pezzo di maglia di nylon per incollare la maglia sulla siringa. Tagliare via maglie in eccesso una volta che la plastica si indurisce. </li></ol></li><li> Preparare la bottiglia di etere. Aggiungere 30 ml di etere in una stretta bocca della bottiglia di vetro 100 o 250 ml. Aggiungere diversi pezzi di carta velina per migliorare l&#39;evaporazione dell&#39;etere. NOTA: Ether presenta un pericolo di incendio ed è anche dannoso. Maneggiare sempre l&#39;etere sotto una cappa aspirante. Chiudere il coperchio saldamente quando non in uso. NOTA: ghiaccio può essere utilizzata come alternativa più sicura (ad esempio in classe), anche se il sedation è meno efficace. </li></ol> 3 Preparazione di larvale Apparato di iniezione <ol><li> Inserire un palcoscenico meccanico XY su un microscopio da dissezione. NOTA: XY meccanica sono disponibili presso grandi aziende microscopio. In alternativa, le fasi microscopio economici possono essere utilizzati anche per la maggior parte dei microscopi dissezione con alcune modifiche (vedere la tabella Materiali per esempio). </li><li> Inserire un ago manipolatore meccanico vicino al palco meccanico XY. </li><li> Montare una siringa per iniezione. Utilizzare un rubinetto a quattro vie (con attacchi Luer) per collegare una siringa monouso 30 ml di un porta-aghi di vetro, permettendo la manipolazione della siringa senza influenzare la pressione nel ago di iniezione (vedere Filippo e Tomoyasu 2011 11 per la siringa di iniezione dettagliata assemblaggio). </li></ol> 4. Pulling aghi per iniezione <ol><li> Tirare aghi di vetro borosilicato (B100-50-15, OD: 1 mm, ID: 0,5 mm 15 cm di lunghezza) da unestrattore ago. NOTA: Per Sutter P-87 o P-97, utilizzare l&#39;impostazione &quot;Calore = 70, Pull = 45, Vel = 75, Tempo = 90&quot; o seguire il Capitolo 2 della pipetta Cookbook: cellulari aderenti, C. elegans, Drosophila, e Zebrafish - Programmi consigliati. Le impostazioni ottimali variano a seconda del modello di estrattore ago. L&#39;impostazione per un generico ago per l&#39;iniezione Drosophila è un buon punto di partenza. </li><li> Conservare tirato aghi in una custodia di plastica (ad esempio, un caso di CD in plastica) e fissare con mastice di montaggio rimovibile. </li></ol> 5 Isolamento e selezione di larve <ol><li> Posizionare un 25 # setaccio su un ricevitore setaccio. </li><li> Inserire il contenuto del flacone cultura (coleotteri e farina cultura) sul setaccio e setacciare immediatamente il contenuto. Non lasciare il contenuto del setaccio, senza vagliatura, come larve rapidamente cercare di scavare attraverso il setaccio e si blocca. Aggressivamente vagliare i contenuti per far cadere la farinaattraverso e lasciare le larve più anziani (in genere 6 ° e 7 ° instar larve), pupe e adulti (con le loro cuticole del cast-off, esuvie) dietro in cima al setaccio. </li><li> Trasferire i materiali che rimangono sul setaccio (coleotteri e esuvie) alla padella seme. Toccare ripetutamente la padella per evitare che i coleotteri di fuggire. </li><li> Rimuovere il esuvie e le particelle di farina rimanenti sulla superficie dei coleotteri soffiando delicatamente sopra la padella seme. </li><li> Premere il pan seme per spostare il contenuto al fondo della padella. Poi, lasciare il pan inutilizzato per alcuni secondi. Attendere che per gli adulti, che sono più mobili rispetto ad altre fasi, di uscire dal mucchio. Rimuovere adulti utilizzando un pennello arte (es, larghezza 1 cm). </li><li> Pupe separata battendo delicatamente la padella seme, mantenendo la bocca della padella leggermente verso il basso, come pupe tendono a rotolare velocemente verso la bocca. Utilizzare un pennello per rimuovere le pupe, lasciando solo le larve sul piatto seme. </li><li> Plasso le larve isolato in un piatto pulito Petri. Selezionare un adeguato livello di larve per l&#39;iniezione e metterli in una capsula di Petri separata. NOTA: All&#39;inizio dello scorso larve instar (1-2 giorni dopo la muta larvale finale) sono spesso adatti quando si analizza l&#39;effetto RNAi su morfologie adulti, così come su metamorfosi. E &#39;, tuttavia, a volte necessario per eseguire RNAi al penultimo (o anche prima) fase per valutare la funzione del gene precoce (ad esempio, figure 3E-3H. Vedere anche Clark-Hachtel et al. 2013 12). Utilizzare pupe come riferimento per identificare il formato di instar larve. L&#39;ultimo larve instar sono leggermente più lungo di pupe. Alternativamente, pu-11 può essere utilizzato per identificare l&#39;ultimo larve instar nonché per determinare l&#39;andamento nel tempo dello sviluppo di larve instar ultimo (Figura S4 di Clark-Hachtel et al. 2013 12). </li><li> Mantenere le larve selezionato in una capsula di Petri fino eterizzazione. Posizionare il restodi larve e di altri stadi di coleotteri (come pupe e adulti) di nuovo in una bottiglia cultura con farina e restituirlo al incubatore. </li></ol> 6 Preparazione di aghi per iniezione <ol><li> Posizionare un ago di vetro precedentemente tirato su un vetrino da microscopio in vetro utilizzando tack adesivo o nastro biadesivo. Utilizzando pinze, testare la fine tirato dell&#39;ago, mentre guardando attraverso il microscopio da dissezione per vedere dove le curve punta. Afferra l&#39;area leggermente verso il lato punta dove le curve ago con il forcipe e torsione di rompere. </li><li> Mantenere buoni aghi e scartare gli altri. Si consideri un buon ago come avente un&#39;apertura che non è né troppo grande né troppo piccolo (circa 0,05 mm di diametro. Figure 1A e 1B), ed è angolato per rendere la penetrazione della cuticola larvale facile (Figure 1B e 2A-2B). Si consideri un cattivo ago come (i) troppo piccolo, rendendo l&#39;assorbimento della soluzione di dsRNA nell&#39;ago difficulto (punto 7) (Figure 1D e 2D), (ii) troppo grande, causando lesioni larvale e possibile letalità a seguito di iniezione (figure 1C e 2F), (iii) schietto, rendendo la penetrazione della cuticola difficile e aumentando lesioni. </li><li> Inserire l&#39;ago nel porta-aghi. <ol><li> In primo luogo, svitare la punta del supporto dell&#39;ago e posizionare l&#39;estremità posteriore dell&#39;ago nella punta titolare. Quindi, posizionare la guarnizione di gomma sotto la punta titolare (almeno 1 cm dall&#39;estremità posteriore del ago di vetro). </li><li> Inserire la parte posteriore dell&#39;ago nel supporto, con la guarnizione di gomma completamente inserito nell&#39;apertura del supporto dell&#39;ago. Avvitare la punta di nuovo sul supporto. </li></ol></li><li> Posizionare il supporto dell&#39;ago montato sul manipolatore ago. Tenere il porta-aghi vicino a orizzontale. Regolare la posizione del manipolatore, in modo che la punta dell&#39;ago si trova nel centro della vista quando si cerca attraverso il microscope. </li></ol> 7 Soluzione prealimentazione dsRNA nel Needle <ol><li> Preparare la soluzione iniettabile dsRNA appena prima dell&#39;iniezione, regolando la concentrazione con DDH 2 O e miscelare la soluzione dsRNA con uguali volumi di tampone di iniezione 2x (punto 2.3). Mantenere la soluzione mista su ghiaccio. Si veda la discussione per quanto riguarda la concentrazione dsRNA. </li><li> Tagliare la punta di un 20 microlitri punta della pipetta monouso. Pipettare 10 ml della soluzione nella punta della pipetta tagliato. Rimuovere con cautela la punta della pipetta dalla pipetta mantenendo il liquido sulla punta fornendo contropressione. In alternativa, rimuovere con attenzione la punta e quindi spostare la soluzione alla fine della punta fornendo pressione con un dito. </li><li> Posizionare la punta della pipetta con la soluzione dsRNA sul palco microscopio utilizzando appiccicosa aderenza con l&#39;apertura rivolta verso la punta dell&#39;ago. </li><li> Guardando attraverso il microscopio, spostare lentamente la punta carica verso l&#39;ago fino a che la punta delago è appena dentro la punta della pipetta caricato e nella soluzione. </li><li> Guardando attraverso il microscopio, delicatamente tirare indietro lo stantuffo della siringa per estrarre lentamente la soluzione dsRNA nell&#39;ago. NOTA: Non sovraccaricare l&#39;ago. Come la fine della soluzione dsRNA avvicina alla punta dell&#39;ago, rallentare la velocità di trazione e interrompere il caricamento della soluzione prima della punta dell&#39;ago raggiunga aria. Se l&#39;aria raggiunge la punta, la soluzione sarà rapidamente disegnato nel porta-aghi, causando seri problemi di contaminazione. Procedure di pulizia dettagliate dei porta-aghi sono descritte in Filippo e Tomoyasu 2011 11. </li><li> Togliere la pressione dalla siringa di iniezione e porta-aghi aprendo il rubinetto. Quindi, spostare la punta della pipetta di distanza dalla punta dell&#39;ago. Sollevare l&#39;ago dal palco per evitare di danneggiare accidentalmente l&#39;ago mentre si posiziona il larve sul palco. Rimuovere la punta della pipetta svuotato dal palco. </li></ol&gt; 8 dsRNA iniezione <ol><li> Posizionare le larve nel cestino eterizzazione. Utilizzare meno di 10 larve se l&#39;apprendimento della tecnica. Utilizzare 30-40 larve in un round, una volta agio con la tecnica. </li><li> Posizionare il cestello con larve in bottiglia nell&#39;etere e chiudere il coperchio. NOTA: Ether presenta un pericolo di incendio ed è anche dannoso. Eseguire questo passaggio sotto una cappa aspirante. </li><li> Larve Etherize per circa 3 min. Controllare le larve di movimento dopo 3 min. Metterli nella bottiglia nell&#39;etere per altri 30 secondi se sono ancora in movimento. Non Etherize per più di 5 minuti in quanto ciò può aumentare la mortalità. NOTA: Il momento ottimale eterizzazione può variare a seconda della temperatura e dell&#39;umidità. </li><li> Trasferire le larve eterizzò dal cestello al bordo antiaderente di un vetrino di vetro appiccicoso. Utilizzando una pinza e guardando attraverso il microscopio, raccogliere ognuno larve per uno e metterli sul vetrino. Lay loro lateralmente e delicatamente toccare i loro corpi ftesta rom a coda con le pinze, un po &#39;di stretching come si va, per assicurarsi che essi siano fissati sul vetrino. </li><li> Posizionare il vetrino appiccicosa con larve sul palco microscopio. </li><li> Inserire l&#39;ago caricato dsRNA dolcemente verso il lato dorsale delle larve per evitare di danneggiare il sistema nervoso centrale. Evitare anche la linea mediana dorsale, come il cuore larvale si trova qui. In questo e in successive fasi, utilizzare sempre la fase di spostare le larve all&#39;ago (invece di utilizzare il manipolatore ago per spostare l&#39;ago). NOTA: Il sito di iniezione specifico non importa come RNAi in T. castaneum sembra essere sistemica. Tuttavia, di solito è più facile da iniettare nel lato dorsale dei segmenti toracici o addominali. </li><li> Dopo aver inserito l&#39;ago nel larve, estrarre l&#39;ago leggermente indietro per lasciare spazio per il dsRNA per entrare nella cavità del corpo larvale. </li><li> Premere delicatamente sulla siringa per iniezione fino a che il verde larve turno (o il colore del tampone iniezione) e guardare stretched e pieno. NOTA: Se l&#39;apprendimento della tecnica, cercare di iniettare il più possibile per determinare la quantità di soluzione che può essere iniettato in una larva senza significative letalità. Si tratta generalmente di circa 0,5-0,7 ml. </li><li> Rimuovere l&#39;ago dalla larve. Durante la rimozione dell&#39;ago, tirare leggermente indietro sulla siringa iniezione per evitare la perdita di dsRNA (essere anche attenzione a non tirare in aria). </li><li> Iniettare tutte le larve sulla diapositiva. Assicurarsi di rimuovere le larve che non sono stati iniettati con successo. Iniezione completa prima di larve di svegliarsi (in circa 10 min). </li><li> Rimuovere il vetrino con larve iniettata dal microscopio di iniezione e lasciare la diapositiva per ulteriori 5 minuti fino a che tutte le larve riprendersi dalla eterizzazione. </li><li> Con una pinza e sotto un microscopio da dissezione, sollevare delicatamente le larve dalla testa alla coda di liberarli dalla diapositiva appiccicoso. Posizionare le larve appena rilasciata in un piatto pulito Petri. Lasciare le larve sulla piastra di Petri per 10-15 minuti per consentire l&#39;iniezione wound di coagulo. </li><li> Inserite le larve in un nuovo flacone con farina pulito ed etichetta adeguatamente compreso il nome del ceppo, il tipo di dsRNA iniettato, la concentrazione di dsRNA, numero di larve iniettato, e la data. </li><li> Cultura le larve iniettato a 30 ° C con 70% di umidità. Osservare le larve di RNAi fenotipi regolarmente. NOTA: L&#39;ultima pupate instar larve entro 7 giorni. Poi, le pupe si Eclose in adulti dopo 7 giorni (se non vi è nessuna anomalia nei tempi causata da RNAi). </li></ol> 9 Conferma della Knockdown e fenotipica analisi <ol><li> Considerare valutare l&#39;efficienza di RNAi abbattere da vari differenti tecniche di biologia molecolare, quali quantitativa di trascrizione inversa-PCR (qRT-PCR) e Western Blotting. Vedere Miller et al. 2012 7 e Filippo e Tomoyasu 2011 11 per informazioni dettagliate qPCR e Western Blot protocollo, rispettivamente. </li><li> Analizzare RNAi fenotipi correlati. NOTA: RNAi correlatefenotipi possono essere osservati in diverse fasi diverse e in diverse condizioni di coltura, a seconda dei geni che erano mirati. RNAi può influenzare il coleottero morfologia, metamorfosi, della fisiologia e del comportamento. Quanto spesso la presenza di fenotipo viene controllato e in quali condizioni i coleotteri sono allevati devono essere adattati alle specifiche domande indagati attraverso RNAi. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

<html> Ci sono una serie di questioni importanti che devono essere considerati per garantire il successo di RNAi, tra cui la lunghezza e la concentrazione delle molecole di dsRNA, la concorrenza tra le diverse molecole di dsRNA (quando tenta multipla abbattere), e la possibilità di off-target effetti (OTE). dsRNA Lunghezza La lunghezza delle molecole di dsRNA influisce sull&#39;efficienza della risposta sistemica RNAi, con un dsRNA essendo più efficiente per innescare RNAi 7,14,15 (se il limite più di dsRNA è attualmente nota). La lunghezza dsRNA deve essere più lungo di 50 bp per indurre efficace RNAi in T. castaneum 7. dsRNA tra 150 bp e 500 bp sembra essere l&#39;ideale per esperimenti di RNAi. Anche se le molecole più lunghi dsRNA possono anche essere utilizzati, essi avranno una maggiore probabilità di OTE e il passo-gene clonazione diventerà sempre più difficile. dsRNA Concentrazione ve_content &quot;&gt; differenti gradi di gene knockdown possono essere realizzati in funzione della concentrazione di dsRNA. 1 mg / mL sembra essere una concentrazione iniziale ragionevole, che spesso produce un fenotipo pressoché nullo (possono variare a seconda del gene (s) di interesse ). RNAi può essere eseguita con una concentrazione più elevata (ad esempio, 7-8 mg / mL) per ottenere un forte RNAi fenotipo. RNAi con una diluizione seriale di dsRNA a volte può essere utile per produrre una serie di fenotipi hypomorphic (Dati supplementari di Tomoyasu et al. 2009 8, e Borràs-Castells dati non pubblicati). RNAi Concorso Multipla knockdown gene può essere realizzato in T. castaneum iniettando varie molecole dsRNA diversi contemporaneamente. Tuttavia, è anche noto che avere diverse molecole dsRNA differenti presenti nell&#39;organismo si traduce spesso in concorrenza tra le dsRNAs per l&#39;accesso ai componenti RNAi <sup&gt; 7,14. E &#39;importante utilizzare la stessa lunghezza e la stessa concentrazione per tutti dsRNA durante il tentativo più gene knockdown per evitare un dsRNA fuori competizione gli altri (anche se, ulteriori aggiustamenti della lunghezza dsRNA e la concentrazione può essere richiesto quando i livelli di espressione sono molto diversi tra i geni bersaglio). Noi, così come altri, siamo esibiti con successo doppie e triple knockdown (ad esempio, Tomoyasu et al., 2005 16, Tomoyasu et al. 2009 17, e Yang et al. 2009 18). Anche se fattibile, quadruple RNAi (o più) potrebbe essere difficile, in quanto dovrebbe provocare una significativa riduzione di efficienza RNAi per tutti e quattro i geni bersaglio. Off-targeting OTE è una preoccupazione inerente per gli approcci basati su RNAi. Un modo per ridurre al minimo OTE è quello di identificare le regioni del gene bersaglio che condividono sequenze simili con altri geni ed evitare queste regioni durante la progettazione dsRNA. Una semplice analisi BLAST contro il T. castaneum set gene predetto in grado di identificare tali regioni. Diversi strumenti online permettono anche la valutazione del potenziale di OTE (ad esempio, E-RNAi 19). Esecuzione di RNAi per due regioni non sovrapposte del gene bersaglio è un modo semplice ed efficiente per eliminare la possibilità che osservano fenotipi sono causati da OTE. La possibilità di OTE è ridotto al minimo se RNAi per due regioni non sovrapposte producono gli stessi fenotipi (a meno che le due regioni non sovrapposti condividono una sequenza simile). Valutare gene knockdown con mezzi diversi fenotipica analisi è spesso critico efficacemente presenti i dati relativi RNAi. Due modi principali per valutare gene knockdown sono qRT-PCR e Western Blot. qRT-PCR è un modo conveniente per misurare il livello di mRNA bersaglio, ed è stato utilizzato in molti studi RNAi connesse comprese quelle in T. castaneum (vedi Miller et al. 2.012 7 per esempio). Carner, cautela deve essere presa, come abbiamo visto di recente alcuni casi in cui il livello di mRNA è up-regolato da RNAi (anche se il prodotto proteico è down-regolato) (Borràs-Castells dati non pubblicati). Non è noto se questo mRNA RNAi indotto up-regolazione può essere diffusa o unico per alcuni geni. Western blot è un altro modo per confermare gene knockdown. Questo metodo è abbastanza affidabile come misura la quantità del prodotto finale proteina. Il requisito di un anticorpo specifico contro il prodotto proteico del gene bersaglio è un aspetto negativo di questo approccio. Utilizzando misurazioni multiple indipendenti oltre ad analisi fenotipica aumenterà la fiducia dei dati fenotipici ottenuti con l&#39;analisi basata su RNAi. Fin dalla sua concezione nel T. castaneum, RNAi è stato utilizzato principalmente per studiare la funzione dei geni nello sviluppo e formazione di pattern. Questi T. studi sullo sviluppo castaneum hanno avuto molto successo in caratterizing funzioni evolutivamente conservati e divergevano di geni (rivisto nel Denell 2008 1 e Klingler 2004 2). Studi Tuttavia, a base di RNAi in T. castaneum non sono limitati a biologia dello sviluppo. Ad esempio, RNAi può essere utilizzato per studiare la funzione dei geni in una vasta gamma di risposte fisiologiche e comportamentali, tra cui la tolleranza allo stress, predazione, l&#39;aggressività, scelta del compagno, modelli di attività, e meccanismi di difesa. Una difficoltà di applicare RNAi di questi contesti è la probabilità di effetti pleiotropici. Spesso, geni di interesse avranno una varietà di ruoli in tutto il T. castaneum ciclo di vita, rendendo così la rimozione di geni senza effetti fenotipici indesiderate difficili. Tuttavia, la capacità di eseguire facilmente RNAi in una varietà di fasi spesso può essere una strategia efficace per evitare questi effetti pleiotropici. Ad esempio, l&#39;esecuzione di RNAi negli adulti, invece di larve o pupe potrebbe consentire di aggirare unincurato letalità causata dal gene knockdown durante lo sviluppo precoce. La flessibilità della risposta RNAi in T. castaneum rende quindi questo modello una scelta interessante per adattare RNAi per esperimenti di funzione del gene in risposte fisiologiche e comportamentali. Il T. sistema castaneum è ideale anche per l&#39;uso in un laboratorio didattico. T. castaneum può essere facilmente coltivate su una farina / lievito miscela a temperatura ambiente (25 ° C) senza frequenti subcoltura, e tecniche di RNAi in T. castaneum sono abbastanza semplici da essere adattato ad un laboratorio con i giovani, scienziati di apprendimento. Come RNAi sta diventando una tecnica essenziale in una varietà di campi biologici, è fondamentale che gli studenti sono esposti a questa tecnica. La natura straight-forward della tecnica larvale RNAi in T. castaneum incoraggia inoltre più studenti da coinvolgere nella ricerca, rendendo T. castaneum un ottimo candidato per una classe orientata al sistema genetico. &lt;/ P&gt;

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Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Il coleottero farina rossa, Tribolium castaneum, sta guadagnando popolarità in vari campi della biologia dovuta in parte alla facilità di esecuzione RNA interference (RNAi) 1-3. Gene knockdown tecniche basate RNAi-permettono agli scienziati di effettuare perdita-di-funzione analizza senza utilizzare metodi genetici complessi. T. castaneum mostrano una robusta risposta sistemica RNAi, rendendo possibile l&#39;esecuzione RNAi in qualsiasi momento attraverso la semplice iniezione di RNA a doppio filamento (dsRNA) nel corpo della cavità del coleottero 4-6. Knockdown simultanea di più geni è anche fattibile in T. castaneum iniettando due o più differenti molecole di dsRNA contemporaneamente 7,8. Inoltre, una serie di fenotipi hypomorphic può essere generato da ridurre la concentrazione di dsRNA iniettato 8. Queste caratteristiche fanno di tecniche di genetica inversa basata RNAi-interessanti alternative ai tradizionali genetica diretta a T. castaneum. Dal momento che praticamentetutti T. tessuti castaneum sono suscettibili di molecole dsRNA extracellulare 9, questa tecnica permette ai ricercatori di studiare una vasta gamma di tessuti in contesti diversi. Inoltre, anche se questa relazione si concentra sull&#39;esecuzione di RNAi in T. castaneum, molte procedure qui descritte sono applicabili ad altri insetti. Pertanto, questo protocollo è utile per coloro che desiderano eseguire la perdita-di-funzione analizza nei loro contesti di interesse a T. castaneum, nonché per i ricercatori che intendono applicare una tecnica basata RNAi ad altri insetti. Iniettare dsRNA in larve permette l&#39;analisi funzionale in una varietà di fasi della vita, tra cui il coleottero larvale, pupa e adulto fasi 4,5,10. Abbiamo già segnalato il nostro protocollo di RNAi larvale complessivo, comprese le procedure di biologia molecolare 11. Nella presente relazione, ci si concentra sulla descrizione delle procedure di iniezione dsRNA, che sono meglio spiegati con aiuti visivi. Forniamostep-by-step procedure dettagliate di iniezione così come buoni e cattivi esempi di iniezione. Questo protocollo visuale completa la nostra precedente protocollo, e se combinati, forniscono una visione più completa delle procedure larvali RNAi in T. castaneum. Inoltre, discutiamo i parametri per le molecole dsRNA che potrebbero influenzare il successo di RNAi, applicazione di test basati su RNAi per la ricerca fisiologica, nonché l&#39;applicabilità del protocollo RNAi larvale in un laboratorio didattico.

<table><tbody><tr><td>Farina integrale biologica&nbsp;</td><td>Heartland Mill Inc. Birraio Kansas</td><td>G1</td><td></td></tr><tr><td> s lievito</td><td>MP Biomedicals</td><td>2903312</td><td>Setacciare il lievito con setaccio inox #35 prima dell'uso. Indossare una maschera protettiva e coprire il setaccio con pellicola trasparente, poiché il lievito setacciato è una particella fine e un pericolo respiratorio.</td></tr><tr><td>6 once di plastica Drosophila bottiglie di stock</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-888</td><td></td></tr><tr><td>Setaccio</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>04-881N</td><td>8 pollici di diametro x 2 pollici di diametro Utilizzare #25 (apertura nominale 710 &; micro; m) per larve, pupe e adulti.</td></tr><tr><td>Setaccio</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>04 881 10P</td><td>8 pollici di diametro #35 (Apertura nominale di uscita: 600 & micro; m)&nbsp; Setacci in acciaio inossidabile, 8 pollici. diametro x 2 pollici D. Questo setaccio è ideale per rimuovere i grumi dal lievito in polvere.</td></tr><tr><td>Setaccio ricevitore</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>04-866B</td><td>8 pollici di diametro</td></tr><tr><td>1,5 Quart beccuccio campione piatto&nbsp;</td><td>Seedburo Equipment Co.</td><td>Vasca di raccolta</td> <td>modello 33</td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>BioCold Environmental Inc</td><td>BC26-IN</td><td>Tienilo a 30 gradi C con il 70% di umidità.</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>S374500</tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S397-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Colorante alimentare&nbsp;</td>Vetrino in vetro per microscopio <td>Kroger</td><td></td><td>verde, blu o rosso preferibile</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>22-038-103</td><td></td></tr><tr><td>Tack-It Over& Over</td><td>Aleene's</td><td></td><td>Colla riposizionabile per diapositive appiccicose. Il nastro biadesivo può essere utilizzato in alternativa, tuttavia, abbiamo scoperto che l'adesività varia.</td></tr><tr><td>Custodia per CD in plastica</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillare in vetro borosliciato</td><td>Strumento Sutter</td><td>BF100-50-15</td><td>D.E. 1 mm, D.I. 0,5 mm, 15 cm. Senza filamento</td></tr><tr><td>Estrattore dell'ago</td><td>Strumento Sutter</td><td>P-87 o P-97&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Stucco di montaggio rimovibile&nbsp;</td><td>Loctite Fun-Tak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spolverino a gas compresso</td><td>OfficeMax</td><td>OM96091</td><td></td></tr><tr><td>Forcipe</td><td>Fine Science Tool</td><td>11231-30</td><td>Dumoxel #3 (per manipolare i coleotteri)</td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Fine Science Tool</td><td>11252-20</td><td>INOX #5 (per rompere le punte degli aghi)</td></tr><tr><td>Etere etilico, anidro&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>E138-500</td><td></td></tr><tr><td>Rete di nylon</td><td>Flystuff/Genessee Scientific</td><td>57-102</td><td>120 &; m dimensione dei pori/49% area aperta</td></tr><tr><td>Flacone per terreni, 100 ml</td><td>VWR</td><td>89000-926</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Discovery V12. Microscopio per iniezione.</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Fisher/Zeiss</td><td>12-070-513&nbsp;</td><td>Stemi2000. Utilizzare per rompere l'ago e posizionare le larve sul vetrino adesivo.</td></tr><tr><td>Stadio meccanico X-Y&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>435460000000000000</td><td></td></tr><tr><td>Stadio meccanico X-Y&nbsp;</td><td>Microscopenet.com</td><td>A512</td><td>Manipolatore alternativo economico</td></tr><tr><td></td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Supporto magnetico</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Supporto capillare in vetro</td><td>Narishige</td><td>IM-H1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Siringa monouso da 30 ml Siringa</td><td>BD</td><td>309650</td><td>BD Luer-Lok</td></tr><tr><td>Tip Rubinetto a quattro vie&nbsp;</td><td>Cole-Parmer Instrument Co.</td><td>EW-30600-03</td><td>Rubinetti con connessioni Luer; 4 vie; slip maschio</td></tr><tr><td>Pennello artistico</td><td>Amazon</td><td>Art Advantage Set di pennelli per olio e acrilico, 24 pezzi</td><td>Qualsiasi pennello generale funzionerà.</td></tr></tbody></table>

larvali interferenza rna nella red farina beetle, tribolium castaneum

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Il coleottero farina rossa, Tribolium castaneum, offre un repertorio di strumenti sperimentali per studi genetici e di sviluppo, tra cui una sequenza completamente annotata del genoma, la transgenesi base trasposone-, e l&#39;interferenza dell&#39;RNA efficace (RNAi). Tra questi vantaggi, le tecniche di gene knockdown a base di RNAi sono al centro della ricerca Tribolium. T. castaneum mostrano una robusta risposta sistemica RNAi, rendendo possibile l&#39;esecuzione RNAi in ogni fase della vita, semplicemente iniettando RNA a doppio filamento (dsRNA) nel corpo della cavità del coleottero. In questo rapporto, forniamo una panoramica della nostra tecnica larvale RNAi in T. castaneum. Il protocollo comprende (i) isolamento della corretta fase di T. castaneum larve per l&#39;iniezione, (ii) la preparazione per l&#39;impostazione di iniezione, e (iii) iniezione di dsRNA. Larvale RNAi è una tecnica semplice, ma potente, che ci fornisce un rapido accesso a phenotyp perdita-di-funzionees, tra cui più geni fenotipi smontabile come pure una serie di fenotipi hypomorphic. Poiché praticamente tutti T. tessuti castaneum sono suscettibili di dsRNA extracellulare, la tecnica larvale RNAi permette ai ricercatori di studiare una vasta gamma di tessuti in contesti diversi, tra cui la base genetica delle risposte organismal per l&#39;ambiente esterno. Inoltre, la semplicità di questa tecnica stimola più coinvolgimento studente nella ricerca, rendendo T. castaneum un sistema genetico ideale per l&#39;utilizzo in un ambiente di classe.

Uno dei passaggi chiave per iniezione di successo è quello di fare un buon ago. Come descritto al punto 6, la punta dell'ago deve essere spezzato prima di iniettarlo T. castaneum. Esempi di aghi positive e negative sono mostrati in Figura 1. Un buon dell'ago ha una punta affilata e rigido, con un'apertura di diametro circa 0,05 mm (Figura 1B). La figura 2 presenta una iniezione di successo (figure 2A e 2B), nonché diversi casi di iniezioni falliti (Figure 2C-2F). Con un ago per iniezione adeguatamente dimensionato, la punta dell'ago penetra la cuticola larvale con una resistenza minima (Figura 2A), e la soluzione dsRNA (verde) sfocia nel larve senza perdite (Figura 2B). Non over-inject, in quanto causerà la fuoriuscita della soluzione dsRNA anche con una di dimensioni adeguate ago per iniezione (Figura2C). Se la punta dell'ago è troppo sottile, la punta dell'ago spesso non riesce a penetrare la cuticola larvale e curve, rendendo difficile l'iniezione (Figura 2D). Se questo accade, taglio la punta dell'ago a volte aiuta. Aghi più grandi sono spesso ancora utilizzabili, anche se con qualche difficoltà nel penetrare la cuticola larvale (Figura 2E). Tuttavia, una grande quantità della soluzione di dsRNA è facilmente spinto fuori dall'ago anche con una leggera pressione sulla siringa per iniezione, spesso causando un overflow della soluzione dsRNA (Figura 2F). Quando si esegue RNAi, è importante avere un controllo positivo per valutare che RNAi funziona correttamente, e un controllo negativo per verificare che l'effetto osservato non è un effetto non specifico di dsRNA o una conseguenza delle procedure di iniezione (come pregiudizio causato per iniezione, o anormalità da eterizzazione). L'iniezione di dsRNA EYFP di targeting può servire come unbuon controllo positivo quando si utilizza il pu-11 ceppo 5,7. Quando EYFP dsRNA viene iniettato nell'ultima fase larvale, una significativa riduzione del segnale EYFP in futuro primordi ala può essere osservata fin dal giorno dopo una sola iniezione (Figura 3A). L'atterramento di EYFP è completa due giorni dopo l'iniezione del EYFP dsRNA (Figura 3B) e questo atterramento persiste attraverso l'(3C Figure e 3D) stadio di pupa e per tutta la vita del coleottero se la concentrazione dsRNA è abbastanza alta (ad esempio 1 mg / mL) 7. EYFP dsRNA può anche essere usato come controllo negativo in quanto si tratta di una sequenza di geni non-endogeno e non dovrebbe causare interruzioni morfologiche o fisiologiche (Figure 3A-3D). Abbiamo fornito le immagini di larvale RNAi per vestigiali (VG), un'ala gene critico 12, come un altro esempio di come efdifettoso questa tecnica RNAi basata iniezione è in T. castaneum. Quando dsRNA per VG viene iniettato in larve penultima tappa (una tappa prima dell'ultimo stadio larvale), una perdita completa delle strutture alari può essere osservata nella fase di pupa (Figure 3E e 3F). L'adulto risulta inoltre manca completamente strutture alari (Figure 3G e 3H). Il risultato RNAi per vg esemplifica sia per la robustezza e la natura sistemica di RNAi in T. castaneum. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" width="500"> Figura 1: (A) Esempi di aghi ininterrotte, buoni e cattivi (B) La punta di un buon ago ben spezzato (C) La punta di un ago rotto che è troppo grande e smussato (D) La punta... di un rotto n ago che è troppo sottile. Barre di scala (rosso) sono 0,05 millimetri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg" width="500"> Figura 2:... (A) di dimensioni adeguate ago per iniezione inserito l'ultima larva instar (B) Larva opportunamente iniettato con la soluzione verde dsRNA (C) Overflow della soluzione dsRNA nel punto di iniezione causato da un eccesso di iniezione (D ) Un ago sottile non riuscendo a penetrare la cuticola larvale. (E) Una grande ago per iniezione inserita l'ultima larva instar. (F) Larva iniettato con un grosso ago, con conseguente trabocco e la fuoriuscita della soluzione dsRNA. Le frecce indicano gli aghi.ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg "target =" _blank "&gt; Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" width="500"> Figura 3: Esempi di successo RNAi in T. castaneum. (AD) Ultima iniezione larvale dei risultati EYFP dsRNA in una riduzione di espressione EYFP. (A) Larve un giorno dopo l'iniezione. (B) Larve due giorni dopo l'iniezione. (C) Controllo pupe. (D) Pupae derivanti da larvale EYFP dsRNA iniezione. I controlli negativi sono tampone di iniezione (A, B) e DsRed dsRNA iniezione (C, D). Frecce e frecce indicano espressione EYFP o la loro mancanza nel primordi ala e gli occhi, rispettivamente. (EH) Penultimo larvale RNAi per vg. (E) Selvaggio-tipo pupa. (F) VG RNAi pupa. La mancanza di strutture alari è già visibile allo stadio di pupa (freccia). G) Wild-tipo adulto. (H) VG RNAi adulto. Strutture Ala correlate sono completamente mancanti (freccia). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

RNA interference (RNAi) tecniche di gene knockdown basati sono al centro della ricerca Tribolium. Qui, forniamo una panoramica della nostra tecnica larvale RNAi in Tribolium castaneum. Larvale RNAi è una tecnica semplice, ma potente che consente di accedere rapidamente alla perdita-di-funzione di fenotipi, consentendo ai ricercatori di studiare le funzioni del gene in contesti diversi.

Larvali interferenza RNA nella Red Farina Beetle, Tribolium castaneum

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di abbattere un gene di interesse attraverso l'interferenza dell'RNA nel coleottero rosso dei fiori trium cadium iniettando una soluzione di RNA a doppio filamento nella cavità del corpo larvale. Ciò si ottiene isolando prima lo stadio corretto delle larve dalla coltura setacciando il fiore di coltura e separando le larve dagli altri stadi dei coleotteri su un piatto di semi. Il secondo passo consiste nel preparare un ago per iniezione rompendo la punta dell'ago, posizionandolo su un portaago e caricando frontalmente, una soluzione di RNA a doppio filamento della concentrazione desiderata nell'ago.Quindi, autorizza le larve isolate e posiziona le larve su un vetrino appiccicoso. Il passaggio finale consiste nell'iniettare le larve con una soluzione di RNA a doppio filamento al microscopio da dissezione. Infine, i fenotipi correlati all'RNAi allo stadio desiderato vengono analizzati per determinare la funzione del gene bersaglio.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la neurogenesi o la transgenesi, è che solo una semplice iniezione di una soluzione di RNA a filamento doppietto nella cavità corporea dei coleotteri può indurre un knockdown genico efficiente e duraturo in qualsiasi fase desiderata dello sviluppo del bedo. Sebbene il protocollo qui descritto si concentrerà sulle larve di trium castin con alcune modifiche, le procedure di iniezione possono essere applicate ad altri stadi di trium, castin e altri insetti. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a fare un buon ago e iniettare la quantità appropriata di soluzione di RNA a doppio filamento senza uccidere le larve.La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale in quanto le fasi di iniezione dell'RNA a filamento doppietto e di preparazione dell'ago sono difficili da descrivere e possono essere apprese solo attraverso l'osservazione e la pratica della cultura. Il ceppo di scelta del cast di tè come dettagliato nel protocollo di testo allegato. Svuotare immediatamente una bottiglia di coltura dei coleotteri su un setaccio numero 25 e setacciare in modo aggressivo per raccogliere le larve più vecchie, i pupi e gli adulti.Quindi trasferisci i coleotteri insieme all'exus in una padella di semi picchiettando per evitare che i coleotteri scappino. Ora, soffia delicatamente sulla padella dei semi per rimuovere l'exus e le particelle di fiori dalla superficie dei coleotteri. Tocca la padella dei semi per depositarti.Il contenuto. Aspettate che gli adulti più mobili escano dal mucchio e rimuoveteli per separare l'angolo dei pupi, la padella leggermente verso il basso. Bussare delicatamente per arrotolare e rimuovere i pupi, lasciando solo le larve sul vaschetto dei semi.Ora metti le larve isolate in una capsula di Petri pulita. Selezionare lo stadio larvale desiderato per l'iniezione al microscopio e conservarlo in una capsula di Petri fino all'autorizzazione. Combina le fasi rimanenti dei coleotteri e rimettili in una bottiglia di coltura.Collegare un ago di vetro estratto su un microscopio di vetro. Scivolare sotto un microscopio da dissezione. Individua il punto in cui si piega la punta.Afferrare leggermente l'area verso il lato della punta e ruotare per rompere per una penetrazione ottimale della cuticola larvale, selezionare un ago con un'apertura angolata di circa 0,05 millimetri di diametro. Ora svitare la punta del portaago. Posizionare l'estremità posteriore dell'ago nella punta del supporto e la guarnizione in gomma sotto la punta del supporto.Quindi inserire il dorso dell'ago nel supporto, assicurandosi che la guarnizione in gomma sia inserita nell'apertura. Riavvitare la punta sul supporto. Ora posiziona il portaaghi assemblato sul manipolatore di aghi.Regolare la posizione in modo che la punta dell'ago sia centrata sotto il campo visivo del microscopio. Preparare la soluzione di RNA a doppio filamento appena prima dell'iniezione. Tagliare la punta di un puntale per pipetta monouso da 20 microlitri.Ora pipettare 10 microlitri di soluzione nel puntale della pipetta tagliato. Rimuovere con cautela il puntale della pipetta dalla pipetta, mantenendo il fluido sul puntale esercitando una contropressione. Posizionare la punta della pipetta con la soluzione di RNA a doppio filamento sul tavolino del microscopio.Guardando attraverso il microscopio, spostare lentamente la punta caricata verso l'ago fino a quando la punta dell'ago non si trova appena all'interno della punta della pipetta caricata e nella soluzione. Quindi tirare delicatamente indietro lo stantuffo della siringa per iniezione per tirare lentamente la soluzione nell'ago senza sovraccaricare l'ago. Quando l'estremità della soluzione di DS RNA si avvicina alla punta dell'ago, rallentare la velocità di trazione e interrompere il caricamento della soluzione prima che la punta dell'ago raggiunga l'aria per evitare un rapido assorbimento nel supporto dell'ago.Aprire il rubinetto di arresto per rimuovere la pressione dalla siringa di iniezione e dal supporto dell'ago. Quindi allontanare la punta della pipetta dalla punta dell'ago. A questo punto, sollevare l'ago sul tavolino e rimuovere la punta della pipetta svuotata dal tavolino del microscopio.Metti le larve nel cestello di autorizzazione e poi metti il cestello nella bottiglia di etere e chiudi il coperchio. Dopo tre minuti, controllare il movimento delle larve. Se sono ancora in movimento, rimettili nella bottiglia di etere per altri 30 secondi.Trasferire le larve autorizzate E dal cestello al bordo antiaderente di un vetrino appiccicoso. Trasferire le larve in sequenza sul vetrino. Appoggiare ciascuno lateralmente.Picchiettare delicatamente il corpo dalla testa alla coda con una pinza e allungarlo leggermente per fissare le larve sul vetrino. Posizionare ora il vetrino preparato sul tavolino del microscopio. Inserire delicatamente l'ago caricato con RNA a doppio filamento nel lato dorsale delle larve, utilizzando il tavolino per spostare le larve verso l'ago.Quindi tirare leggermente indietro l'ago per l'RNA DS. Per entrare nella cavità del corpo della larva, spingere delicatamente la siringa per iniezione fino a quando le larve diventano verdi e appaiono allungate e piene. Quindi, rimuovere l'ago dalle larve tirando leggermente indietro la siringa per iniezione.Iniettare tutte le larve sul vetrino. Assicurati di rimuovere le larve che non sono state iniettate con successo. Mettere da parte le larve iniettate fino a quando tutte le larve non si riprendono dall'autorizzazione E.Ora solleva delicatamente le larve dalla testa alla coda, trasferiscile in una capsula di Petri pulita e lasciale almeno 10 minuti per consentire alla ferita da iniezione di coagularsi. Poi la coltura, le larve iniettate a 30 gradi Celsius con il 70% di umidità. Osservare regolarmente le larve per i fenotipi RNAI.Questi esempi mostrano diversi livelli di successo delle iniezioni con una soluzione di RNA verde a doppio filamento nell'ultima larva di stadio con un ago per iniezione di dimensioni adeguate. La punta dell'ago penetra nella cuticola della larva con una resistenza minima e la soluzione verde di RNA DS fluisce nelle larve senza alcuna perdita. Nel ceppo PU 11, la proteina fluorescente gialla potenziata può fungere da buon controllo positivo per esperimenti di iniezione di RNA a doppio filamento.Quando l'EYFP DS RNA viene iniettato nell'ultimo stadio larvale, si può osservare una significativa riduzione del segnale EYFP nel futuro primordiale dell'ala già un giorno dopo l'iniezione. Il knockdown dell'espressione di EYFP è generalmente osservabile due giorni dopo l'iniezione e, se la concentrazione di RNA DS è sufficientemente alta, persisterà per tutta la fase pupillare e per tutta la vita del coleottero. Poiché l'EYFP è una sequenza genica non endogena, questo gene può essere utilizzato anche come controllo negativo che non dovrebbe causare interruzioni morfologiche o fisiologiche.In questo esperimento, l'RNA a doppio filamento per vestigiale, un gene critico dell'ala, è stato iniettato in larve del penultimo stadio. Si noti che la completa perdita delle strutture alari può essere osservata nella fase pupillare. L'adulto risultante manca anche completamente di strutture alari.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di due ore se viene eseguita correttamente Seguendo questa procedura. Altri metodi, come la PCR quantitativa in tempo reale, l'ibridazione in situ o l'immunoistochimica, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come quali geni sono regolati dal gene bersaglio dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori per eseguire l'analisi della perdita di funzione e le fasi post-embrionali in traum casten senza utilizzare complesse tecniche genetiche.La natura semplice di questo metodo lo rende anche altamente applicabile a un contesto didattico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come selezionare lo stadio appropriato dell'amore per l'iniezione, come realizzare un ago per iniezione ed eseguire con successo l'iniezione consentita di RNA a doppio standard. Questo protocollo ti permetterà di valutare la funzione del gene attraverso il livello di RNI in Trium.

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