1.6: Colorazione istologica del tessuto neurale

Le fette, o sezioni, di tessuto cerebrale sono un materiale ricco per studiare la struttura e la funzione del cervello. Tuttavia, il cervello non trattato è un tessuto visivamente uniforme, come una tela bianca. La colorazione è un modo di ?dipingere? il cervello per visualizzare chiaramente i componenti cellulari, strutturali e molecolari dell'organo. Sebbene la maggior parte delle colorazioni condivida metodi istologici comuni, ogni approccio ha un obiettivo morfologico unico. Questo video fornirà una panoramica dei principi generali dell'istologia cerebrale, dimostrerà alcune tecniche di colorazione comuni e passerà in rassegna alcune applicazioni di questi metodi nei laboratori di neuroscienze di oggi.

Prima di discutere come vengono eseguite le procedure di colorazione neurologica, esaminiamo gli obiettivi di queste tecniche.

Le colorazioni istologiche sono comunemente usate per fornire contrasto, rivelando così caratteristiche che non possono essere distinte nel tessuto non colorato. Ad esempio, per visualizzare i corpi cellulari dei neuroni, o somata, che compongono la materia grigia del sistema nervoso, sono disponibili più colorazioni. I coloranti utilizzati nei coloranti di Nissl si attaccano agli acidi nucleici, colorando il somata di viola e rivelando l'organizzazione neuronale.

In alternativa, per osservare la sostanza bianca, puoi colorare la mielina - la guaina degli acidi grassi che circonda gli assoni - con coloranti come Luxol Fast Blue. In alternativa, la colorazione immunoistochimica può evidenziare bersagli molecolari presenti su specifici tipi di cellule. Questa tecnica sfrutta la specificità tra anticorpi e bersagli molecolari noti come antigeni. L'uso di anticorpi fusi a enzimi o composti fluorescenti consente ai ricercatori di visualizzare i loro siti di legame utilizzando reazioni enzimatiche o fluorescenza.

Ora che ti è stata presentata l'idea delle sezioni di colorazione, diamo un'occhiata ai passaggi istologici comuni che precedono la colorazione del tessuto cerebrale e garantiscono le condizioni ottimali per la visualizzazione.

Per preservare la struttura dei tessuti, il cervello viene prima perfuso, il che significa che il sangue viene drenato dal cervello e la vascolarizzazione dell'animale viene utilizzata per fornire un fissativo chimico. Dopo la dissezione, il cervello è completamente immerso nel fissativo per completare il processo di conservazione.

Successivamente, il campione viene incorporato in un mezzo con proprietà meccaniche simili al tessuto cerebrale, come la cera di paraffina. Dopo l'inclusione, il cervello viene sezionato in modo sottile utilizzando uno strumento noto come microtomo. Le fette vengono poi montate su scivoli e lasciate asciugare.

Poiché la maggior parte dei coloranti sono a base d'acqua, il tessuto deve essere decerato e reidratato prima che possa iniziare la colorazione. Per fare ciò, i vetrini vengono risciacquati in xilene per sciogliere la cera prima della graduale reidratazione attraverso una serie di etanolo sempre più diluito. Questo processo deve essere eseguito in una cappa aspirante indossando gli appositi dispositivi di protezione individuale.

Dopo aver preparato il tessuto cerebrale, ora sei pronto per iniziare la procedura di colorazione.

Il primo passo, noto come blocco, riduce la colorazione di fondo causata dal legame di anticorpi non specifici. L'esposizione della sezione al siero consente di ottenere questo risultato introducendo anticorpi non marcati che si legano a siti non bersaglio. Dopo un blocco notturno di 30 minuti, il tessuto è pronto per l'incubazione con l'anticorpo primario, che si lega a specifici bersagli molecolari.

Gli anticorpi sono solitamente diluiti in una soluzione bloccante contenente detergente, che distrugge le membrane cellulari e consente agli anticorpi di entrare nel citoplasma.

Dopo un'incubazione notturna, gli anticorpi primari in eccesso vengono rimossi mediante brevi lavaggi in tampone. Successivamente, vengono introdotti gli anticorpi secondari, coniugati a enzimi o fluorofori, per marcare in modo specifico gli anticorpi primari. Diverse ore dopo, gli anticorpi in eccesso vengono rimossi con più cambi di tampone.

Ora che i bersagli sono stati etichettati, parliamo di come rilevarli. Per i secondari coniugati con enzimi, ciò si ottiene mediante l'introduzione di un substrato cromogenico. Quando il substrato interagisce con l'enzima, si verifica un cambiamento di colore, da cui il termine "cromogenico". Una volta ottenuta la colorazione desiderata, in genere dopo circa 2 minuti, la reazione viene interrotta immergendo rapidamente le sezioni in acqua.

Dopo la colorazione degli anticorpi, potrebbe essere necessario un secondo passaggio per fornire un contesto neuroanatomico ai risultati. Ad esempio, si può scegliere di migliorare il contrasto dei tessuti utilizzando una colorazione Nissl. Questa procedura si basa su coloranti basici come la violetta Cresile, che interagiscono con gli acidi nucleici.

Il primo passo è filtrare la soluzione colorante per rimuovere i cristalli non disciolti. I vetrini vengono quindi incubati in colorazione fino a raggiungere il contrasto desiderato. Quindi, lavare le sezioni in più cambi d'acqua per fermare la macchia.

I vetrini vengono poi immersi in una serie di alcool per eliminare la macchia in eccesso e disidratare le fette. Dopo la disidratazione, le fette vengono pulite con xilene, che rimuove l'alcol e migliora l'imaging poiché ha proprietà di diffrazione della luce simili a quelle del tessuto.

Per preservare le sezioni colorate per un'analisi successiva, vetrino coprioggetti con un mezzo di montaggio permanente e lasciare asciugare per una notte.

Ora che abbiamo delineato le procedure e gli obiettivi della colorazione, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni.

Prima di tutto, la colorazione istologica viene utilizzata di routine per visualizzare i singoli neuroni. A sua volta, la visualizzazione è necessaria per tecniche come la microdissezione a cattura laser, in cui i ricercatori utilizzano un laser per isolare cellule specifiche cresciute su un film sottile. Il materiale genetico può essere estratto dalle cellule colorate e sezionate, consentendo ai ricercatori di studiare l'espressione genica neurone-specifica.

La colorazione può anche essere impiegata per caratterizzare le caratteristiche morfologiche dei singoli neuroni. In questo esperimento, l'immunoistochimica viene eseguita su cellule che esprimono GFP per visualizzare i dendriti che formano sinapsi. La colorazione viene confrontata tra cellule normali e attivate, rivelando che i dendriti subiscono molteplici cambiamenti in risposta agli stimoli attivanti.

Infine, grazie alla specificità dell'IHC, l'espressione di singole proteine può essere utilizzata per identificare la posizione e l'identità di popolazioni cellulari uniche nel sistema nervoso. Ad esempio, la colorazione del cervelletto di topo con anticorpi zebrina 2 rivela la posizione di neuroni specializzati noti come cellule di Purkinje.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla colorazione mirata delle fette di cervello. In questo video abbiamo dimostrato i metodi generali e gli obiettivi della colorazione, oltre alle procedure specifiche per la colorazione IHC e Nissl.

Grazie per l'attenzione!