Colorazione istologica del tessuto neurale

Fette, o sezioni, di tessuto cerebrale sono un materiale ricco per studiare la struttura e la funzione del cervello. Tuttavia, il cervello non trattato è un tessuto visivamente uniforme, come una tela bianca. La colorazione è un modo di "dipingere" il cervello per visualizzare chiaramente i componenti cellulari, strutturali e molecolari dell'organo. Mentre la maggior parte delle macchie condividono metodi istologici comuni, ogni approccio ha un obiettivo morfologico unico. Questo video fornirà uno schema dei principi generali dell'istologia cerebrale, dimostrerà alcune tecniche di colorazione comuni e esaminerà alcune applicazioni di questi metodi nei laboratori di neuroscienze di oggi.

Prima di discutere come vengono eseguite le procedure di colorazione neurologica, esaminiamo gli obiettivi di queste tecniche.

Le macchie istologiche sono comunemente usate per fornire contrasto, rivelando così caratteristiche che non possono essere distinte nel tessuto non macchiato. Ad esempio, per visualizzare i corpi cellulari neuronali, o somata, che compongono la materia grigia del sistema nervoso, sono disponibili più macchie. I coloranti utilizzati nelle macchie di Nissl si attaccano agli acidi nucleici, colorando il somata viola e rivelando l'organizzazione neuronale.

In alternativa, per guardare la sostanza bianca, puoi macchiare la mielina - la guaina degli acidi grassi che circonda gli assoni - con coloranti come Luxol Fast Blue. In alternativa, la colorazione immunoistochimica può evidenziare bersagli molecolari trovati su specifici tipi di cellule. Questa tecnica sfrutta la specificità tra anticorpi e bersagli molecolari noti come antigeni. L'uso di anticorpi fusi a enzimi o composti fluorescenti consente ai ricercatori di visualizzare i loro siti di legame utilizzando reazioni enzimatiche o fluorescenza.

Ora che sei stato introdotto all'idea di colorare le sezioni, diamo un'occhiata ai passaggi istologici comuni che precedono la colorazione del tessuto cerebrale e garantiscono condizioni ottimali per la visualizzazione.

Per preservare la struttura dei tessuti, il cervello viene prima perfuso, il che significa che il sangue viene drenato dal cervello e la vascolarizzazione dell'animale viene utilizzata per fornire un fissativo chimico. Dopo la dissezione, il cervello è completamente immerso nel fissativo per completare il processo di conservazione.

Successivamente, il campione è incorporato in un mezzo con proprietà meccaniche simili al tessuto cerebrale, come la cera di paraffina. Dopo l'incorporamento, il cervello viene sezionato sottilmente utilizzando uno strumento noto come microtomo. Le fette vengono poi montate su vetrini e lasciate asciugare.

Poiché la maggior parte dei coloranti sono a base d'acqua, il tessuto deve essere decerato e reidratato prima che la colorazione possa iniziare. Per fare ciò, i vetrini vengono risciacquati in xilene per sciogliere la cera prima della reidratazione graduale attraverso una serie di etanolo sempre più diluito. Questo processo deve essere eseguito in una cappa aspirante mentre si indossano i dispositivi di protezione individuale appropriati.

Dopo aver preparato il tessuto cerebrale, ora sei pronto per iniziare la procedura di colorazione.

Il primo passo, noto come blocco, riduce la colorazione di fondo causata dal legame anticorpale non specifico. L'esposizione della sezione al siero realizza questo obiettivo introducendo anticorpi non etichettati che si legano a siti non bersaglio. Dopo un blocco di 30 minuti per la notte, il tessuto è pronto per l'incubazione con anticorpo primario, che si lega a specifici bersagli molecolari.

Gli anticorpi sono solitamente diluiti in una soluzione bloccante contenente detergente, che interrompe le membrane cellulari e consente agli anticorpi di entrare nel citoplasma.

Dopo un'incubazione notturna, gli anticorpi primari in eccesso vengono rimossi mediante brevi lavaggi nel tampone. Successivamente, gli anticorpi secondari, coniugati a enzimi o fluorofori, vengono introdotti per etichettare specificamente gli anticorpi primari. Diverse ore dopo, gli anticorpi in eccesso vengono rimossi con più cambiamenti di buffer.

Ora che gli obiettivi sono stati etichettati, parliamo di come rilevarli. Per i secondari coniugati con enzimi, ciò si ottiene con l'introduzione di un substrato cromogenico. Quando il substrato interagisce con l'enzima, si verifica un cambiamento di colore, da cui il termine "cromogenico". Una volta raggiunta la colorazione desiderata, in genere dopo circa 2 minuti, la reazione viene interrotta immergendo rapidamente le sezioni in acqua.

Dopo la colorazione degli anticorpi, potrebbe essere ancora necessario un secondo passo per fornire un contesto neuroanatomico ai risultati. Ad esempio, è possibile scegliere di migliorare il contrasto dei tessuti utilizzando una macchia Nissl. Questa procedura si basa su coloranti di base come il violetto di Cresyl, che interagiscono con gli acidi nucleici.

Il primo passo è filtrare la soluzione colorante per rimuovere i cristalli non disciolti. Le diapositive vengono quindi incubate in macchia fino a raggiungere il contrasto desiderato. Quindi, lavare le sezioni in più cambi d'acqua per fermare la colorazione.

Le diapositive vengono poi immerse in una serie di alcool per eliminare la macchia in eccesso e disidratare le fette. Dopo la disidratazione, le fette vengono eliminate con xilene, che rimuove l'alcol e migliora l'imaging poiché ha proprietà di diffrazione della luce simili a quelle del tessuto.

Per preservare le sezioni macchiate per un'analisi successiva, coprire con un mezzo di montaggio permanente e lasciare asciugare durante la notte.

Ora che abbiamo delineato le procedure e gli obiettivi della colorazione, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni.

Prima di tutto, la colorazione istologica viene abitualmente utilizzata per visualizzare i singoli neuroni. A sua volta, la visualizzazione è necessaria per tecniche come la microdissezione a cattura laser, in cui i ricercatori utilizzano un laser per isolare cellule specifiche cresciute su un film sottile. Il materiale genetico può essere estratto dalle cellule colorate e sezionate, consentendo ai ricercatori di studiare l'espressione genica specifica del neurone.

La colorazione può anche essere impiegata per caratterizzare le caratteristiche morfologiche dei singoli neuroni. In questo esperimento, l'immunoistochimica viene eseguita su cellule che esprimono GFP per visualizzare i dendriti che formano sinapsi. La colorazione viene confrontata tra cellule normali e attivate, rivelando che i dendriti subiscono molteplici cambiamenti in risposta agli stimoli attivanti.

Infine, grazie alla specificità dell'IHC, l'espressione di singole proteine può essere utilizzata per identificare la posizione e l'identità di popolazioni cellulari uniche nel sistema nervoso. Ad esempio, la colorazione del cervelletto del topo con anticorpi zebrina 2 rivela la posizione di neuroni specializzati noti come cellule di Purkinje.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla colorazione mirata delle fette di cervello. In questo video abbiamo dimostrato i metodi e gli obiettivi generali della colorazione, oltre a procedure specifiche per la colorazione IHC e Nissl.

Grazie per l'attenzione!