Quantificazione di orofacciale fenotipi in Xenopus

L'obiettivo generale della seguente procedura è quello di descrivere i fenotipi facciali orali degli embrioni di xap Levis in modo statistico quantitativo. Ciò si ottiene montando prima le teste di embrione xip staccate in uno stampo di argilla per la documentazione fotografica utilizzando le immagini. Le dimensioni del viso vengono misurate per fornire informazioni sulle dimensioni della regione facciale orale.

Successivamente, i punti di riferimento vengono applicati tramite morfometria geometrica per valutare la forma della regione facciale orale. I risultati mostrano cambiamenti significativi nelle dimensioni e nella forma della regione facciale dell'opus orale sulla base di analisi statistiche delle dimensioni facciali e della posizione relativa del punto di riferimento. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sullo sviluppo dell'opus o del viso, può essere applicato anche ad altri studi sulla morfologia dei vertebrati, come il confronto di specie strettamente imparentate per scopi evolutivi o ecologici.

Questa sezione illustra come realizzare piatti di argilla per contenere le teste degli embrioni per la loro documentazione fotografica. Per prima cosa, appiattisci un po' di argilla da modellare in un piatto di qualsiasi dimensione e liscialo per coprire l'intero piatto. Quindi premere leggermente un ago da stuzzicante dritto nell'argilla con un angolo di 45 gradi.

Tenere saldamente l'ago e muovere lentamente il piatto per creare una linea depressa. Quindi, usa una pipetta di vetro per fare delle depressioni circolari poco profonde lungo ogni linea. In ogni depressione, una testa dell'embrione può essere posizionata prima del carico.

Le teste riempivano il piatto di PBT. I dettagli sulla coltura del piscio sono delineati nel protocollo del testo, così come i dettagli sulla fissazione degli embrioni. Per questo protocollo, fissare gli embrioni tra gli stadi 42 e 45.Di conseguenza.

Per prima cosa, metti gli embrioni fissati in una piastra di Petri da 150 millimetri contenente circa 100 millilitri di PBT. Ora, tagliate loro la testa. Per prima cosa, tieni un embrione con un paio di pinze e usa un bisturi per praticare un'incisione sul lato posteriore dell'intestino.

In secondo luogo, praticare un'incisione sul lato anteriore dell'intestino vicino al cuore per rimuovere completamente la testa. Utilizzando una pipetta, trasferire le teste nel piatto di argilla. È fondamentale che le teste degli embrioni siano posizionate nell'argilla con lo stesso identico orientamento per la fotografia.

Per garantire il successo, usa le file disegnate nell'argilla come guide. È anche utile se la stessa persona cattura tutte le immagini nello stesso giorno. Per la vista frontale, le fotografie posizionano le teste con il lato posteriore rivolto verso il basso nelle depressioni.

Usa le pinze per manipolare le teste e l'argilla circostante in modo che le teste siano fissate di fronte alla fotocamera e non siano inclinate per la vista laterale. Le fotografie posizionano le teste in modo che i loro lati siano tutti rivolti nella stessa direzione. Manipola le teste e l'argilla circostante, in modo che le ghiandole di cemento siano tutte rivolte verso il basso con la stessa angolazione.

Ora, utilizzando qualsiasi microscopio da dissezione con capacità di acquisizione delle immagini, è possibile raccogliere immagini delle teste dei girini. Utilizzare diverse luci per evitare ombre eccessive e utilizzare l'ingrandimento più alto possibile. Fotografa ogni testa allo stesso modo.

Quindi salva le immagini non compresse e alla massima risoluzione possibile. Dalle immagini, misurare le dimensioni del viso orale. Innanzitutto, determina la larghezza della faccia.

Identifica i punti in cui la parte ventrale di ciascun occhio incontra le periferie del viso e misura la distanza tra questi punti. I dettagli sulla misurazione dell'altezza del viso e dell'area facciale orale sono disponibili nel protocollo di testo. Prestare particolare attenzione alla determinazione della lunghezza del muso Nelle immagini laterali, tracciare una linea verticale che segna la parte anteriore dell'occhio.

Quindi misurare la distanza orizzontale dal punto più anteriore in cui il viso incontra il bordo dorsale della ghiandola cementizia alla linea verticale che segna la parte anteriore dell'occhio. Altre dimensioni come la larghezza della bocca e la rotondità sono spiegate nel protocollo di testo per questa analisi, le coordinate dei punti di riferimento facciali devono essere standardizzate e salvate in un file. I punti di riferimento dovrebbero catturare la forma dell'immagine ed essere utilizzabili in tutte le immagini.

Quindi non utilizzare strutture che potrebbero non esistere in tutti i campioni. Ora apri il primo file immagine. Per valutare, seleziona la scheda dei plug-in sulla barra degli strumenti principale e scegli il selettore di punti.

Dal menu a discesa, seleziona la scheda Aggiungi punti e posiziona i punti di riferimento sull'immagine. Appaiono come multicolori. Le croci passano da un punto di riferimento all'altro utilizzando lo strumento di spostamento delle croci.

Una volta posizionati tutti, selezionare la scheda dei risultati di visualizzazione sulla barra degli strumenti principale e scegliere l'opzione di visualizzazione. Vengono visualizzate le coordinate del punto di riferimento. Quindi, copiare le coordinate in un foglio di calcolo in una riga vuota sopra il tipo di dati incollato LM equals seguito dal numero di punti di riferimento nel campione nella riga sottostante.

Il tipo di dati incollato ID è uguale a seguito dal nome che identifica il campione. Ogni campione deve avere un identificatore univoco. Ripeti questo processo fino a quando tutte le immagini di esempio non sono state mappate e inserite nel foglio di calcolo.

Successivamente, copia le colonne con un esempio di identificazione e coordinate di ciascun punto di riferimento e salvalo in un documento di testo. Quindi apri il programma software morfometrico. In questo software, selezionare crea nuovo set di dati dal menu principale.

Assegna un nome al file e al set di dati nella schermata pop-up e importa il file come TPS. Ora seleziona un file di testo di coordinate per creare il set di dati. Successivamente, eseguire un adattamento e un allineamento della procuste.

Innanzitutto, evidenziare il set di dati nella scheda dell'albero del progetto. Quindi scegli i preliminari sulla barra degli strumenti principale e le nuove procuste si adattano dal menu a discesa. Dalle selezioni disponibili, scegliere Allineato per asse principale.

Quindi seleziona l'opzione per eseguire il fit back di Crusty nel menu a discesa dei preliminari, seleziona genera matrice di Covance e seleziona Esegui. A questo punto, dalla scheda dei risultati, è possibile visualizzare le correlazioni della matrice di Covance. Per distinguere i campioni sperimentali e del gruppo di controllo, creare un file di classificazione assegnando ogni campione nel set di dati alla variabile di classificazione appropriata.

In un foglio di calcolo, crea una colonna con l'etichetta ID e crea una colonna con l'etichetta trattamento. Quindi elenca ogni campione nella colonna ID e assegnalo a un gruppo. Nella colonna del trattamento, salvalo come file di testo e nel software morfometrico, importalo tramite l'opzione scegli corrispondenza per identificatore.

Nella scheda di confronto, creare una trasformazione dell'analisi della funzione discriminante nel menu a comparsa. In questa funzione, assicurarsi che sia selezionato il set di dati appropriato e che il tipo di dati sia le coordinate di adattamento della procuste. Evidenziare le coppie di gruppi da confrontare e quindi eseguire un test di 1000 permutazioni.

Per visualizzare la mappa vettoriale delle coordinate, vai al menu grafici e seleziona la scheda differenza di forma. Se l'immagine è invertita, visualizzare il menu a comparsa nell'area di stampa per capovolgere il diagramma nell'orientamento corretto. Inoltre, nel menu a comparsa, modificare il grafico in una griglia di trasformazione per sovrapporre i vettori a una griglia con dettagli sulla creazione di un'analisi dei componenti principali.

Analisi dei componenti del principio del grafico a dispersione. Le griglie di trasformazione CVA, scatterplot e CVA sono tutte fornite nel protocollo di testo. Gli embrioni sono stati trattati con un recettore micromolare dell'acido retinoico o inibitore RAR dallo stadio 24 allo stadio 30, quindi fissati allo stadio 42 e fotografati gli embrioni di controllo trattati con DMSO sviluppati.

Normalmente, il trattamento con inibitore RAR ha provocato un restringimento del viso, anomalie oculari e una bocca di forma triangolare malformata. Dopo aver eseguito un'analisi morfometrica geometrica, la varianza è stata valutata tramite l'analisi delle componenti principali. Gli embrioni trattati sono stati chiaramente distinti dai controlli.

Lungo l'asse PC uno, le frecce identificano i valori anomali statistici all'interno di un gruppo. Le differenze morfologiche sono state successivamente valutate mediante un'analisi della funzione discriminante. Cambiamenti drammatici nella posizione dei punti di riferimento laterali indicano un restringimento della forma del viso.

Un leggero spostamento verso l'esterno della posizione delle narici è notato dalle frecce. C'è anche una notevole deformazione nella regione centrale della faccia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare una combinazione di misure di dimensioni tradizionali e morfometria geometrica per valutare le dimensioni e la forma del viso embrionale di Theus.