Name: Quantificazione di orofacciale fenotipi in Xenopus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Impara a quantificare i fenotipi orofacciali in Xenopus laevis combinando misurazioni dimensionali tradizionali con morfometria geometrica. Questo metodo consente analisi sofisticate dello sviluppo facciale e dei difetti congeniti.

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Fondi di start-up di A. Dickinson da VCU sostenuto questo lavoro. Gli autori desiderano ringraziare Dan Nacu per il suo talento artistico nel creare la rappresentazione schematica.

<ol><li>Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleft+lip+and+palate%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cleft lip and palate.</a> Lancet. 374, 1773-1785 (2009).</li>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Xenopus laevis è diventato uno strumento utile per sezionare i meccanismi di sviluppo di sviluppo oro-facciale sottostante; tuttavia, attualmente non esistono protocolli che descrivono dimensioni e la forma cambiamenti di questa regione in rane. Il metodo qui descritto contribuirà in modo significativo al settore dello sviluppo oro-facciale, consentendo per la più rigorosa quantificazione dei fenotipi orofacciali in Xenopus e altri vertebrati. Il primo aspetto, più critico ...

Tra i tipi più diffusi e devastanti di difetti alla nascita dell&#39;uomo sono quelli che riguardano la bocca e la faccia, come la schisi orofacciali 1. I bambini con strutture orofacciali malformati sottoposti a interventi chirurgici multipli per tutta la vita e lottano con malformazioni del viso, discorso, dell&#39;udito e problemi alimentari. Pertanto, facilitando nuove ricerche nello sviluppo cranio-oro-facciale ed è fondamentale per la prevenzione e il trattamento di questi tipi di difetti alla nascita negli esseri umani. Xenopus laevis è emerso come un nuovo strumento per sezionare i meccanismi che regolano lo sviluppo cranio-facciale (alcuni esempi includono 2,3,4 -11). Pertanto, un metodo quantitativo per analizzare dimensione e forma cambia durante lo sviluppo della testa e del viso di questa specie potrebbe essere molto potente 3. Qui vi presentiamo un tale metodo; Combinando le misurazioni tradizionali dimensioni con morfometria geometrica adattati da uno studio di Xenopus 12 </sup&gt; e un gran numero di studi che hanno analizzato forma del viso umano 13-15. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di permettere ai ricercatori di quantificare le dimensioni e le forme del viso per distinguere tra diversi fenotipi orofacciali durante lo sviluppo normale e anormale. Questa analisi consentirà una migliore differenziazione tra i difetti cranio-facciali sottili, come quelli derivanti da effetti sinergici di geni e / o fattori ambientali. Inoltre, questo metodo di quantificazione potrebbe anche rivelare anche lieve miglioramento o al salvataggio di un difetto oro-facciale. Questo rende quindi una guida utile per analizzare potenziali terapie. La combinazione di misurazioni facciali e morfometria geometrica che qui presentiamo consente un&#39;analisi statistica più completa di dimensioni e la forma della regione orofacciale di protocolli attuali che in gran parte utilizzano solo uno o l&#39;altro 15-18. Inoltre, presentiamo un modo semplice per valutare sia mediale e piani lateraliil volto senza bisogno di sofisticate apparecchiature di imaging tridimensionale utilizzata in studi attuali 13,19. Dimostriamo questo protocollo su Xenopus laevis embrioni trattati con un inibitore del recettore dell&#39;acido retinoico che induce lo sviluppo oro-facciale anormale e una mediana palatoschisi 2,3. La quantificazione delle dimensioni e la forma della regione oro-facciale in questi embrioni ha rivelato cambiamenti nella midface che è analogo per l&#39;uomo con crepacci palatali simili e modelli murini 20,21. Tuttavia, questo protocollo può essere utilizzato per valutare gli effetti di altri composti sullo sviluppo oro-facciale, quali sostanze naturali, erbicidi, o proteine ​​come i fattori di crescita. Inoltre, le dimensioni e la forma cambia orofacciali derivanti dalla perturbazione di espressione genica tramite la perdita o il guadagno di esperimenti di funzione (utilizzando Morpholinos antisenso o Crispers / Talens) possono essere quantificati con questo protocollo. Infine, abbiamo sviluppato questo metodo SPECIFICHElly per valutare la morfologia Xenopus; tuttavia, è facilmente modificato per l&#39;analisi di qualsiasi vertebrato. Altre applicazioni potrebbero anche includere l&#39;uso di questo protocollo per il confronto di specie strettamente collegate agli studi evolutivi o ecologici. Mentre l&#39;esempio forniamo qui utilizza questo protocollo per descrivere l&#39;analisi della regione oro-facciale, potrebbe facilmente essere modificato per l&#39;analisi di altre regioni, organi o strutture. Questo protocollo quantificazione oro-facciale diventerà una risorsa preziosa per la comunità di ricerca, così come un eccellente strumento didattico per gli studenti universitari come un video dimostrativo.

<table><tbody><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Zeiss dotato di</td><td></td><td>telecamera AxioCamICC1</td></tr><tr><td>Pinze Dumont #5 Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi sterile monouso</td><td>Sklar</td><td>06-2015</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>087721</td><td></td></tr><tr><td>Standard Pipette di trasferimento monouso</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri da 150 mm x 15 mm</td><td>Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>Incubatori</td><td>Ectotermico</td><td></td><td>impostato su 15 &deg; C o 20 gradi C</td></tr><tr><td>Argilla da modellare</td><td>Premo, o altra argilla</td><td></td> da modellare non tossica <td>in bianco o nero</td></tr><tr><td>Ago da taglio dritto</td><td>Thermo Scientific</td><td>19010</td><td></td></tr><tr><td>Tubo capillare (per aghi)</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>Borosil 1,0 mm OD x 0,5 mm ID/Fibra, 100 mm ciascuno</td></tr><tr><td>Estrattore per aghi, Modello P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Estrattore per ago: P-97 Flaming/ Bown estrattore per micropipette Filamento: FB300B</td><td>Per i filamenti, utilizzare filamenti Sutter da 3,00 mm quadrati a scatola, larghi 3,0 mm.</td></tr><tr><td>Pipettemen</td><td>Gilson</td><td>F144802, F123600, F123602</td><td></td></tr><tr><td>BMS-453</td><td>Tocris</td><td>3409</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435-01000</td><td></td></tr><tr><td>Cisteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52-90-4</td><td></td></tr><tr><td>Polvere di paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>piastre di Petri</td><td>Falcom</td><td>353003, 351058</td><td>100 mm di diametro e 150 mm di diametro</td></tr><tr><td>100% etanolo</td><td>VWR</td><td>89125-170</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificazione di orofacciale fenotipi in xenopus

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus è diventato uno strumento importante per sezionare i meccanismi che regolano lo sviluppo cranio-facciale e difetti. Un metodo per quantificare lo sviluppo oro-facciale consentirà un&#39;analisi più rigorosa dei fenotipi orofacciali su abrogazione con sostanze che possono geneticamente o molecolarmente manipolare l&#39;espressione genica e la funzione delle proteine. Utilizzando due immagini tridimensionali delle teste embrionali, si misurano le dimensioni-come tradizionali dimensioni come larghezza oro-facciale, altezza e Area-. Inoltre, una misura rotondità della apertura della bocca embrionale è usato per descrivere la forma della bocca. Morfometria geometrica di queste due immagini tridimensionali viene eseguita anche per fornire una visione più sofisticata di cambiamenti nella forma della regione oro-facciale. Luoghi di interesse sono assegnati a punti specifici della regione oro-facciale e le coordinate vengono creati. Una analisi delle componenti principio viene utilizzato per ridurre le coordinate punto di riferimento ai componenti principali che poi discriminano il trattamentogruppi. Questi risultati sono visualizzati sotto forma di un diagramma a dispersione in cui gli individui con forme oro-facciali simili si raggruppano. E &#39;utile anche per eseguire un&#39;analisi funzione discriminante, che mette a confronto statisticamente le posizioni dei punti di riferimento tra i due gruppi di trattamento. Questa analisi viene visualizzato su una griglia di trasformazione in cui i cambiamenti della posizione di riferimento sono visti come vettori. Una griglia viene sovrapposta questi vettori in modo che un modello di deformazione viene visualizzato per mostrare dove posizioni significative punto di riferimento sono cambiati. Cambia forma per l&#39;analisi della funzione discriminante si basano su una misura statistica, e quindi possono essere valutati da un p-value. Questa analisi è semplice e accessibile, che richiede solo uno stereoscopio e software freeware, e quindi sarà una risorsa per la ricerca e l&#39;insegnamento prezioso.

Qui, un'analisi quantitativa di dimensioni oro-facciale e la forma è stata dimostrata per confrontare embrioni trattati con un inibitore del recettore dell'acido retinoico (RAR inibitore) per controlli non trattati. Gli embrioni sono stati trattati con una concentrazione 1 mM di questo inibitore della sostanza chimica da fase 24 a 30 (26-35 HPF), sbiaditi, e fissati allo stadio 42 (82 HPF). Sono stati poi elaborati ed analizzati come descritto nel protocollo. I risultati sono dati originali, ma in linea con le osservazi...

È stato sviluppato un metodo per quantificare l&#39;entità oro-facciale e la forma di Xenopus laevis embrioni. In questo protocollo, misurazioni tradizionali sono unite a morfometria geometrica per consentire analisi più sofisticate di sviluppo oro-facciale e difetti.

Quantificazione di orofacciale fenotipi in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

L'obiettivo generale della seguente procedura è quello di descrivere i fenotipi facciali orali degli embrioni di xap Levis in modo statistico quantitativo. Ciò si ottiene montando prima le teste di embrione xip staccate in uno stampo di argilla per la documentazione fotografica utilizzando le immagini. Le dimensioni del viso vengono misurate per fornire informazioni sulle dimensioni della regione facciale orale.Successivamente, i punti di riferimento vengono applicati tramite morfometria geometrica per valutare la forma della regione facciale orale. I risultati mostrano cambiamenti significativi nelle dimensioni e nella forma della regione facciale dell'opus orale sulla base di analisi statistiche delle dimensioni facciali e della posizione relativa del punto di riferimento. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sullo sviluppo dell'opus o del viso, può essere applicato anche ad altri studi sulla morfologia dei vertebrati, come il confronto di specie strettamente imparentate per scopi evolutivi o ecologici.Questa sezione illustra come realizzare piatti di argilla per contenere le teste degli embrioni per la loro documentazione fotografica. Per prima cosa, appiattisci un p

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Xenopus embrionale epiteli sono un sistema modello ideale per studiare i comportamenti delle cellule, come lo sviluppo di polarità e cambiare forma durante la morfogenesi epiteliale. Istologia tradizionale di campioni fisso è sempre più integrato da live-cell imaging confocale. Qui mostriamo metodi per isolare i tessuti rana e visualizzare dal vivo le cellule epiteliali e le loro citoscheletro con live-cell microscopia confocale.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Cartilagini craniofacciali sviluppare a stretto contatto con altri tessuti e sono difficili da manipolare di animali vivi. Stiamo usando elettroporazione per fornire strumenti molecolari durante la crescita dello scheletro cranio-facciale, mentre bypassando primi effetti embrionale. Questo approccio ci permetterà di testare in modo efficiente molecole...

Elettroporazione di Mesenchima craniofacciale

Una tecnica per il trapianto "Extreme anteriore dominio" dei tessuti del viso tra Xenopus laevis embrioni è stato sviluppato. Tessuto può essere spostato da un gene espressione sfondo in un'altra, permettendo lo studio delle esigenze locali di sviluppo craniofacciale e di segnalazione interazioni tra regioni facciali.

Trapianti viso a<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni

Negli embrioni di Xenopus, le cellule del tetto del blastocele sono pluripotenti e possono essere programmate per generare vari tessuti. Qui, descriviamo i protocolli per utilizzare gli espianti di tetti di blastocele di anfibi come sistema di analisi per studiare le caratteristiche chiave in vivo e in vitro dello sviluppo neurale precoce.

Cellule staminali simil-<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionali espianti di studiare Caratteristiche precoce dello sviluppo neurale<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Questo protocollo dimostra un metodo basato su fluorescenza per visualizzare la vascolarizzazione e per quantificare la sua complessità in Xenopus tropicalis . I vasi sanguigni possono essere immagazzinati minuti dopo l'iniezione di un colorante fluorescente nel cuore battente di un embrione dopo manipolazioni genetiche e / o farmacologiche per studiare lo sviluppo cardiovascolare in vivo .

Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Girini di Xenopus offrono una piattaforma unica per studiare la funzione del sistema nervoso in vivo. Descriviamo le metodologie per valutare l'elaborazione di informazioni olfattive in vita Xenopus larve in normali condizioni di allevamento o dopo la ferita.

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I regolatori delle funzioni dei melanociti governano le differenze visibili nel risultato della pigmentazione. Decifrare la funzione molecolare del gene candidato della pigmentazione rappresenta una sfida. Qui, dimostriamo l'uso di un sistema modello di zebrafish per identificare i candidati e classificarli in regolatori del contenuto di melanina e del numero di melanociti.

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Il sistema oculare Drosophila è uno strumento utile per studiare vari processi biologici, in particolare le malattie neurodegenerative umane. Tuttavia, la quantificazione manuale dei fenotipi dell'occhio ruvido può essere distorta e inaffidabile. Qui descriviamo un metodo con cui ilastik e Flynotyper vengono utilizzati per quantificare il fenotipo dell'occhio in modo imparziale.

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Questo lavoro descrive un protocollo per quantificare la forma della cartilagine craniofacciale utilizzando software liberi (tpsDigs2, MorphoJ e PAST) per misurare i cambiamenti nella struttura facciale nelle larve di pesce zebra.

Analisi morfometriche della forma: il software di analisi per la quantificazione della forma craniofacciale nel pesce zebra

Impara a quantificare i fenotipi orofacciali in Xenopus laevis combinando misurazioni dimensionali tradizionali con morfometria geometrica. Questo metodo consente analisi sofisticate dello sviluppo facciale e dei difetti congeniti.

Quantificazione di orofacciale fenotipi in Xenopus

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