Viral Determinazione Concentrazione Attraverso placca saggi: Sistemi overlay per mezzo di tradizionali e nuovi

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la concentrazione virale attraverso la quantificazione di virioni infettivi contando le placche distinte in coltura cellulare. Questo viene ottenuto innanzitutto seminando le cellule per formare un monostrato confluenziale da infettare. Il secondo passaggio consiste nell'eseguire diluizioni seriali del campione virale sconosciuto da quantificare. Successivamente, i monostrati confluenti vengono infettati utilizzando le diluizioni seriali del ceppo virale, seguite dall'applicazione di un rivestimento immobilizzante. L'ultimo passaggio prevede la fissazione e la colorazione delle placche dopo il tempo di incubazione appropriato per il virus in esame, al fine di contare le placche distinte. In definitiva, i saggi delle placche possono essere utilizzati e modificati in diversi modi per determinare i titoli virali di un campione virale sconosciuto.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il sovraspessore semisolido, è che l'applicazione e la rimozione sono molto più semplici sia nelle applicazioni ad alto rendimento che in quelle tradizionali. Inoltre, non è richiesto il riscaldamento dei reagenti. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla ricerca di molti diversi virus litici, poiché l'uso di un sovraspessore liquido in formato a 96 pozzetti permette lo screening rapido di nuovi composti terapeutici, riducendo notevolmente le lunghe ore trascorse in laboratorio nell'esecuzione di saggi tradizionali delle placche.

Il giorno precedente il saggio, seminare le cellule appropriate per il virus in questione in modo da ottenere una confluenza del 90-100% nel giorno dell'infezione. Le soluzioni stock possono essere preparate anche il giorno prima del saggio. Preparare innanzitutto una soluzione fissante al 10% di formaldeide in acqua distillata, mescolando 5,56 millilitri di formaldeide al 36% con 14,44 millilitri di acqua distillata. Successivamente, preparare la soluzione di violetto di cristallo costituita dal 1% di violetto di cristallo in etanolo al 20%, diluita con acqua distillata. Quindi, lavorando in condizioni sterili, preparare il mezzo di piastramento 2x appropriato per il tipo di cellule utilizzate. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 micron se uno dei reagenti non è sterile. Per preparare un sovraspalmabile liquido da utilizzare nel saggio delle placche, aggiungere 2,4 grammi di Avicel a un matraccio contenente 97,6 millilitri di acqua distillata che si sta mescolando rapidamente con una barretta magnetica. Mescolare la soluzione a temperatura ambiente finché non diventa troppo viscosa per la barretta magnetica. A questo punto, trasferire il matraccio su un agitatore orbitale e agitare vigorosamente per 30 minuti per garantire un'omogeneizzazione uniforme. Infine, sterilizzare in autoclave la soluzione a 121 gradi Celsius e 14 PSI per 30 minuti.

E una volta terminato il programma, conservare sigillato a temperatura ambiente. Per un rivestimento in agarosio, preparare una soluzione madre di agarosio allo 0,6% in acqua distillata, mescolare con una barretta magnetica e sterilizzare in autoclave per portare in soluzione. Per un rivestimento in carbossimetilcellulosa, preparare una soluzione di carbossimetilcellulosa al 2% in acqua distillata e mescolare. Quindi sterilizzare in autoclave come in precedenza.

Il giorno successivo alla semina, utilizzare un microscopio invertito per verificare la confluenza e la vitalità delle cellule prima di iniziare il saggio. Assicurarsi che le cellule presentino una morfologia cellulare standard e una confluenza di circa il 90%.

Eseguire una diluizione seriale decimale dei campioni infetti nel mezzo di crescita cellulare, variando il numero di diluizioni necessarie in base al titolo atteso del virus in esame. Inoltre, preparare un campione di controllo non infetto per verificare in modo indipendente la vitalità cellulare e facilitare l'identificazione delle placche. Pipettare il controllo non infetto e le diluizioni seriali nei pozzetti della piastra, avendo cura di non disturbare lo strato monocellulare.

Utilizzare un volume sufficiente di inoculo per coprire le cellule, mantenendo al contempo il volume il più basso possibile per massimizzare il contatto del virus con il monostrato cellulare. Posizionare le piastre nell'incubatore per colture cellulari e infettare le cellule per un periodo compreso tra 45 minuti e un'ora. Ogni 20 minuti agitare delicatamente le piastre per garantire una distribuzione uniforme e prevenire l'essiccamento del monostrato cellulare.

Durante l'infezione, preparare la soluzione di lavoro per i rivestimenti liquidi. Mescolare in rapporto uno a uno il mezzo per placche riscaldato e l'Avicel Stock al 1,2-2,4% a temperatura ambiente, ottenendo una soluzione di lavoro con un mezzo di rivestimento all'0,6-1,2% di Avicel. Per i rivestimenti in agarosio o CMC, mescolare in rapporto uno a uno il mezzo per placche riscaldato e una soluzione stock di agarosio allo 0,6% riscaldato o di CMC al 2%. Successivamente, collocare la miscela in un bagno a 56 gradi Celsius per 30 minuti per l'equilibrazione termica. Assicurarsi che la soluzione sia calda ma non bollente al tatto, per evitare la morte cellulare e una riduzione dei titoli virali. Dopo l'infezione, applicare i rivestimenti sui monolayer infetti. Dopo l'aggiunta del rivestimento, incubare le piastre a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per due fino a 14 giorni, a seconda del virus in analisi.

Per fissare le cellule con un sovrastrato liquido, versare via o aspirare il sovrastrato di Avicel, quindi pipettare la soluzione di formaldeide al 10% nei pozzetti e fissare a temperatura ambiente per 30 minuti fino a tutta la notte. Per l'agarosio o il CMC, aggiungere direttamente la soluzione di formaldeide al sovrastrato per un'ora fino a tutta la notte a temperatura ambiente. Dopo la fissazione, scartare la formaldeide e quindi rimuovere manualmente i tappi semisolidi dall'agarosio con la spatola.

Risciacquare le placche cellulari di Avicel con acqua per rimuovere il fissativo in eccesso prima della colorazione.

Per la colorazione, coprire le cellule con una quantità minima di soluzione di violetto cristallo per circa 15 minuti. Agitare delicatamente le piastre, se necessario, per garantire una copertura uniforme. Rimuovere delicatamente il colorante violetto cristallo con acqua. Una volta fissate, colorate e asciutte, conservare le placche indefinitamente per analisi future. Contare le placche in ciascun pozzetto escludendo i pozzetti con meno di cinque o più di 100 placche. Calcolare la media per eventuali replicati tecnici della stessa diluizione. Prendere nota della dimensione e della morfologia delle placche. Determinare il titolo virale del campione iniziale prendendo il numero medio di placche per una determinata diluizione e l'inverso del fattore di diluizione totale.

Questa immagine mostra confronti tra sovrapposizioni di placche del virus della febbre del Rift Valley, utilizzando piastre a 12 pozzetti. Le cellule Veros sono state seminate a 2,5 volte 10 alla quinta cellule in piastre a 12 pozzetti e infettate con 200 microlitri utilizzando lo stesso campione iniziale diluito in serie del ceppo MP 12. Dopo l'infezione, sono state applicate sovrapposizioni di 1,5 millilitro costituite da agarosio allo 0,3%, Avicel allo 0,6% o CMC all'1% per confrontare direttamente le diverse sovrapposizioni. Questo istogramma mostra i risultati del conteggio delle placche e della titolazione per tutti e tre i tipi di sovrapposizione. Qui vengono mostrati i confronti tra sovrapposizioni di placche del virus VEEV utilizzando piastre a 12 pozzetti. Le cellule Veros sono state seminate come in precedenza e infettate con un volume di 200 microlitri, utilizzando lo stesso campione iniziale diluito in serie del ceppo vaccinale VEEV-TC 83; dopo l'infezione, sono state applicate sovrapposizioni di 1,5 millilitro di agarosio allo 0,3%, Avicel allo 0,6% o CMC all'1% come in precedenza.

Anche in questo caso, l'istogramma mostra i risultati del conteggio delle placche e della titolazione per tutti e tre i sovrastrati. Questa immagine mostra un esempio di sovrastrati per analisi ad alto rendimento. Una piastra a 96 pozzetti di cellule Veros seminate a tre volte 10 alla quarta cellule per pozzetto è stata infettata con 50 microlitri di inoculo utilizzando lo stesso campione iniziale di virus della febbre del Rift Valley MP 12 diluito in serie, per un'ora e in quadruplicato. Per i sovrastrati, sono state testate concentrazioni finali dello 0,6 e dell'1,2% di Avicel cell al fine di determinare la fattibilità e la riproducibilità dell'utilizzo di sovrastrati liquidi in maniera ad alto rendimento. Questo istogramma mostra i titoli determinati da ciascun sovrastrato.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che ogni virus è diverso e potrebbero essere necessarie ottimizzazioni, come l'utilizzo di diversi tipi cellulari, tempi di incubazione e/o mezzi di crescita. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un saggio di placche di base utilizzando sia sovrastrati liquidi che semisolidi.