Viral Determinazione Concentrazione Attraverso placca saggi: Sistemi overlay per mezzo di tradizionali e nuovi

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la concentrazione virale attraverso la quantificazione della variazione infettiva contando placche discrete in coltura cellulare. Ciò si ottiene prima placcando le cellule per formare un monostrato confluente per l'infezione. Il secondo passo consiste nell'eseguire la diluizione seriale del campione virale sconosciuto da quantificare.

Successivamente, i monostrati confluenti vengono infettati utilizzando la diluizione seriale del ceppo virale, seguita dall'applicazione di un rivestimento immobilizzante. Il passaggio finale consiste nel fissare e colorare le placche dopo il tempo di incubazione appropriato per il virus in questione, al fine di contare le placche discrete. In definitiva, i saggi di placca possono essere utilizzati e modificati in diversi modi per determinare i titoli virali di un campione virale sconosciuto.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il rivestimento semisolido, è che l'applicazione e la rimozione sono molto più semplici sia nelle applicazioni ad alta produttività che in quelle tradizionali. Inoltre, non è necessario riscaldare i reagenti. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla ricerca di molti virus litici diversi come l'uso di un rivestimento liquido.

In un formato a 96 pozzetti consente lo screening rapido di nuovi composti terapeutici, che possono ridurre notevolmente le lunghe ore trascorse in laboratorio eseguendo saggi tradizionali su placca Il giorno prima della piastra di analisi, le cellule appropriate per il virus in questione al fine di raggiungere dal 90 al 100% di fluenza il giorno dell'infezione. Le soluzioni madre possono anche essere preparate il giorno prima del saggio, preparare prima una soluzione di fissaggio del 10% di formaldeide in acqua distillata mescolando 5,56 millilitri di formaldeide stock al 36% con 14,44 millilitri di acqua distillata. Preparare quindi la colorazione cristallovioletta composta dall'1% di cristallovioletto in etanolo al 20% diluito con acqua distillata.

Successivamente, mentre si lavora in condizioni sterili, preparare i due mezzi di placca appropriati per il tipo di cellule utilizzate. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 micron se uno qualsiasi dei reagenti non è sterile. Per preparare una sovrapposizione liquida da utilizzare nel saggio della placca a 2,4 grammi di cellula avy su un pallone contenente 97,6 millilitri di acqua distillata che si mescola rapidamente con una barra di agitazione.

Mescolare la soluzione a temperatura ambiente fino a quando non diventa troppo viscosa per l'ancoretta di combustione. A questo punto, trasferire il pallone in uno scuotitore e agitare fortemente per 30 minuti per garantire un'omogeneizzazione uniforme. Infine, sterilizzare in autoclave la soluzione a 121 gradi Celsius a 14 PSI per 30 minuti.

E quando il programma è terminato, conservare sigillato a temperatura ambiente per una sovrapposizione di aros. Preparare una soluzione madre agro allo 0,6% in acqua distillata. Mescolare con un'ancoretta e un'autoclave per portare in soluzione o un rivestimento di carbossimetilcellulosa.

Preparare una soluzione di metilcellulosa carbossilare al 2% in acqua distillata e mescolare in autoclave come prima del giorno dopo la placcatura. Utilizzare un microscopio invertito per verificare la cofluenza e la vitalità delle cellule prima di iniziare il saggio. Assicurarsi che le cellule mostrino una morfologia cellulare standard e circa il 90% di fluenza.

Eseguire una diluizione seriale di dieci volte dei campioni infettivi nei terreni di crescita cellulare, variando il numero di diluizione richiesto in base al titolo atteso del virus in questione. Inoltre, preparare un campione di controllo non infetto per garantire in modo indipendente la vitalità cellulare e facilitare l'identificazione della placca. Pipettare il controllo non infetto e la diluizione seriale nei pozzetti della piastra, facendo attenzione a non interrompere il monostrato.

Utilizzare un volume sufficiente di inoculo per coprire le cellule mantenendo il volume il più basso possibile per massimizzare il contatto virale con il monostrato. Mettere le piastre nell'incubatore di coltura tissutale e infettare le cellule per 45 minuti a un'ora ogni 20 minuti. Scuotere delicatamente le placche per garantire una copertura uniforme ed evitare che il monostrato cellulare si secchi durante l'infezione.

Preparare la soluzione di lavoro per le sovrapposizioni liquide. Miscelare il terreno di placca riscaldato e la cella madre a temperatura ambiente dall'1,2 al 2,4% in un rapporto uno-a-uno per ottenere una soluzione di lavoro di terreno di sovrapposizione di cellule avy dallo 0,6 all'1,2% o di terreni di placca riscaldati misti AROS o CMC e una soluzione stock di 0,6% AROS o 2% CMC riscaldato in un rapporto uno a uno. Quindi mettere a bagnomaria a 56 gradi Celsius, 30 minuti per l'equilibrio della temperatura.

Assicurarsi che la soluzione sia calda ma non calda al tatto per prevenire la morte cellulare e la riduzione dei titoli virali. Dopo l'infezione, applicare le sovrapposizioni sui monostrati infetti dopo l'aggiunta della sovrapposizione Incubare le piastre a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per due o 14 giorni a seconda del virus analizzato per fissare le cellule con una sovrapposizione liquida, versare o aspirare la sovrapposizione di cellule e, quindi pipettare la soluzione di formaldeide al 10% nei pozzetti e fissare a temperatura ambiente per 30 minuti per una notte o aros o CMC direttamente. Aggiungere la soluzione di formaldeide al rivestimento per un'ora o una notte a temperatura ambiente dopo la fissazione, scartare la formaldeide e quindi rimuovere manualmente i tappi semisolidi dove si trova la spatola.

Sciacquare le placche delle cellule aby con acqua per rimuovere il fissativo residuo prima della colorazione. Per colorare, coprire le cellule con una quantità minima di soluzione di cristallovioletto per circa 15 minuti. Scuoti le piastre se necessario per garantire una copertura uniforme.

Lavare delicatamente la macchia di cristallovioletto con acqua una volta fissata, colorata e asciugata, conservare il plex a tempo indeterminato per analisi future. Conta le placche in ogni pozzo escludendo i pozzetti con meno di cinque o più di 100 placche. Prendi la media per tutte le repliche tecniche della stessa diluizione.

Prendi nota delle dimensioni e della morfologia della placca. Determinare il titolo virale del campione stock prendendo il numero medio di placche per una diluizione e l'inverso del fattore di diluizione totale. Questa immagine mostra i confronti di sovrapposizione della placca virale della febbre della Rift Valley utilizzando piastre a 12 pozzetti: i bureau sono stati placcati a 2,5 volte 10 delle quinte cellule in piastre a 12 pozzetti e infettati con 200 microlitri utilizzando lo stesso campione iniziale diluito in serie di MP 12.

Dopo l'infezione, sono state applicate sovrapposizioni da 1,5 millilitri di 0,3% di abus, 0,6% AVY o 1% di CMC per confrontare direttamente le sovrapposizioni. Questo istogramma mostra i risultati della conta delle placche e del tittering per tutte e tre le sovrapposizioni. Qui. I confronti di sovrapposizione di placche ViiV utilizzando piastre a 12 pozzetti sono stati mostrati come prima e infettati con un volume di 200 microlitri utilizzando lo stesso campione iniziale diluito in serie del ceppo vaccinale ViiV TC 83 dopo l'infezione, sono state applicate sovrapposizioni da 1,5 millilitri di 0,3% di cellule ave allo 0,6% o all'1% di CMC come prima.

Anche in questo caso, l'istogramma mostra i risultati della conta delle placche e della titolazione per tutte e tre le sovrapposizioni. Questa immagine mostra un esempio di sovrapposizioni di placche ad alta produttività. Una piastra da 96 pozzetti di VIR piastrata a tre volte 10 delle quarte cellule per pozzetto è stata infettata con 50 microlitri di inoculo utilizzando lo stesso campione iniziale diluito in serie del virus della febbre della Rift Valley MP 12 per un'ora in duplicato quadruplo per le sovrapposizioni 0,6 e 1,2% Le concentrazioni finali di cellule avy sono state testate al fine di determinare la fattibilità e la riproducibilità dell'utilizzo di sovrapposizioni liquide in modo ad alta produttività.

Questo istogramma mostra i titoli determinati da ciascuna sovrapposizione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che ogni virus è diverso e che potrebbero essere necessarie ottimizzazioni, tra cui l'utilizzo di diversi tipi di cellule, tempi di incubazione e/o terreno di crescita. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un saggio di base della placca utilizzando sovrapposizioni sia liquide che semisolide.