Name: Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Evento in acqua per la cultura e RT-qPCR. I. Raccolta di campioni di virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Scopri il campionamento standardizzato di enterovirus e norovirus in acque ambientali e potabili con il metodo EPA 1615. Impara a usare filtri elettropositivi per la concentrazione virale e garantire risultati accurati.

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Gli autori ringraziano numerosi personale EPA cui contributi reso il monitoraggio effettuato durante la ICR e UCMR3 possibile, i seguenti investigatori principali di altri studi EPA riportati: Daniel Dahling, Alfred Dufour, Andrey Egorov, Susan Glassmeyer, Asja Korajkic, Richard Lieberman, Robert Safferman, e Tim Wade; e Shannon Griffin e Michael Ware per revisione critica di questo manoscritto. Gli autori ringraziano i Water Works Indian Hill per l&#39;utilizzo di una delle loro case pompa per dimostrare la raccolta del campione. Anche se questo lavoro è stata valutata da USEPA e approvato per la pubblicazione, è possibile che non riflettono necessariamente la politica ufficiale dell&#39;Agenzia. Menzione di nomi commerciali o prodotti commerciali non costituisce approvazione o raccomandazione per l&#39;uso.

1. Procedure preliminari <ol><li> Montare un apparecchio filtro standard come mostrato in Figura 1 costituito da un modulo di aspirazione, un modulo contenitore della cartuccia, e un modulo di scarico come descritto in Materiali Supplementari. </li><li> Calibrare il flusso metro / totalizzatore alle portate utilizzati per il campionamento prima del primo utilizzo. Controllare la calibrazione dopo il primo uso e dopo un mese di utilizzo. Se la calibrazione portata è cambiato dopo o il primo utilizzo o dopo il primo mese di utilizzo, determinare la frequenza dei controlli di taratura come descritto in Materiali Supplementari. <ol><li> Collegare un modulo di scarico di un modulo di aspirazione e quindi collegare il modulo di alimentazione ad un rubinetto. Impostare il flusso meter / totalizzatore per leggere la portata. Aprire il rubinetto completamente e poi regolare la portata di 10 l / min con la valvola di bronzo globo. Una volta che il flusso è stabile a 10 L / min, azzerare il flusso meter / totalizzatore leggere volume totale. </li><li> Posizionare il outrilasciare il modulo di scarica in un 4 L o superiore cilindro graduato e contemporaneamente azzerare il contatore a zero. Misurare la lettura totalizzatore al segno 4-L e il tempo necessario per raggiungere il simbolo 4 L sul cilindro. Modificare l&#39;impostazione torna alla portata del flusso metro / totalizzatore. NOTA: Se la portata era sceso al di sotto di 9.95 L o aumentato a più di 10.05 L dopo aver completato Passo 1.2.2, attendere che la portata è stabile e ripetere il punto 1.2.2. Un contatore tarato correttamente raggiungerà il segno 4 L sul cilindro graduato a 24 ± 1 sec con una lettura di 4,0 ± totalizzatore 0,04 L. </li><li> Se la lettura totalizzatore è inferiore o superiore a 3.96 4.04 L, calcolare un fattore di correzione necessario per regolare la differenza osservata. Ad esempio, se il flusso meter / totalizzatore legge 3,9 L al simbolo 4 L sul cilindro graduato, il fattore di correzione sarebbe 1.026 (4 ÷ 3.9). Così, se il volume desiderato di un campione campo erano 300 L, il volume raccolto secondo la reading sul flusso metro / totalizzatore dovrebbe essere di 300 ÷ 1.026 = 292,4 L. </li></ol></li><li> Sterilizzare l&#39;apparato filtro standard e prepararlo per la raccolta del campione. <ol><li> Sterilizzare aspirazione e cartuccia moduli abitativi con 0,525% di ipoclorito di sodio per almeno 30 minuti prima di ogni utilizzo immergendo o completamente i moduli nelle soluzioni o facendo circolare l&#39;ipoclorito di sodio se i moduli con una pompa. Risciacquare i moduli con dH 2 O sterile e poi declorare in una soluzione contenente 50 ml di 1 M di sodio tiosolfato per litro di acqua distillata sterile per 5 min. Coprire il modulo dell&#39;apparato campionamento filtro si conclude con un foglio di alluminio sterile. </li><li> Aggiungere un filtro a cartuccia elettropositivo al asettico modulo di contenitore della cartuccia. NOTA: Fare attenzione che il filtro cartuccia sia inserito correttamente nelle sedi. Correttamente filtri seduti non perdere e il filtro non si muoveranno all&#39;interno dell&#39;alloggiamento volta agitato. Le guarnizioni aproperly filtro seduta avrà rientranze visibili mostrano dove i contatti filtrarli. Le guarnizioni devono sempre essere controllati per rientranze immediatamente dopo il filtro viene rimosso dalla custodia. </li><li> Registrare un numero unico campione su un foglio dati di esempio (vedi Materiali supplementari per un esempio) e poi prendere o spedire l&#39;apparecchio di campionamento del filtro e la scheda di dati di esempio per l&#39;individuo che si raccoglie il campione campo, insieme con le necessarie istruzioni concernenti campione raccolta (per esempio, il volume del campione, la posizione di campionamento, ecc). </li></ol></li></ol> 2. Preparazione per la raccolta del campione al campionamento Sito <ol><li> Lavarsi le mani al momento dell&#39;arrivo in luogo di raccolta e di indossare guanti chirurgici per ridurre al minimo la possibilità di contaminazione del campione. Non raccogliere campioni caso di sintomi intestinali o respiratori. Cambiare i guanti frequentemente, e soprattutto dopo aver toccato rubinetti e altri oggetti che potrebbero essere contamminata. </li><li> Record campione significativo il monitoraggio di informazioni su una scheda di dati di esempio. Informazioni rilevanti includono sito e identificazione del campione, il nome del campionatore, e modelli di attrezzature e numeri di serie. </li><li> Aprire il rubinetto dell&#39;acqua per 2-3 minuti per eliminare eventuali residui che si è stabilito in linea. Se necessario, utilizzare un tubo da giardino o il tubo per raggiungere uno scarico durante questa fase. </li><li> Se sono collegati i moduli apparecchi campionamento, scollegare e proteggere le estremità aperte del modulo contenitore della cartuccia con un foglio sterile. Collegare il modulo di scarico al modulo di aspirazione e quindi collegare sia al rubinetto dell&#39;acqua. Collegare un tubo da giardino sull&#39;estremità del modulo di scarica e inserire l&#39;estremità libera nel contenitore polipropilene 1 L. </li><li> Aprire il rubinetto e passare almeno 75 L di acqua da campionare attraverso l&#39;apparecchio. <ol><li> Misurare e registrare i parametri di qualità dell&#39;acqua durante il periodo flush acqua che scorre nel polipropilene Contenitori cloro residsessuali, pH, temperatura e torbidità. </li><li> Dopo aver spento l&#39;acqua al rubinetto, disconnettere il modulo di scarico dal modulo di aspirazione, e quindi collegare il modulo contenitore della cartuccia alla presa del modulo di aspirazione e il modulo di scarico all&#39;uscita del modulo vano cartuccia. Ripristinare il totalizzatore lettura a zero. </li></ol></li></ol> 3. Campo Raccolta dei campioni <ol><li> Registrare la lettura iniziale totalizzatore con la data e l&#39;ora e poi aprire lentamente il rubinetto dell&#39;acqua. <ol><li> Assicurarsi che l&#39;alloggiamento della cartuccia è in posizione verticale e che riempie completamente di acqua. Alcune custodie hanno un pulsante di sfiato che può essere premuto per espellere l&#39;aria dal corpo durante il processo di riempimento. </li><li> Aprire completamente il rubinetto. Regolare la portata di 10 l / min con la valvola di bronzo globo e quindi registrare la portata iniziale. </li></ol></li><li> Passare 300 L di acqua di superficie o 1.500 a 1.800 L delle acque sotterranee attraverso l&#39;apparecchio utilizzandole letture del totalizzatore (come modificato, se necessario). Se gli zoccoli filtro prima il volume richiesto è raggiunto e più della metà del volume sono stati raccolti, utilizzare un secondo modulo alloggiamento del filtro per raccogliere il campione rimanente, se disponibile. </li><li> Osservare la portata come il volume del campione si avvicina alla fine del periodo di campionamento e spegnere il flusso dell&#39;acqua al rubinetto campione. Registrare il tasso finale di flusso, la data, l&#39;ora del giorno, la lettura finale totalizzatore, e il volume totale del campione. </li><li> Scollegare l&#39;apparecchio di campionamento del filtro dal rubinetto. Scollegare il modulo contenitore della cartuccia dagli altri moduli. <ol><li> Girare l&#39;alloggiamento del filtro (s) a testa in giù e lasciare l&#39;acqua in eccesso di defluire fino a quando non più acqua si scaricherà da entrambe le porte di entrata e uscita. </li><li> Ruotare il corpo in posizione verticale e coprire le rapide si collega a ciascuna estremità con un foglio di alluminio sterile. Posizionare l&#39;alloggiamento in una o più sacchetti di plastica sigillabili. </li><li> Scaricare l&#39;acqua dalla presa e dModuli ischarge. Posizionare i moduli in uno o più sacchi di plastica sigillabili. </li></ol></li></ol> 4. Spedizione di campo Campioni <ol><li> Posizionare i moduli apparecchi campionamento filtro in un deposito e trasporto dispositivo di raffreddamento isolato. </li><li> Aggiungere pacchetti di ghiaccio congelati o cubetti di ghiaccio doppio imballaggio al magazzinaggio e trasporto cooler per garantire che il campione rimanga tra 1-10 ° C durante la spedizione. Due grandi o 6-8 piccoli impacchi di ghiaccio dovrebbe essere sufficiente. </li><li> Posizionare un termografo nello stoccaggio isolato e il trasporto al torace in una posizione senza contatto a impacchi di ghiaccio o sacchetti di ghiaccio. NOTA: Il termografo è opzionale se il laboratorio di analisi verrà utilizzato un termometro a infrarossi visiva per misurare la temperatura del vano cartuccia immediatamente all&#39;arrivo e l&#39;apertura del contenitore. </li><li> Riempite ogni spazio vuoto con materiale di imballaggio e poi posizionare il foglio dati di esempio, protetta in un sacchetto di plastica richiudibile, in top. Chiudere lo stoccaggio e il trasporto isolato petto e nastro adesivo per evitare che entri dell&#39;acqua. </li><li> Trasportare o spedire il campione al laboratorio di analisi. Assicurarsi che il campione arriva al laboratorio di analisi entro 24 ore dopo l&#39;inizio della raccolta del campione campo (cioè, il tempo registrato al punto 3.1). </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Diversi tipi di filtro per concentrazione di virus dalle acque ambientali sono stati utilizzati nel corso degli anni 26. I metodi attuali impiegano ultrafiltri 27, filtri elettronegativi 13,28,29, filtri lana di vetro di 23, e filtri elettropositivi 30. Filtri elettronegativo stati ampiamente usati per molti anni, ma un requisito per l&#39;aggiunta di sale e la regolazione del pH dell&#39;acqua nel campo prima o durante il campionamento limita la loro utilità 13. La scelta del filtro più pratica per il campionamento campo è filtri elettropositivi. Questi filtri consentono il campionamento di grandi volumi di acqua a portate elevate e senza condizionamento dell&#39;acqua. I filtri di lana di vetro sono l&#39;opzione meno costosa, ma hanno portate più lenti rispetto ai filtri elettropositivi e non sono disponibili in commercio. Ultrafiltri offrono i più alti recuperi di virus su una vasta gamma di qualità delle acque, ma l&#39;attrezzatura necessaria per sampling non è prontamente campo portatile e il tempo necessario per raccogliere campioni è molto più lungo 27. Metodi di recente sono stati sviluppati che uso precondizionato filtri elettronegativi per evitare la necessità di regolazione nel campo, ma questi non sono applicabili per la raccolta di grandi volumi di campione 28,29. Metodo EPA 1615 utilizza filtri a cartuccia elettropositivi che ottengono la loro carica positiva da entrambi in alluminio nanofibre di ossido o ammine quaternarie. I vantaggi del primo sul secondo è che è meno costoso e raccoglie efficacemente virus dalle acque su una più ampia gamma di valori pH naturale 30,31; Tuttavia, ciascuna cartuccia, così come i filtri di lana di vetro usati da Borchardt e colleghi forniscono recuperi simili di enterovirus e norovirus da 23,31,32 acqua (Cashdollar, dati non pubblicati). I filtri a cartuccia sono collocati in un semplice apparecchio di campionamento che è stato progettato per semplificare la raccolta di campionie ridurre la contaminazione durante il campionamento. Metodi standard hanno un valore inestimabile quando grandi studi sono condotti utilizzando più laboratori di analisi. Metodo EPA 1615 fornisce le procedure standard e linee guida per ridurre al minimo le due grandi questioni di raccolta del campione che possono influenzare i dati raccolti nel corso di questi studi a falsi risultati positivi derivanti dalla contaminazione durante il prelievo del campione o dai componenti apparecchi adeguatamente disinfettati, e l&#39;intasamento dei pori del filtro dai componenti in l&#39;acqua viene campionata. Proprio come i virus enterici possono essere diffuse da persona a persona, a causa di igiene inadeguati, i virus possono essere introdotti in campioni da mani o le mani mal lavate con guanti contaminati 33. E &#39;essenziale che i campionatori capire le potenziali vie di contaminazione e di utilizzare una tecnica asettica durante il campionamento. Campionatori dovrebbero capire che i guanti vengono utilizzati principalmente per proteggere il campionatore dall&#39;esposizione e non pProteggete l&#39;apparecchio dalla contaminazione. Lavare le mani prima dell&#39;inizio del campionamento e la cura deve essere presa durante la vestizione di guanti per evitare la mano a guanto contaminazione. Campionatori con sintomi di gastroenterite o respiratori non devono raccogliere campioni, in quanto potrebbero essere spargimento enterovirus o norovirus in alti livelli. In secondo luogo, occorre prestare attenzione per impedire il passaggio del virus da eventi di campionamento precedenti. Per minimizzare questo potenziale fonte di contaminazione, l&#39;apparato campionamento Metodo 1615 è stato modificato da quello della ICR non includendo un regolatore di pressione e misuratore di pressione tra l&#39;ingresso e il modulo contenitore della cartuccia. Questi componenti sono stati rimossi a causa delle pressioni osservati durante gli eventi di campionamento sono stati sempre al di sotto del limite massimo di abitazioni (ad esempio, 125 psi per custodie a cartuccia da 5 pollici) e perché erano difficili da disinfettare. Quest&#39;ultimo problema è stato dimostrato attraverso l&#39;uso di apparecchiature controlli in bianco in vudies successiva alla ICR 6,20. La misura in cui ha interessato i dati ICR è sconosciuta, ma probabilmente era piccolo; c&#39;erano solo due campioni falsi positivi negativi di valutazione delle prestazioni durante lo studio (dati non riportati). Per ridurre ulteriormente la possibilità di contaminazione riporto, si raccomanda inoltre che il tubo di ingresso del modulo sostituito dopo ogni evento di campionamento. È particolarmente importante garantire un&#39;adeguata disinfezione se l&#39;apparecchio è stato utilizzato per un controllo di qualità o prestazioni che è stato seminato con il virus. Prima di eseguire la disinfezione, la concentrazione di cloro libero deve essere misurato per perdite durante la conservazione. Oltre ai cambiamenti nella configurazione dell&#39;apparecchiatura sopra descritta, è essenziale che sbozzati attrezzature regolari eseguire per dimostrare che la disinfezione è efficace. Metodo 1615 stabilisce che gli spazi di attrezzature essere eseguite con apparecchiature che sono stati disinfettati dopo essere stato utilizzato per i controlli di virus-seeded, semplificando in tal modola procedura eliminando la necessità di passare una soluzione antivirus testa di serie attraverso l&#39;apparecchio prima di disinfezione. La concentrazione di disinfettante è stato aumentato a 0,525% ipoclorito per Method 1615, come questa concentrazione è necessaria sia per inattivare virus vitali dell&#39;apparecchio e per degradare gli acidi nucleici. Pertanto, gli spazi degli apparecchi devono essere analizzati utilizzando sia colture cellulari e saggi qPCR. Entrambi i tipi di filtri elettropositivi sono stati oggetto di intasamento nel corso degli studi riportati nella tabella 1. Un numero imprecisato di campioni con volumi ridotti può essere dovuto a errori di campionamento, come ad esempio una lettura errata della totalizzatore o un arresto precoce intenzionale di campionamento per incontrare un altro termine, in particolare per le acque con valori di torbidità inferiore a 20 NTU. Il grado di intasamento dipende sia sui parametri di tipo di filtro e di qualità dell&#39;acqua. Prefiltri fornire qualche misura di miglioramento, ma se usato, dovrebbero essere elaborati e analizzatiseparatamente dal filtro elettropositivi. La raccomandazione corrente per la UCMR3 è che il campione essere raccolto senza prefiltri con filtri basati nanofibre-ossido di alluminio a due se almeno la metà del volume può essere raccolto con il primo filtro.

Virus enterici umani si replicano all&#39;interno del tratto gastrointestinale e si diffondono attraverso la via fecale-orale. Questi virus sono spesso trovati in acque di scarico in alte concentrazioni 1-3. Possono persistere negli effluenti fognari 4,5, e in superficie di 6,7, a terra 8-10, e trattati di bere 11 acque. Quando presente, la concentrazione del virus nelle acque ambientali negli Stati Uniti in genere è troppo bassa per la misura diretta 12,13. Ciò richiede che i virus concentrare da grandi volumi di acqua. Durante la raccolta informazioni Rule (ICR) monitoraggio condotto dalla US Environmental Protection Agency (EPA) 14, le concentrazioni di virus di campioni positivi in acqua di fonte delle grandi imprese a livello nazionale a distanza ,009-19,7 più probabile numero di unità infettive (MPN) / L. Concentrazioni mediane e medie di campioni positivi erano 0,03 e 0,17 MPN / L per le acque di sorgente da corsi d&#39;acqua, 0,01a 0,07 MPN / L per quelli provenienti da laghi e bacini, e 0,04-0,74 MPN / L per coloro che utilizzano le acque sotterranee 11 (dati dal ICR Aux1 database access 18 mesi del 2000/04/25). Le concentrazioni di virus di campioni positivi da uno studio USEPA di acque sotterranee nazionali variava 0,009-2,12 unità infettive / L con mediana e le concentrazioni medie di 0,13 e di 0,29 unità infettive / L 8. La concentrazione del virus in campioni di acque sotterranee positivi era più alto rispetto a quelli in corsi d&#39;acqua. La maggior parte degli impianti che utilizzano le acque sotterranee in questi studi ottenuti acqua da falde acquifere situate in regioni carsiche. Questi, insieme a quelli situati in calcare e cristallina impostazioni (bedrock fratturato) possono avere concentrazioni di virus superiori in altri contesti 8,15,16. Metodi virus USEPA specificano i volumi di campionamento di 200 L (ICR) per 300 L (Metodo 1615) delle acque di superficie e 1.000 L (ICR) per 1.500 L (Metodo 1615) delle acque sotterranee 17,18. Tuttavia, anche con l&#39;uso digrandi volumi di campione, la maggior parte dei campioni idriche superficiali e sotterranee sono negativi per il virus 8,11,19,20. I virus presenti nelle acque di superficie rappresentano un potenziale rischio per la salute dei consumatori di acqua potabile. La superficie dell&#39;acqua regola il trattamento richiede che tutti gli impianti di trattamento che utilizzano l&#39;acqua di superficie per ridurre le concentrazioni di virus di almeno 4-log. Anche con una riduzione del 4-log, le concentrazioni di virus infettivi in acqua di fonte più piccolo 0,0044 MPN / L potrebbe portare a un&#39;infezione al giorno assumendo tale esposizione e trattamento condizioni medie ed i parametri di risposta della dose per rotavirus 11,21. Il rischio di virus in acque sotterranee non trattati potrebbe essere ancora maggiore a causa della mancanza di trattamento e occorrenza virale. Borchardt e colleghi stimano che fino al 22% di gastroenterite acuta negli adulti e il 63% nei bambini di meno di cinque anni potrebbero essere causa di virus in acqua potabile nelle comunità con le acque sotterranee non trattate 19. USEPA Metodo 1615 è stato sviluppato per rilevare enterovirus e norovirus durante il ciclo di terza monitoraggio del regolamento di monitoraggio non regolamentata contaminanti (UCMR3) 22 come un cittadino seguito alle conclusioni di Borchardt e colleghi 19,23. Il metodo USEPA è stato progettato principalmente per misurare il virus in sistemi che utilizzano le acque sotterranee non trattati, ma è stato scritto più in generale per includere altri tipi di matrice acqua. Il nuovo metodo è un ibrido preservare molti componenti del metodo precedente virus usato per il ICR 17, l&#39;aggiunta di procedure molecolari basata sul metodo di Borchardt et al. 19,23, e set di primer aggiuntivi per norovirus 24. Lo scopo di questo documento è di descrivere il procedimento di campionamento ed i passaggi necessari per mantenere l&#39;integrità del campione durante il prelievo e la spedizione. Una valutazione complessiva del metodo è descritto in Cashdollar et al. 25. Questo protocollo riguarda semplice collectio campon delle acque superficiali e sotterranee, dove una pompa e prefiltro non sono necessari e dove non sono necessarie regolazioni per pH o la presenza di un disinfettante in acqua da campionare. I requisiti di campionamento più complessi sono descritti in Fout et al. 17,18.

<table><tbody><tr><td>Bottiglia in polipropilene da 1 litro</td><td>Nalgene</td><td>2104-0032</td><td></td></tr><tr><td>Quadrati in foglio di alluminio</td><td>Cole-Parmer</td><td>06275-40</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Steris</td><td>Amsco Lab Series</td><td></td></tr><tr><td>Pluriball</td><td>U.S. Plastics</td><td>50776</td><td></td></tr><tr><td>Borsa richiudibile</td><td>Uline</td><td>S-12283</td><td></td></tr><tr><td>Borsa richiudibile</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>S31798C</tr><tr><td>Impacchi di ghiaccio commerciali</td><td>Cole-Parmer</td><td>06345-20</td><td></td></tr><tr><td>Scatola di sicurezza fredda</td><td>Diversified Biotech</td><td>CSF-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Spugna di garza</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro graduato</td><td>Cole-Parmer</td><td>06135-90</td><td>4-L o superiore</td></tr><tr><td>Hype Wipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-412-56</td><td></td></tr><tr><td>Registratore di dati di temperatura iButtons</td><td>Maxim</td><td>DS1921G</td><td></td></tr><tr><td>Cassettiera isolata per lo stoccaggio e il trasporto</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-676-12</td><td></td></tr><tr><td>Nastro da imballaggio</td><td>U.S. Plastics</td><td>50083</td><td></td></tr><tr><td>Kit portatile per il test del colorimetro del cloro II Hach</td><td></td><td>5870062</td><td></td></tr><tr><td>Sonda portatile di pH e temperatura</td><td>Omega</td><td>PHH-830</td><td></td></tr><tr><td>Portable torbidimetro</td><td>Omega</td><td>TRB-2020-E</td><td></td></tr><tr><td>Nastro filettato in PTFE</td><td>Cole-Parmer</td><td>08270-34</td><td>Utilizzo su tutti i collegamenti filettati</td></tr><tr><td>Pompa, centrifuga a trascinamento magnetico</td><td>Cole-Parmer</td><td>72010-20</td><td></td></tr><tr><td>Nipplo di riduzione</td><td>Cole-Parmer</td><td>06349-87</td><td></td></tr><tr><td>Ipoclorito di sodio (NaClO)</td><td></td><td></td><td>Utilizzare candeggina per uso domestico disponibile localmente</td></tr><tr><td>Tiosolfato di sodio (Na2S2O3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>217247</td><td></td></tr><tr><td>Guanti chirurgici</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-058-800</td><td></td></tr><tr><td>Pennarello impermeabile</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-290546</td><td></td></tr><tr><td>Composizione</td><td></td><td></td><td>dei terreni</td></tr><tr><td>0,525% ipoclorito di sodio (NaClO)</td><td>Preparare una soluzione di NaClO allo 0,525% diluendo la candeggina per uso domestico 1:10 in dH2O.&nbsp; Conservare le soluzioni di NaClO allo 0,525% per un massimo di 1 settimana a temperatura ambiente.</td><td></td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>1 M tiosolfato di sodio (Na2S2O3) pentaidrato</td><td>Preparare una soluzione 1 M sciogliendo 248.2 g di Na2S2O3 in 1 L di dH2O.&nbsp; Conservare il tiosolfato di sodio per un massimo di 6 mesi a temperatura ambiente.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metodo epa 1615. misura di enterovirus e norovirus evento in acqua per la cultura e rt-qpcr. i. raccolta di campioni di virus

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Il metodo 1615 è stato sviluppato con l'obiettivo di fornire un metodo standard per misurare enterovirus e norovirus nelle acque ambientali e potabili. Il componente di campionamento standardizzato del metodo concentra i virus che possono essere presenti nell'acqua attraverso il passaggio di un volume d'acqua minimo specificato attraverso un filtro a cartuccia elettropositivo. I volumi minimi specificati per le acque superficiali e finite/sotterranee sono rispettivamente di 300 L e 1.500 L. Una delle principali limitazioni del metodo è la tendenza dei filtri a intasarsi prima di soddisfare i requisiti di volume del campione. Gli studi che hanno utilizzato due opzioni di filtro a cartuccia diverse, ma equivalenti, hanno dimostrato che l'intasamento del filtro era un problema con il 10% dei campioni con uno dei tipi di filtro rispetto al 6% con l'altro tipo di filtro. L'intasamento tende ad aumentare con la torbidità, ma non può essere previsto solo sulla base delle misurazioni della torbidità. Dal punto di vista dei costi, una delle opzioni di filtro è preferibile rispetto all'altra, ma la qualità dell'acqua e l'esperienza con il sistema idrico da campionare dovrebbero essere prese in considerazione nella scelta del filtro.

Filtro intasamento è un grave problema potenziale che può essere rilevato con Metodo 1615. intasamento diminuisce la portata di acqua attraverso il filtro. In alcuni casi questo può essere superato aprendo la valvola a globo per consentire una maggiore portata. In altri casi il filtro diventerà completamente intasato prima che il volume desiderato è passato attraverso di essa. La tabella 1 mostra la percentuale di campioni con volumi ridotti in funzione del tipo di filtro, tipo acqua e torbidità. Intasamento si è verificato con i campioni sia di acque sotterranee e acque superficiali, con il filtro a base di ossido di alluminio nanofibre superando il filtro a base di ammina quaternaria per campioni di acque sotterranee, mentre il contrario è stato il caso per i campioni di acqua di superficie. Complessivamente, il 6% dei campioni raccolti utilizzando il filtro a base di ammina quaternaria erano carenti in termini di volume, mentre il 10% dei campioni raccolti con i filtri basati su nanofibre ossido di alluminio non è riuscito a soddisfare il volume minimo specificato necessaria a causa di intasamento. In generil, intasamento aumentata con torbidità, ma un numero di componenti diversi contribuiscono alla torbidità e alcuni di questi non portano ad intasamenti. Per esempio, 43% di tutti gli eventi che si verificano durante l'intasamento studio ICR fosse limitato a due sistemi fluviali (dati non mostrati). Durante l'ICR il volume minimo di destinazione per le acque superficiali era di 200 L. Il volume medio raccolti nel corso dello studio è stato 217 ± 32 L con un volume medio di 208 L (dati dal ICR Aux1 database access 18 mesi datato 2000/04/25) . Così, il volume completo può essere raccolto da molte acque anche con forti torbidità. L'ICR richiesto campionatori di utilizzare un prefiltro quando torbidità sono stati oltre 75 NTU, ma anche con un prefiltro, il 34% dei campioni raccolti in acque con torbidità oltre 75 NTU intasato. Metodo 1615 raccomanda l'uso di un prefiltro con le acque più di 50 NTU; Tuttavia, dalla pubblicazione del metodo 1615, diverse opzioni prefiltro diverse oltre a quelle elencate nel metodo sono statitestato. Nessuno di questi determinato un miglioramento significativo volume di campione (dati non mostrati). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52067/52067fig1.jpg"> Figura 1. Filtro standard Apparecchiatura. L'apparecchiatura filtro standard consiste di aspirazione, scatola del filtro, e moduli di scarico (vedi Materiali supplementari per una descrizione di ogni modulo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52067/52067fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Totale Campioni un </td><td> Numero di campioni carenti b </td><td> Percentuale campioni carenti </td><td> Torbidità (NTU) </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="200px" style="text-align:center"> Le acque sotterranee con Nano Ceramica Filtri c </td></tr><tr><td> 113 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> &lt;20 </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="200px" style="text-align:center"> L'acqua di superficie usando Filtri Nano Ceramica c </td></tr><tr><td> 83 </td><td> 12 </td><td> 14 </td><td> &lt;20 d </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 4 </td><td> 50 </td><td> 20 - &lt;50 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 5 </td><td> 83 </td><td> ≥ 50 d </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="230px" style="text-align:center"> Totale Nano Ceramica c </td></tr><tr><td> 210 </td><td> 22 </td><td> 10 </td><td> ≥ 0 </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="200px" style="text-align:center"> Le acque sotterranee utilizzando 1MDS Filtri c </td></tr><tr><td> 374 </td><td> 75 </td><td> 20 </td><td> &lt;20 </td></tr><tr>ext-align: center "&gt; Acqua di superficie usando 1MDS Filtri c </tr><tr><td> 2693 </td><td> 27 </td><td> 1 e </td><td> &lt;20 e </td></tr><tr><td> 505 </td><td> 36 </td><td> 7 f </td><td> 20 - &lt;50 f </td></tr><tr><td> 122 </td><td> 19 </td><td> 16 e </td><td> 50 - &lt;75 g </td></tr><tr><td> 175 </td><td> 60 </td><td> 34 e, f </td><td> ≥ 75 e, f, g </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="240px" style="text-align:center"> Totale 1MDS c </td></tr><tr><td> 3.869 </td><td> 217 </td><td> 6 </td><td> ≥ 0 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Filter Capacità a campioni sono dai seguenti studi da cui sono disponibili i dati di volume e torbidità:. 1) studio ICR di EPA (dati dal ICR Aux1 database access 18 mesi del 4/25/2000), 2) studio USEPA acque sotterranee 8, 3) USEPA Lawrence e Lowell, MA studio (dati non pubblicati), 4) studio USEPA Mississippi River (dati non pubblicati), 5) lo studio impianto di trattamento dell'acqua potabile USEPA (dati non pubblicati), 6) Metodo USEPA 1615 studio di valutazione di 25, e 7) i primi tre mesi di monitoraggio UCMR3 (dati non pubblicati). b campioni in cui il filtro intasato prima che il volume minimo di acqua indicata per ciascuno studio sono stati raccolti. Questo è stato di 200 L per le acque superficiali e 1.500 L per le acque sotterranee, ma era 200 L per le acque di sorgente che erano acque sotterranee sotto il USEPA ICR e 1.893 L per lo studio delle acque sotterranee USEPA. C La capacità di raccogliere la minima pieno volume specificato è significativamente diverso per I campioni raccolti usando Nano Ceramica e filtri 1MDS (P = 0.002) e tra acque superficiali e sotterranee, sia generale (P &lt;0,001) e per ogni tipo di filtro (P &lt;0.001) con il test di Mann-Whitney della somma dei ranghi. d &amp; #8211, g gruppi con lo stesso valore apice sono significativamente differenti (P &lt;0,05) secondo il Kruskal-Wallis One Way analisi della varianza in prova Ranks e procedura multipla di confronto di Dunn coppie. Per tutti i test statistici la variabile dipendente è il volume passata attraverso il filtro come una frazione del volume minimo specificato, ma con un valore massimo di 1,0.

EPA Il metodo 1615 utilizza un filtro elettropositivo per concentrare enterovirus e norovirus nelle acque ambientali e potabili. Questo manoscritto descrive la procedura per la raccolta dei campioni per le analisi del Metodo 1615.

Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Evento in acqua per la cultura e RT-qPCR. I. Raccolta di campioni di virus

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un approccio standardizzato per il campionamento delle acque ambientali e potabili per la presenza di virus enterici basato sul metodo EPA 1615. Ciò si ottiene assemblando prima un apparato di campionamento, sterilizzando i moduli di aspirazione e di alloggiamento della cartuccia dell'apparecchio e quindi aggiungendo asetticamente un filtro a cartuccia elettropositivo sterile. Successivamente, un volume definito di acqua viene fatto passare attraverso un filtro elettropositivo contenuto nell'apparecchio di campionamento.Quindi l'acqua in eccesso viene scaricata dall'apparecchio e dall'alloggiamento del filtro a cartuccia e il volume campionato viene registrato su una scheda tecnica campione. Infine, i componenti dell'apparecchiatura di campionamento vengono imballati in un contenitore di spedizione più fresco mantenuto a una temperatura compresa tra 1 e 10 gradi Celsius e consegnati a un laboratorio di analisi. In definitiva, gli enterovirus e i norovirus nelle acque ambientali e potabili vengono misurati utilizzando questa procedura di campionamento come parte di un metodo globale.Questa procedura utilizza un filtro elettropositivo per concentrare virus, alcune acque potabili ambientali. Esistono diversi altri tipi di filtro che possono essere utilizzati per eseguire questa procedura. Uno è l'ultra filtro e un altro è un filtro caricato negativamente.Il vantaggio del filtro electro Posy rispetto al filtro ultra è che il campionamento è circa due volte e mezzo più veloce. La raccolta dei virus mediante filtri caricati negativamente richiede una regolazione del pH nell'aggiunta di sali. Il vantaggio di caricare positivamente i filtri è che non sono necessarie regolazioni prima della raccolta del campione.In generale, le persone che non conoscono questa procedura avranno difficoltà a mantenere la sterilità e con condizioni impreviste, come l'assenza di un comodo rubinetto per la raccolta dei campioni. A dimostrare la procedura oggi saremo io, sha out, Jennifer Cash dollaro e Eunice VER oche. Siamo tutti membri dello staff professionale del National Exposure Research Laboratory dell'EPA a Cincinnati, Ohio.Per prepararsi alla raccolta del campione, assemblare un apparato filtrante standard come mostrato qui costituito da un modulo di aspirazione, un modulo di alloggiamento della cartuccia e un modulo di scarico come descritto nei materiali supplementari del protocollo di testo. Utilizzo delle portate per il campionamento. Calibrare il totalizzatore del flussometro prima del primo utilizzo collegando un modulo di scarico a un modulo di aspirazione, quindi collegando il modulo di aspirazione a un rubinetto.Aprire completamente il rubinetto e quindi utilizzare la valvola a globo in bronzo per regolare la portata a 10 litri al minuto. Una volta che la portata è stabile a 10 litri al minuto, reimpostare il totalizzatore del flussometro per leggere il volume totale. Quindi posizionare l'uscita del modulo di scarico in un cilindro graduato da quattro litri o più grande e contemporaneamente azzerare il totalizzatore.Misurare la lettura del totalizzatore al segno di quattro litri e il timer necessario per raggiungere il segno di quattro litri sul cilindro. Se la lettura del totalizzatore è inferiore a 3,96 o superiore a 4,04 litri, calcolare un fattore di correzione necessario per regolare la differenza osservata. Ad esempio, se il totalizzatore del flussometro legge 3,9 litri al segno di quattro litri sul cilindro graduato, il fattore di correzione sarebbe 1,026 o quattro diviso per 3,9 Per sterilizzare l'apparato filtrante standard e prepararlo per la raccolta del campione, utilizzare ipoclorito di sodio allo 0,525% per immergere completamente i moduli di aspirazione e alloggiamento della cartuccia e immergere per almeno 30 minuti.In alternativa, utilizzare una pompa per far circolare la soluzione attraverso i moduli. Utilizzare DH sterile due O per risciacquare i moduli, quindi utilizzare una soluzione sterile di 50 millilitri di un molare di sodio tio solfato per litro di acqua reagente sterile per declorare per cinque minuti. Quindi utilizzare un foglio di alluminio sterile per coprire l'apparecchio di campionamento del filtro.Il modulo termina in modo asettico. Aggiungere un filtro a cartuccia elettropositivo al modulo dell'alloggiamento della cartuccia facendo attenzione che sia posizionato correttamente. Negli alloggiamenti registrare un numero di campione univoco su una scheda tecnica del campione, quindi prendere o spedire l'apparecchio di campionamento del filtro, la scheda tecnica del campione e tutte le istruzioni necessarie relative alla raccolta del campione alla persona che raccoglierà il campione sul campo All'arrivo al sito di raccolta e dopo essersi lavati le mani, indossare guanti chirurgici per ridurre al minimo la contaminazione del campione.Cambiare frequentemente i guanti, soprattutto dopo aver toccato i rubinetti dell'acqua e altri oggetti che potrebbero essere contaminati. Utilizzare un tampone contenente ipoclorito di sodio per sterilizzare il rubinetto dell'apparecchio di campionamento e le filettature interne di un tubo da giardino. Registra le informazioni rilevanti per la tracciabilità del campione su una scheda tecnica del campione, tra cui l'identificazione del sito e del campione, il nome del campionatore, i modelli dell'apparecchiatura e i numeri di serie.Collegare il tubo da giardino al rubinetto. Posizionare l'uscita del tubo in un luogo in cui l'acqua possa essere scaricata in sicurezza, quindi aprire l'acqua. Toccare per due o tre minuti per rimuovere eventuali detriti che si sono depositati nella linea.Collegare il modulo di scarico al modulo di aspirazione, quindi collegare entrambi al rubinetto dell'acqua. Collegare un tubo da giardino all'estremità del modulo di scarico e posizionare l'estremità libera nel contenitore di propilene da un litro. Quindi apri il rubinetto e fai passare almeno 75 litri di acqua da campionare attraverso l'apparato.Misurare e registrare i seguenti parametri di qualità dell'acqua durante il periodo di lavaggio dell'acqua che scorre nel contenitore del propilene, il pH residuo del cloro, la temperatura e la torbidità. Dopo aver chiuso l'acqua dal rubinetto, scollegare il modulo di scarico dal modulo di aspirazione, quindi collegare il modulo dell'alloggiamento della cartuccia all'uscita del modulo di aspirazione e il modulo di scarico all'uscita del modulo dell'alloggiamento della cartuccia. Quindi azzerare la lettura del totalizzatore.Per iniziare la raccolta di campioni sul campo. Registrare la lettura iniziale del totalizzatore insieme alla data e all'ora, quindi aprire lentamente il rubinetto dell'acqua. Assicurarsi che l'alloggiamento della cartuccia sia in posizione verticale e che si riempia completamente d'acqua.Ora, apri completamente il rubinetto e usa la valvola a globo in bronzo per regolare la portata a 10 litri al minuto prima di registrare la portata iniziale. Utilizzando le letture del totalizzatore, far passare 300 litri di acqua superficiale o da 1500 a 1800 litri di acque sotterranee attraverso l'apparato. Osservare la portata man mano che il volume del campione si avvicina alla fine del periodo di campionamento, quindi chiudere il flusso d'acqua al rubinetto del campione registrare la portata finale, la data, l'ora del giorno, la lettura finale del totalizzatore e il volume totale del campione.Scollegare l'apparecchio di campionamento del filtro dal rubinetto. Scollegare il modulo dell'alloggiamento della cartuccia dagli altri moduli. Capovolgere gli alloggiamenti del filtro e lasciare defluire l'acqua in eccesso fino a quando l'acqua non fuoriesce più dalle porte di ingresso e di uscita.Ruotare l'alloggiamento in posizione verticale e utilizzare un foglio sterile per coprire le connessioni rapide su ciascuna estremità. Posizionare l'alloggiamento in uno o più sacchetti di plastica sigillabili. Scaricare l'acqua dai moduli di aspirazione e scarico.Posizionare i moduli in uno o più sacchetti di plastica sigillabili per preparare i campioni per la spedizione. Posizionare i moduli dell'apparato di campionamento del filtro in un refrigeratore isolato per lo stoccaggio e il trasporto. Aggiungere impacchi di ghiaccio congelati o cubetti di ghiaccio in doppio sacchetto al refrigeratore per la conservazione e il trasporto per garantire che il campione rimanga tra uno e 10 gradi Celsius.Durante la spedizione. Riempire lo spazio vuoto con materiale di imballaggio, quindi posizionare il sample scheda tecnica in un sacchetto di plastica sigillabile e posizionarlo sopra il materiale di imballaggio. Chiudere il contenitore isolato e il trasporto a casse o spedire il campione al laboratorio di analisi.Se la cassa deve essere spedita, sigillarla con del nastro adesivo per evitare perdite. Assicurarsi che il campione arrivi al laboratorio di analisi entro e non oltre 24 ore dall'inizio della raccolta sul campo. L'intasamento del filtro è un grave problema potenziale che può essere riscontrato con il metodo 1615 poiché riduce la portata dell'acqua.Questa tabella mostra la percentuale di campioni con volumi ridotti in funzione del tipo di filtro, del tipo di acqua e della torbidità. Durante il filtraggio dei campioni di acque sotterranee, il filtro contenente fibre nano Illumina ha superato un filtro a base di ammina quaternaria. Il filtro a base di ammina era migliore per filtrare campioni di acqua superficiale.Nel complesso, il 6% dei campioni raccolti utilizzando il filtro basato sulla media quaternaria era carente in volume. Mentre il 10% dei campioni raccolti con l'ossido di alluminio, i filtri a base di nanofibre non sono riusciti a soddisfare il volume minimo specificato richiesto a causa dell'intasamento. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere condizioni sterili.Questa è solo la prima procedura di un metodo complessivo. A seguire questa procedura verranno eseguite l'eluizione del filtro, la concentrazione secondaria e saggi come il virus colturale totale, il saggio e i saggi molecolari. Questi test successivi sono necessari per misurare effettivamente la presenza e la concentrazione del virus.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere campioni di virus dalle acque ambientali e potabili. Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni virali può essere pericoloso e dovresti sempre prendere precauzioni come l'uso di guanti durante l'esecuzione di questa procedura.

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Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

Qui presentiamo una procedura per misurare i virus coltivabili totali utilizzando la linea cellulare di rene Buffalo Green Monkey. La procedura fornisce uno strumento standardizzato per misurare la presenza di virus infettivi nelle acque ambientali e potabili.

Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Presenza in Water di cultura e RT-qPCR. II. Totale coltivabili Virus Assay

Qui presentiamo una procedura per quantificare enterovirus e norovirus nelle acque ambientali e potabili utilizzando la PCR quantitativa a trascrizione inversa. Il recupero medio del virus dalle acque sotterranee con questa procedura standardizzata del metodo EPA 1615 è stato del 20% per il poliovirus e del 30% per il norovirus murino.

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È stata sviluppata e valutata una metodologia di campionamento basata su macroschiuma per il rilevamento e la quantificazione del norovirus su superfici dure ambientali.

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È stato sviluppato un approccio per identificare le condizioni ottimali di concentrazione virale per campioni d'acqua di piccolo volume utilizzando punte di adenovirus umano. Le tecniche qui descritte sono utilizzate per identificare i parametri di concentrazione per altri bersagli virali e applicate alla sperimentazione della concentrazione virale su larga scala.

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Questo manoscritto descrive un approccio automatizzato di selezione delle dimensioni del gel per purificare i frammenti di DNA per il sequenziamento di nuova generazione. La tecnologia Ranger fornisce l'automazione completa dell'intero processo di caricamento del gel di agarosio, analisi elettroforetica e recupero di frammenti di DNA mirati, consentendo librerie di sequenziamento di nuova generazione ad alta produttività e di alta qualità.

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Scopri il campionamento standardizzato di enterovirus e norovirus in acque ambientali e potabili con il metodo EPA 1615. Impara a usare filtri elettropositivi per la concentrazione virale e garantire risultati accurati.

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