Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Evento in acqua per la cultura e RT-qPCR. I. Raccolta di campioni di virus
March 28th, 2015
EPA Il metodo 1615 utilizza un filtro elettropositivo per concentrare enterovirus e norovirus nelle acque ambientali e potabili. Questo manoscritto descrive la procedura per la raccolta dei campioni per le analisi del Metodo 1615.
L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un approccio standardizzato per il campionamento delle acque ambientali e potabili per la presenza di virus enterici basato sul metodo EPA 1615. Ciò si ottiene assemblando prima un apparato di campionamento, sterilizzando i moduli di aspirazione e di alloggiamento della cartuccia dell'apparecchio e quindi aggiungendo asetticamente un filtro a cartuccia elettropositivo sterile. Successivamente, un volume definito di acqua viene fatto passare attraverso un filtro elettropositivo contenuto nell'apparecchio di campionamento.
Quindi l'acqua in eccesso viene scaricata dall'apparecchio e dall'alloggiamento del filtro a cartuccia e il volume campionato viene registrato su una scheda tecnica campione. Infine, i componenti dell'apparecchiatura di campionamento vengono imballati in un contenitore di spedizione più fresco mantenuto a una temperatura compresa tra 1 e 10 gradi Celsius e consegnati a un laboratorio di analisi. In definitiva, gli enterovirus e i norovirus nelle acque ambientali e potabili vengono misurati utilizzando questa procedura di campionamento come parte di un metodo globale.
Questa procedura utilizza un filtro elettropositivo per concentrare virus, alcune acque potabili ambientali. Esistono diversi altri tipi di filtro che possono essere utilizzati per eseguire questa procedura. Uno è l'ultra filtro e un altro è un filtro caricato negativamente.
Il vantaggio del filtro electro Posy rispetto al filtro ultra è che il campionamento è circa due volte e mezzo più veloce. La raccolta dei virus mediante filtri caricati negativamente richiede una regolazione del pH nell'aggiunta di sali. Il vantaggio di caricare positivamente i filtri è che non sono necessarie regolazioni prima della raccolta del campione.
In generale, le persone che non conoscono questa procedura avranno difficoltà a mantenere la sterilità e con condizioni impreviste, come l'assenza di un comodo rubinetto per la raccolta dei campioni. A dimostrare la procedura oggi saremo io, sha out, Jennifer Cash dollaro e Eunice VER oche. Siamo tutti membri dello staff professionale del National Exposure Research Laboratory dell'EPA a Cincinnati, Ohio.
Per prepararsi alla raccolta del campione, assemblare un apparato filtrante standard come mostrato qui costituito da un modulo di aspirazione, un modulo di alloggiamento della cartuccia e un modulo di scarico come descritto nei materiali supplementari del protocollo di testo. Utilizzo delle portate per il campionamento. Calibrare il totalizzatore del flussometro prima del primo utilizzo collegando un modulo di scarico a un modulo di aspirazione, quindi collegando il modulo di aspirazione a un rubinetto.
Aprire completamente il rubinetto e quindi utilizzare la valvola a globo in bronzo per regolare la portata a 10 litri al minuto. Una volta che la portata è stabile a 10 litri al minuto, reimpostare il totalizzatore del flussometro per leggere il volume totale. Quindi posizionare l'uscita del modulo di scarico in un cilindro graduato da quattro litri o più grande e contemporaneamente azzerare il totalizzatore.
Misurare la lettura del totalizzatore al segno di quattro litri e il timer necessario per raggiungere il segno di quattro litri sul cilindro. Se la lettura del totalizzatore è inferiore a 3,96 o superiore a 4,04 litri, calcolare un fattore di correzione necessario per regolare la differenza osservata. Ad esempio, se il totalizzatore del flussometro legge 3,9 litri al segno di quattro litri sul cilindro graduato, il fattore di correzione sarebbe 1,026 o quattro diviso per 3,9 Per sterilizzare l'apparato filtrante standard e prepararlo per la raccolta del campione, utilizzare ipoclorito di sodio allo 0,525% per immergere completamente i moduli di aspirazione e alloggiamento della cartuccia e immergere per almeno 30 minuti.
In alternativa, utilizzare una pompa per far circolare la soluzione attraverso i moduli. Utilizzare DH sterile due O per risciacquare i moduli, quindi utilizzare una soluzione sterile di 50 millilitri di un molare di sodio tio solfato per litro di acqua reagente sterile per declorare per cinque minuti. Quindi utilizzare un foglio di alluminio sterile per coprire l'apparecchio di campionamento del filtro.
Il modulo termina in modo asettico. Aggiungere un filtro a cartuccia elettropositivo al modulo dell'alloggiamento della cartuccia facendo attenzione che sia posizionato correttamente. Negli alloggiamenti registrare un numero di campione univoco su una scheda tecnica del campione, quindi prendere o spedire l'apparecchio di campionamento del filtro, la scheda tecnica del campione e tutte le istruzioni necessarie relative alla raccolta del campione alla persona che raccoglierà il campione sul campo All'arrivo al sito di raccolta e dopo essersi lavati le mani, indossare guanti chirurgici per ridurre al minimo la contaminazione del campione.
Cambiare frequentemente i guanti, soprattutto dopo aver toccato i rubinetti dell'acqua e altri oggetti che potrebbero essere contaminati. Utilizzare un tampone contenente ipoclorito di sodio per sterilizzare il rubinetto dell'apparecchio di campionamento e le filettature interne di un tubo da giardino. Registra le informazioni rilevanti per la tracciabilità del campione su una scheda tecnica del campione, tra cui l'identificazione del sito e del campione, il nome del campionatore, i modelli dell'apparecchiatura e i numeri di serie.
Collegare il tubo da giardino al rubinetto. Posizionare l'uscita del tubo in un luogo in cui l'acqua possa essere scaricata in sicurezza, quindi aprire l'acqua. Toccare per due o tre minuti per rimuovere eventuali detriti che si sono depositati nella linea.
Collegare il modulo di scarico al modulo di aspirazione, quindi collegare entrambi al rubinetto dell'acqua. Collegare un tubo da giardino all'estremità del modulo di scarico e posizionare l'estremità libera nel contenitore di propilene da un litro. Quindi apri il rubinetto e fai passare almeno 75 litri di acqua da campionare attraverso l'apparato.
Misurare e registrare i seguenti parametri di qualità dell'acqua durante il periodo di lavaggio dell'acqua che scorre nel contenitore del propilene, il pH residuo del cloro, la temperatura e la torbidità. Dopo aver chiuso l'acqua dal rubinetto, scollegare il modulo di scarico dal modulo di aspirazione, quindi collegare il modulo dell'alloggiamento della cartuccia all'uscita del modulo di aspirazione e il modulo di scarico all'uscita del modulo dell'alloggiamento della cartuccia. Quindi azzerare la lettura del totalizzatore.
Per iniziare la raccolta di campioni sul campo. Registrare la lettura iniziale del totalizzatore insieme alla data e all'ora, quindi aprire lentamente il rubinetto dell'acqua. Assicurarsi che l'alloggiamento della cartuccia sia in posizione verticale e che si riempia completamente d'acqua.
Ora, apri completamente il rubinetto e usa la valvola a globo in bronzo per regolare la portata a 10 litri al minuto prima di registrare la portata iniziale. Utilizzando le letture del totalizzatore, far passare 300 litri di acqua superficiale o da 1500 a 1800 litri di acque sotterranee attraverso l'apparato. Osservare la portata man mano che il volume del campione si avvicina alla fine del periodo di campionamento, quindi chiudere il flusso d'acqua al rubinetto del campione registrare la portata finale, la data, l'ora del giorno, la lettura finale del totalizzatore e il volume totale del campione.
Scollegare l'apparecchio di campionamento del filtro dal rubinetto. Scollegare il modulo dell'alloggiamento della cartuccia dagli altri moduli. Capovolgere gli alloggiamenti del filtro e lasciare defluire l'acqua in eccesso fino a quando l'acqua non fuoriesce più dalle porte di ingresso e di uscita.
Ruotare l'alloggiamento in posizione verticale e utilizzare un foglio sterile per coprire le connessioni rapide su ciascuna estremità. Posizionare l'alloggiamento in uno o più sacchetti di plastica sigillabili. Scaricare l'acqua dai moduli di aspirazione e scarico.
Posizionare i moduli in uno o più sacchetti di plastica sigillabili per preparare i campioni per la spedizione. Posizionare i moduli dell'apparato di campionamento del filtro in un refrigeratore isolato per lo stoccaggio e il trasporto. Aggiungere impacchi di ghiaccio congelati o cubetti di ghiaccio in doppio sacchetto al refrigeratore per la conservazione e il trasporto per garantire che il campione rimanga tra uno e 10 gradi Celsius.
Durante la spedizione. Riempire lo spazio vuoto con materiale di imballaggio, quindi posizionare il sample scheda tecnica in un sacchetto di plastica sigillabile e posizionarlo sopra il materiale di imballaggio. Chiudere il contenitore isolato e il trasporto a casse o spedire il campione al laboratorio di analisi.
Se la cassa deve essere spedita, sigillarla con del nastro adesivo per evitare perdite. Assicurarsi che il campione arrivi al laboratorio di analisi entro e non oltre 24 ore dall'inizio della raccolta sul campo. L'intasamento del filtro è un grave problema potenziale che può essere riscontrato con il metodo 1615 poiché riduce la portata dell'acqua.
Questa tabella mostra la percentuale di campioni con volumi ridotti in funzione del tipo di filtro, del tipo di acqua e della torbidità. Durante il filtraggio dei campioni di acque sotterranee, il filtro contenente fibre nano Illumina ha superato un filtro a base di ammina quaternaria. Il filtro a base di ammina era migliore per filtrare campioni di acqua superficiale.
Nel complesso, il 6% dei campioni raccolti utilizzando il filtro basato sulla media quaternaria era carente in volume. Mentre il 10% dei campioni raccolti con l'ossido di alluminio, i filtri a base di nanofibre non sono riusciti a soddisfare il volume minimo specificato richiesto a causa dell'intasamento. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere condizioni sterili.
Questa è solo la prima procedura di un metodo complessivo. A seguire questa procedura verranno eseguite l'eluizione del filtro, la concentrazione secondaria e saggi come il virus colturale totale, il saggio e i saggi molecolari. Questi test successivi sono necessari per misurare effettivamente la presenza e la concentrazione del virus.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere campioni di virus dalle acque ambientali e potabili. Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni virali può essere pericoloso e dovresti sempre prendere precauzioni come l'uso di guanti durante l'esecuzione di questa procedura.
Panoramica
Questo articolo delinea la procedura standardizzata per il campionamento di acque ambientali e potabili al fine di rilevare virus enterici, in particolare enterovirus e norovirus, utilizzando il Metodo EPA 1615. Il metodo utilizza un filtro elettropositivo per la concentrazione dei virus, garantendo un campionamento accurato ed efficiente.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Scienze ambientali
- Microbiologia
- Salute pubblica
Sfondo
- I virus enterici sono patogeni significativi nell'acqua.
- Il Metodo EPA 1615 fornisce una tecnica di campionamento affidabile.
- I filtri elettropositivi migliorano l'efficienza di concentrazione dei virus.
- Una corretta sterilizzazione e gestione sono cruciali per risultati accurati.
Obiettivo dello studio
- Standardizzare il processo di campionamento per i virus enterici nell'acqua.
- Migliorare i tassi di rilevamento di enterovirus e norovirus.
- Fornire linee guida chiare per ricercatori e campionatori sul campo.
Metodi utilizzati
- Montaggio di un apparato di campionamento con protocolli di sterilizzazione.
- Uso di un filtro a cartuccia elettropositivo per la concentrazione dei virus.
- Calibrazione delle portate per un campionamento accurato.
- Raccolta di campioni sul campo con rigorose misure di sterilità.
Risultati principali
- La procedura consente un campionamento efficiente di grandi volumi d'acqua.
- I filtri elettropositivi forniscono un campionamento più rapido rispetto ad altri metodi.
- Mantenere la sterilità è fondamentale per risultati validi.
- Il tracciamento dettagliato dei dati dei campioni aumenta l'affidabilità.
Conclusioni
- Il Metodo EPA 1615 è efficace per il monitoraggio dei virus veicolati dall'acqua.
- Le procedure standardizzate migliorano la qualità e la comparabilità dei dati.
- La formazione e l'aderenza ai protocolli sono essenziali per il successo.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Standardized virus sampling is critical for biopharma R&D in water safety testing, environmental monitoring, and viral clearance studies. EPA Method 1615 provides a reliable, scalable approach for concentrating enteric viruses from large water volumes, supporting predictive risk assessment in biologics manufacturing and water-for-injection systems. The method enables mechanistic de-risking by delivering consistent, quantifiable inputs for downstream infectivity and molecular assays.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral persistence in water systems relevant to biologics production environments.
- Operational Value: Supports standardized sampling across diverse water sources for consistent viral burden assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares concentrated virus samples for downstream infectivity and molecular assays, enabling assay readiness.
- Operational Value: Provides reproducible virus capture via electropositive filtration, reducing variability in viral input for assay development.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Delivers disease-relevant viral samples from environmental sources to support translational biomarker studies.
- Operational Value: Ensures continuity from field sampling to laboratory analysis through standardized volume tracking and cold-chain maintenance.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from environmental sampling to viral quantification, supporting lead identification in antiviral development and preclinical safety evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on viral occurrence and stability in water matrices relevant to manufacturing risk assessment.
- Screening: Enables assay readiness by delivering concentrated, sterile virus samples suitable for infectivity and PCR-based quantification.
- Analytics: Provides quantifiable totalizer-based volume measurements that ensure consistent viral input across experimental conditions.
- Translational Research: Connects environmental sampling to preclinical validation through standardized virus concentration and recovery tracking.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable sampling platform for ongoing water quality monitoring in GMP-adjacent facilities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in viral burden assessment through standardized, reproducible sampling.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across surface and groundwater sources.
- Strategic Value: Informed go/no-go decisions on water system suitability for biologics production, reducing late-stage contamination risk.
- Portfolio Impact: Risk-based prioritization of water treatment strategies based on measurable virus occurrence data.
Implementation Considerations
- Technical expertise in aseptic technique and sterility maintenance during field sampling.
- Instrumentation including flow meter totalizer, electropositive cartridge filters, and temperature-controlled transport.
- Cross-team standardization of volume tracking, flow rate calibration, and sample documentation.
- Adaptation considerations for varying turbidity and water quality conditions affecting filter clogging.
- Practical limitation: filter clogging may prevent achieving target sample volumes, requiring pre-filtration assessment or filter type selection based on water source.
