Name: Slice It Hot: acuta cervello adulto affettare in fisiologica Temperatura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Impara a preparare fette acute di cervello a temperatura fisiologica per esperimenti elettrofisiologici in vitro. Questo metodo semplificato elimina la perfusione intracardiaca e garantisce elevata vitalità del tessuto.

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Vorremmo riconoscere il contributo significativo del Dr. Shiwei Huang (Australian National University) nella convalida del metodo. Inoltre, vorremmo ringraziare la signora Kasia Pietrajtis per gli utili commenti riguardanti le cellule di Golgi e il signor Vitaly Lerner per i dati sperimentali sulla corteccia. Questo lavoro è stato sostenuto da PITN-GA-2009-238686 (CEREBNET), FP7-ICT (REALNET), ELSC e ISF.

Tutte le procedure sperimentali descritte in questo protocollo sono stati approvati dalla cura degli animali della Hebrew University and Use Committee. 1. Preparare le soluzioni e strumenti per affettare <ol><li> Preparare 1 L di soluzione fisiologica standard (SPS) contenente gli ioni descritte nella Tabella 1. <ol><li> Preparare una soluzione madre contenente i sali a 10 volte la concentrazione finale in anticipo in una bottiglia di vetro riempita con memorizzazione 1000 ml di acqua deionizzata (conduttanza 0,055 mS / cm). Aggiungere sali (NaCl, KCl, KH 2 PO 4, e MgSO 4), e mescolare fino a completa dissoluzione. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C. </li><li> Effettuare la soluzione finale SPS il giorno dell&#39;esperimento. Aggiungere 100 ml della soluzione madre a 700 ml di acqua purificata, sciogliere il glucosio (3,6 g) e NaHCO3 (2,18 g) con ancoretta magnetica e quindi aggiungere acqua purificata fino a 1 L. </li><li> Equilibrare i solutiil da dare gas con il 95% O 2/5% di CO 2 per ~ 20 min. Dopo questo, aggiungere 2 ml di 1 M CaCl 2 soluzione. </li></ol></li><li> Montare i seguenti strumenti (Figura 1). <ol><li> Preparare grandi forbici o altro strumento per la decapitazione, piccole forbici chirurgiche per l&#39;apertura del cranio, pinza punta fine per il sollevamento del cranio per esporre il cervello, bisturi con lama per sezionare la parte desiderata del cervello da affettare e una piccola spatola per la manipolazione della parti del cervello sezionato. </li><li> Inoltre, preparare piccoli pezzi di carta da filtro per rimuovere il liquido in eccesso dal cervello, due piccoli piatti di Petri per il cervello per essere sezionati in due bicchieri di vetro 500 ml al contenimento di acqua purificata e riscaldata SPS, e colla cianoacrilato per incollare il cervello al fase di taglio. </li><li> Preparare una piccola spazzola per la manipolazione delle fette durante l&#39;affettatura e una bocca larga pipetta Pasteur di vetro per spostare le fette dal bagno affettare al cha recuperomber. Disinfettare gli strumenti per prevenire la crescita di batteri nei bagni fetta caldi. Inoltre, usare i guanti di laboratorio puliti. </li></ol></li><li> Preparare una camera di recupero fetta sommersa come descritto da Gibb e Edwards 15. Continuamente gas la SPS in esso con il 95% O 2/5% di CO 2 e mantenerlo a 36 ° C. Assicurarsi che la gasazione non si traduca in piccole bolle intrappolate nel bagno che potrebbero danneggiare le fette. </li><li> Caldo ~ 300 ml di SPS a 36 ° C su una piastra riscaldante con agitatore magnetico o in un bagno d&#39;acqua. Se viene usata una piastra di riscaldamento, aver cura di evitare che la soluzione dal surriscaldamento, che può provocare la precipitazione di ioni. Nel caso in cui accade, caldi SPS freschi, invece di raffreddamento del vecchio. </li><li> Portare ~ 500 ml di acqua purificata a bollire con un bollitore elettrico e, in un bicchiere, unire 300 ml di esso con acqua fredda per ottenere acqua leggermente più calda rispetto alla temperatura di taglio. Utilizzare questa riscaldato acqua purificata durante la decapitazione e utilizzare il remaizio del acqua bollita in seguito per mantenere la temperatura fisiologica del bagno affettatura. </li><li> Anestetizzare il mouse iniettando 0,1 ml di pentobarbital (60 mg / ml) per via intraperitoneale. Dopo qualche minuto verificare che l&#39;animale non risponde a forti punta o coda pizzichi per accertare la mancanza di sensibilità. </li></ol> 2. Dissezione del cervello <ol><li> Decapitare il mouse rapidamente tagliando il collo con le grandi forbici vicino alla parte posteriore del cranio, e lasciare che la testa cadere nel bicchiere con acqua purificata riscaldata per lavare via il sangue in eccesso. </li><li> Esporre il foro occipitale nel cranio sotto i muscoli del collo e la pelle, eventualmente rimuovere più del collo con le piccole forbici. </li><li> Tirare la pelle sulla parte superiore del cranio per poter vedere chiaramente le suture cranio per guidare l&#39;apertura del cranio. </li><li> Tagliare il cranio aperto inserendo l&#39;estremità inferiore delle piccole forbici attraverso il foro occipitale e subito li voltandosi versola parte laterale. Tagliare delicatamente lungo il bordo laterale del parietale fino ad una posizione dietro gli occhi e la sutura fronto; quindi, ruotare verso il centro del cranio e tagliare attraverso la linea mediana verso l&#39;altro lato del cranio (vedi linea verde tratteggiata nella Figura 2A). </li><li> Utilizzando pinze punta fine, sollevare il cranio da un angolo fronto-parietale e tirarlo in diagonale su e lateralmente per esporre il cervello (vedi freccia gialla tratteggiata nella Figura 2A). Assicurarsi che il cranio non è collegata a un osso o pelle della testa, in modo che il cervello rimarrà in posizione quando il cranio è sollevato. Nel caso in cui il cervello si sta muovendo con il cranio, utilizzare le piccole forbici per rimuovere qualsiasi tessuto connettivo tra il cranio e il cervello. </li><li> Quando il cervello è esposto, non consentono al cervello di essere asciutta. Quindi, eseguire i passi successivi, mantenendo il cranio e il cervello in una capsula di Petri riempita con riscaldato, gasati SPS. </li><li> Staccare la parte del cervello usata per l&#39;eXperiment dal resto del cervello utilizzando un bisturi e una spatola. In caso di utilizzo del cervelletto, staccare dal prosencefalo da un unico taglio attraverso il mesencefalo e ponte (lungo le linee rosse nelle figure 2B-D) e spostarlo in una piccola scatola di Petri che contiene fresco, gasati SPS. </li><li> Rimuovere il tronco cerebrale per formare una base diritta e larga per incollare il cervello a taglio fase quando affetta cervelletto nel piano orizzontale. Brevemente posizionare il cervelletto su un pezzo di carta da filtro umida in modo che il lato che è stato tagliato dal prosencefalo sia rivolta verso il basso. <ol><li> Tagliare il tronco con un bisturi per formare la base (come indicato con la linea blu nella Figura 2B), e restituire il cervelletto al SPS. Quando sono necessari altri piani di taglio, tagliare il blocco di cervelletto di conseguenza (linee blu nelle Figure 2C e D). </li></ol></li></ol> 3. Affettare il cervello <ol><li> Preparare la fase di taglio per accertare che sia dry, prima di applicare una piccola goccia di colla al centro del palco. </li><li> Sollevare il blocco cervello dal SPS con una spatola con la corretta posizione normale e rimuovere il liquido in eccesso dal cervello utilizzando piccoli pezzi di carta da filtro. Poi, con un unico movimento, far scorrere il cervello dalla spatola sulla goccia di colla sulla scena. </li><li> Per evitare che il cervello da essiccazione e la colla di corsa sui lati del tessuto, applicare alcune gocce di SPS con una pipetta Pasteur e posizionare la fase di taglio nella camera di affettatura. Allineare il blocco cervello in modo che le regioni di interesse (ad esempio, corteccia cerebellare) si trovano ad affrontare la lama e saranno così sottoposti a minor pressione meccanica prima di essere affettato. </li><li> Tagliare ogni fetta secondo le istruzioni del produttore mentre costantemente gassazione SPS nella camera di taglio e mantenendo la temperatura a 34-37 ° C. Mantenere la temperatura della camera di taglio in questa gamma riempiendo il external camera del affettatrice con riscaldata acqua purificata e sostituendo l&#39;acqua ogni volta che la temperatura scende troppo bassa. NOTA: I parametri affettatrici devono essere trovati sperimentalmente per ogni tipo di tessuto e di neuroni che sono in fase di esame. Nel caso del Campden SMZ 700 con lame in ceramica e cellule Golgi cerebellari, utilizzare 0,75 millimetri ampiezza di vibrazione a 65 Hz e velocità di avanzamento pari a 0,05 mm / sec; per i neuroni nucleari cerebellari maggiore ampiezza e frequenza (1 mm e 90 Hz, rispettivamente) e la velocità di avanzamento lento (0,01-0,02 mm / sec) sono raccomandati. Per entrambi Golgi e neuroni cerebellari nucleari, spessore di strato deve essere di 300 micron. </li><li> Durante il taglio, non consentono le fette di ripiegare su se stessi. Per prevenire questo sostenendoli delicatamente con una spazzola morbida, preferibilmente toccando la fetta solo in regioni che non sono di interesse per l&#39;esperimento. Fare attenzione per evitare che il pennello di toccare la lama vibratome; soprattutto nel caso delle lame di ceramica, anche un leggero contattopuò danneggiare la lama. </li><li> Spostare ogni fetta dalla camera di taglio per un recupero / azienda da camera utilizzando una bocca larga, fuoco lucido vetro pipetta Pasteur. </li><li> Lasciare le fette riposare nella camera per almeno 1 ora prima di iniziare l&#39;esperimento. Questo permette di degradazione del danneggiato o morire tessuti e cellule e quindi si traduce in una superficie fetta detergente. Durante la prima ora, mantenere la temperatura del SPS nella camera nell&#39;intervallo 34-36 ° C; in modo che le fette non sono toccati da bolle d&#39;aria che possono danneggiare le fette o farli galleggiare. </li></ol> 4. Esperimento <ol><li> Dopo 1 ora, lasciare che la temperatura della camera di recupero raffreddare a RT (17-25 ° C). NOTA: Questo potrebbe prolungare il periodo di tempo durante il quale le fette possono essere usate rallentando la crescita di batteri e metabolismo cellulare. Questo periodo dipende dalla regione del cervello e del tipo di cellule. Per esempio, alcuni tipi di cellule del Golgi possono essere giudicati sani a fette8 ore dopo il taglio, mentre altri tipi di durare solo 6 ore. </li><li> Dopo 1 ora è passato dal taglio, utilizzare le fette di vari esperimenti di elettrofisiologia. </li></ol>

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<li>Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slices+have+more+synapses+than+perfusion-fixed+hippocampus+from+both+young+and+mature+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats.</a> J. Neurosci. 19, 2876-2886 (1999).</li>
<li>Kirov, S. A., Petrak, L. J., Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines+disappear+with+chilling+but+proliferate+excessively+upon+rewarming+of+mature+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines disappear with chilling but proliferate excessively upon rewarming of mature hippocampus.</a> Neuroscience. 127, 69-80 (2004).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Abbiamo dimostrato un metodo per preparare fettine cerebrali acute da topi nel fisiologica anziché temperatura ghiacciata. E &#39;stato dimostrato 11 che la qualità di fette ottenuti in condizioni calde è superiore rispetto a quelli preparati con freddo, a condizione che la lama affettatrice ha vibrazione verticale minima. Affettare a temperatura fisiologica può impedire artefatti fisiologici causati dalla bassa temperatura, come quelli legati ai cambiamenti nei processi metabolic...

Lo scopo del metodo presentato è quello di ottenere fettine cerebrali acute alta qualità per esperimenti elettrofisiologici in vitro, specialmente quando si usano anche vecchi animali adulti o. Il metodo di taglio cerebrale acuto, come descritto da Skrede e Westgaard 1 in due frasi eleganti, è diventato uno dei fondamenti della moderna ricerca neuroscientifica ed è impiegato in innumerevoli varianti in tutto il mondo. La qualità delle fette si riflette nel numero di neuroni per fetta vivente, il periodo di tempo durante il quale le cellule mantengono le loro proprietà elettrofisiologiche e morfologiche nonché l&#39;integrità del tessuto. Inoltre, la durata massima delle registrazioni stabili dipende dalla qualità delle fette. Così, lungo i decenni, il metodo affettatura originale è stato ulteriormente sviluppato da gruppi di ricerca individuali che permettono di migliorare il recupero fetta dopo il taglio 2-10, spesso complesse modificazioni della composizione di taglio osoluzioni di recupero r (come l&#39;aggiunta di ascorbato, tiourea o H 2 O 2) e intra-cardiaca pre-perfusione dell&#39;animale con soluzioni fisiologiche raffreddate. Come è stato recentemente dimostrato 11, temperatura fisiologica durante l&#39;affettatura sembra essere più vantaggioso di raffreddamento per la salute neuronale; il miglioramento è più evidente quando si lavora con adulti (2-8 mesi) roditori. Evitare sbalzi di temperatura drammatici evita artefatti dovuti a processi dipendenti dalla temperatura nelle cellule, come la plasticità 13 e ioni canali cinetica 13,14. Tali cambiamenti potrebbero influenzare potenziale di membrana e di segnalazione intracellulare di calcio, soglia di picco e picco di forma. Il metodo &quot;a caldo&quot; fetta acuta preparazione qui presentata è una procedura generale per l&#39;ottenimento di fettine di cervello acuto di alta qualità da qualsiasi regione del cervello, tra cui il cervelletto, la corteccia e l&#39;ippocampo, nuclei del tronco cerebrale 16 &lt;/ Sup&gt; e il bulbo olfattivo, sia in ratti e topi. In particolare, la procedura di affettatura temperatura fisiologica richiede che la lama di taglio vibra quasi perfettamente orizzontale ed è senza difetti strutturali. Tale precisione potrebbe non essere raggiungibile con i modelli affettatrice anziani; in tali casi, si consiglia di eseguire la preparazione fetta in condizioni di gelo-freddo come la bassa temperatura sembra rendere il tessuto più resistente ai danni meccanici, anche a costo di aberrazioni metaboliche.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital</td><td>CTS</td><td>170066</td><td>Concentrazione: 60 mg/ml in soluzione fisiologica.</td></tr><tr><td>Forbici grandi&nbsp;</td><td>FST</td><td>14001-16</td><td>Per la decapitazione si possono usare qualsiasi forbice di grandi dimensioni o una ghigliottina con bordi sufficientemente affilati&nbsp;</td></tr><tr><td>Forbici per iride&nbsp;</td><td>Prestige medical</td><td>48,148</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi forbice a punta fine, a condizione che le lame delle forbici non siano più lunghe di 1,5&#8211; 2 cm</td></tr><tr><td>Pinza a punta fine&nbsp;</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>FST</td><td>91003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lama per bisturi #11</td><td>FST</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Spatola piccola&nbsp;</td><td>Pescatore</td><td>2350</td><td></td></tr><tr><td>Carta</td><td></td><td></td> da filtro <td>È possibile utilizzare qualsiasi marca di laboratorio.</td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Duroplan</td><td>Z231509-1</td><td></td></tr><tr><td>Bicchieri di vetro&nbsp;</td><td>Pipetta SCHOT</td><td>10022846</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur&nbsp;</td><td>Foglia d'acero Marca</td><td>14672-029</td><td></td></tr><tr><td>Super colla&nbsp;</td><td>Affettatrice LOCTITE</td><td>4091361/1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Campden</td><td>7000-smz</td><td></td></tr><tr><td>Lama per affettare in ceramica</td><td>Campden</td><td>7550-1-C</td><td></td></tr><tr><td>Riscaldatore/agitatore</td><td></td><td></td> magnetico <td>Per riscaldare l'SPS per la procedura</td></tr><tr><td>Bollitore</td><td></td><td></td> elettrico <td>Per riscaldare l'acqua per il controllo della temperatura</td></tr><tr><td>Camera di recupero fette + unità di riscaldamento</td><td>Warner strumenti</td><td>&nbsp; BSC-HT +&nbsp; Possono</td><td>essere utilizzati anche modelli BSC-BUW autocostruiti.</td></tr><tr><td>Termometro</td><td></td><td></td><td>Per il monitoraggio della temperatura SPS durante la dissezione e l'affettatura</td></tr></tbody></table>

slice it hot: acuta cervello adulto affettare in fisiologica temperatura

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Qui vi presentiamo un protocollo per la preparazione di fettine cerebrali acute. Questa procedura è un elemento critico per elettrofisiologici esperimenti di patch-clamp che determina in larga misura la qualità dei risultati. E &#39;stato dimostrato che omettendo la fase di raffreddamento durante la procedura di taglio è utile nell&#39;ottenere fette e cellule sane, soprattutto quando si tratta di strutture cerebrali altamente mielinizzate da animali adulti. Anche se il meccanismo preciso con cui temperatura elevata per mantenere salute neurale può essere ipotizzato solo dopo, è ovvio che, quando possibile, la temperatura in cui viene eseguito il taglio dovrebbe essere vicino a condizioni fisiologiche per evitare artefatti relativi alla temperatura. Un altro importante vantaggio di questo metodo è la semplicità del procedimento e quindi il tempo di preparazione breve. Nel metodo illustrato topi adulti sono usati ma lo stesso procedimento può essere applicato con i topi più giovani e ratti. Inoltre, le seguenti cl di patchesperimento amplificatore viene eseguita su fettine cerebellari orizzontali, ma lo stesso procedimento può essere utilizzato anche in altri piani, nonché altre aree posteriori del cervello.

Fette preparate nel modo descritto possono essere utilizzati per vari esperimenti elettrofisiologici e optogenetic. Nella Figura 3A e 3C, vi mostriamo un esempio rappresentativo di una fetta cerebellare orizzontale e una fetta coronale cerebrale corticale, rispettivamente, visto sotto interferenza differenziale (DIC) ottiche. Nella fetta cerebellare, diversi tipi di neuroni cerebellari sono facilmente riconoscibili per la loro forma e la posizione delle cellule del corpo, permettendo di...

In questo articolo mostriamo un metodo per preparare fette acute di cervello a temperatura fisiologica, utilizzando una soluzione fisiologica convenzionale senza particolari modifiche per il taglio (come l'aggiunta di saccarosio) e senza perfusione intracardica dell'animale prima della preparazione della fetta.

Slice It Hot: acuta cervello adulto affettare in fisiologica Temperatura

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre fette cerebrali acute di alta qualità. Ciò si ottiene estraendo prima il cervello dall'animale. Il secondo passo consiste nel sezionare la regione del cervello di interesse e attaccarla alla fase di affettatura mantenendola umida con una soluzione di affettatura.Successivamente, il cervello viene immerso in una soluzione di affettatura della temperatura fisiologica. Il passaggio finale è il taglio del cervello in vioma. In definitiva, le fette possono essere utilizzate in vari esperimenti elettrofisiologici in vitro.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'affettatura a freddo ghiacciato, è che è più semplice e produce risultati superiori. In generale, chiunque sia nuovo a questo metodo avrà difficoltà perché richiede che tutti i passaggi siano condotti senza intoppi e rapidamente senza inutili ritardi. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando avevamo bisogno di ottenere fette nucleari cerebellari di alta qualità da animali adulti.Il metodo sarà dimostrato da Le Anri, uno studente del nostro laboratorio prima di iniziare questa procedura. Assicurarsi che lo strumento, gli strumenti e le soluzioni siano preparati in anticipo. La prima tabella mostra la composizione della soluzione fisica standard o SPS in cui il cervello verrà tagliato dopo la preparazione della soluzione di lavoro SPS.Secondo il protocollo scritto, equilibrare la soluzione con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica per 20 minuti, mentre gli SPS Equilibrates organizzano gli strumenti necessari per l'affettatura. Questa figura mostra la disposizione degli strumenti utilizzati per il brain slicing e può essere utilizzata come riferimento visivo quando si imposta la chiave per identificare ogni elemento contenuto nel protocollo scritto. Dopo che l'equilibratura della soluzione di lavoro SPS è completa, aggiungere due millilitri di cloruro di calcio molare all'SPS, quindi decantare circa 300 millilitri di soluzione in un becher.Posizionare il becher contenente SPS su una piastra riscaldante o in un bagnomaria per riscaldarlo a 36 gradi Celsius. Se si utilizza un riscaldatore, assicurarsi di includere un'ancoretta magnetica e assicurarsi che la soluzione non si surriscaldi in quanto ciò causerà la precipitazione del ferro e renderà la soluzione inutilizzabile. Successivamente, fai bollire circa 500 millilitri di acqua purificata in un bollitore elettrico e aggiungilo a un becher contenente 300 millilitri di acqua purificata fresca per ottenere un'acqua leggermente più calda di 36 gradi Celsius dopo aver anestetizzato e decapitato il topo.Secondo i protocolli istituzionalmente approvati, la testa viene sciacquata dal sangue in eccesso nel becher di acqua riscaldata. Quindi usa piccole forbici per esporre il foraminifero e il magnum del cranio e tira indietro la pelle per esporre il cranio e visualizzare meglio le suture del cranio per aprire il cranio. Inserisci la punta delle forbicine attraverso l'avambraccio e il magnum.Girarli immediatamente verso il lato laterale e tagliare delicatamente lungo la sporgenza laterale dell'osso parietale fino a una posizione dietro gli occhi e la sutura parietale frontale. Quindi gira le forbici verso il centro del cranio e taglia la linea mediana fino all'altro lato del cranio. Questo diagramma mostra lo schema completo dei tagli per aprire il cranio.Ora usa una pinza fine per sollevare il cranio dall'angolo parietale frontale e tirarlo verso l'alto in diagonale per esporre il cervello, trasferire il cervello e il cranio rimanente in una capsula di Petri contenente gast caldo. SPS. Quindi usa un bisturi e una spatola per staccare la regione di interesse dal resto del cervello. Qui, un singolo taglio viene praticato sia attraverso il mesencefalo che attraverso il ponte per staccare il cervelletto.La linea rossa su questo schema illustra la posizione del taglio. Sciacquare il cervelletto mettendolo in una seconda piccola capsula di Petri contenente SPS gasato caldo. Quindi trasferisci il cervelletto su un pezzo di carta da filtro bagnata.Usa un bisturi per tagliare il tronco encefalico per formare una base dritta e larga da incollare alla fase di taglio. La linea blu su questo diagramma mostra l'area che sarà cara alla fase di taglio. Infine, rimetti il cervelletto tagliato nella piccola capsula di Petri contenente gas caldo SPS, quindi procedi all'affettatura.Innanzitutto, assicurati che la fase di taglio sia asciutta, quindi applica una piccola goccia di colla cianoacrilica al centro della fase. Quindi usa una sula per sollevare il blocco cerebrale dall'SPS e tampona con un piccolo pezzo di carta da filtro per rimuovere il liquido in eccesso dal cervello. Una volta rimosso il liquido in eccesso, fai scivolare il cervello dalla spatola sulla goccia di colla con un solo movimento.Quindi usa una pasta di animali domestici per applicare alcune gocce di SPS sul cervello. Posizionare la fase di taglio con il cervello attaccato nella camera di affettatura. Allineare il blocco cerebrale in modo che la corteccia cerebellare sia rivolta verso la lama.Ciò garantisce che la regione di interesse sia sottoposta alla minima pressione meccanica prima di essere affettata. Ora, inizia a tagliare il cervello usando il microtomo secondo le istruzioni del produttore, mentre gassa costantemente l'SPS nella camera di taglio durante la procedura di affettatura. Mantenere la temperatura della camera di taglio a 34-37 gradi Celsius riempiendo la camera esterna con acqua purificata riscaldata.Durante l'affettatura, sostenere delicatamente ogni fetta con una spazzola morbida per evitare che si pieghino. Cerca di non toccare la regione di interesse e non lasciare che la spazzola tocchi la lama del vibratore poiché ciò causerà danni alla lama. Utilizzando una pipetta per pasta in vetro lucidato a fuoco a bocca larga, trasferire ogni fetta dalla camera di affettamento a una camera di contenimento contenente SPS gassato in continuo e mantenere a 36 gradi Celsius.Assicurarsi che la gassificazione non provochi piccole bolle intrappolate nella camera che potrebbero danneggiare le fette una volta che il cervello è stato completamente affettato. Lasciare riposare le fette immerse nella camera di contenimento a una temperatura compresa tra 34 e 37 gradi Celsius per almeno un'ora prima di iniziare l'esperimento. Ciò consente la degradazione del tessuto danneggiato e morente, con conseguente pulizia della superficie della fetta.Trascorsa un'ora, lasciare raffreddare la temperatura della camera di recupero a temperatura ambiente. Le fette sono ora pronte per essere utilizzate per gli esperimenti. Questa immagine mostra una fetta cerebellare orizzontale di ottenuta con il metodo dimostrato.Sono indicati i tre strati principali della corteccia cerebellare. GC è lo strato di granuli. PC indica lo strato di cellule bikini e ml.La sostanza bianca dello strato molecolare è etichettata come patch clamp WMA, l'elettrodo è disegnato schematicamente su una cella GOGI, abbreviato GOC. La barra della scala rappresenta 40 micron. Questo è un esempio di registrazione dalla cella GOGI mostrata in precedenza.La registrazione è stata ottenuta con un elettrodo patch clamp. In modalità pinza amperometrica. Il colore nero è una traccia rappresentativa su sei tracce grigie.Qui viene mostrata una fetta corticale cerebrale coronale ottenuta con il metodo dimostrato. Le celle parametalliche corticali sono mostrate insieme a un disegno schematico di un elettrodo patch clamp. Questo è un esempio di registrazione con patch clamp.Nella modalità di clamp di corrente dalla cella parametallica mostrata nell'immagine precedente, la traccia mostra il comportamento tipico di una cellula parametallica corticale. Si prega di prestare attenzione durante questa procedura a monitorare costantemente la temperatura.

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