Isolamento e analisi funzionale dei mitocondri da cellule in coltura e Tissue mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i mitocondri respiranti da cellule in coltura o tessuto di topo, e quindi valutare la forza del loro potenziale di membrana come misura dello stato cellulare. Per le cellule in coltura, ciò si ottiene prima mediante placcatura e poi trattamento delle cellule. Successivamente, le cellule vengono omogeneizzate e l'omogenato viene fatto passare attraverso un ago per rilasciare ulteriormente i mitocondri dalle cellule.

Per il tessuto di topo, il fegato viene asportato dal topo e quindi omogeneizzato su ghiaccio con entrambi i tipi di materiale di partenza. La centrifugazione differenziale viene quindi utilizzata per isolare i mitocondri dal resto del contenuto cellulare. Dopo che i mitocondri sono stati sottoposti ad alcune elaborazioni, inclusa l'aggiunta del colorante fluorescente sensibile al potenziale di membrana, vengono eseguite misurazioni della fluorescenza TMRE per calcolare la forza del potenziale di membrana.

In definitiva, la funzione mitocondriale e le perturbazioni del potenziale di membrana mitocondriale possono essere valutate utilizzando un colorante fluorescente sensibile al potenziale di membrana in combinazione con un lettore di piastre fluorescenti Quando trattato con comuni accoppiatori e inibitori mitocondriali, sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'apoptosi indotta da citochine e sulla disfunzione dei mitocondri in un LS.It può essere applicato anche a qualsiasi altro sistema in cui il confronto tra due o più campioni diversi di ricercato come sano contro malattia o due specie diverse di un animale con tassi metabolici diversi. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. Poiché i mitocondri, le fasi di isolamento sono difficili da imparare.

Questo perché ci sono molte sfumature nell'esecuzione della tecnica che possono essere trascurate nelle sezioni del metodo tradizionale. Iniziare questa procedura con cellule renali embrionali umane in crescita come descritto nel protocollo di testo a 48 ore prima della piastra di trattamento con citochine, 160.000 cellule in un pallone T 1 75 per produrre circa il 70% di densità al momento del trattamento. Quindi il siero affama le cellule 24 ore dopo aspirando il terreno e sostituendolo con lo stesso volume di terreno privo di siero.

Infine, trattare le cellule affamate di siero mediante l'aggiunta di citochine solubilizzate direttamente sul terreno di coltura cellulare per eseguire l'isolamento dei mitocondri. Per prima cosa, aspirare il terreno e lavare due volte le celle di aderenza con 15 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato o PBS. Ogni volta dopo il lavaggio, aspirare il tampone e raschiare il pallone per rimuovere le cellule aderenti dal fondo.

Quindi aggiungere 15 millilitri di un XPBS a ciascun pallone, agitare e trasferire in singoli tubi conici da 15 millilitri su ghiaccio. Una volta terminata la raschiatura, centrifugare le provette per cinque minuti a 700 volte G e quattro gradi Celsius, utilizzando una centrifuga da tavolo con rotore a secchiello oscillante dopo la centrifugazione, aspirare i surnatanti e risus. Sospendi ogni pellet in un millilitro di tampone di isolamento mitocondriale.

Successivamente, combinare entrambe le sospensioni e trasferirle in un piccolo recipiente di vetro per l'omogeneizzazione nei mitocondri risospesi e il tampone di isolamento mitocondriale nel recipiente di vetro fino a quando la soluzione non raggiunge la prima linea Con il pestello attaccato a un trapano, procedere all'omogeneizzazione delle cellule su ghiaccio a velocità media per tre passaggi. Prestare attenzione a rimuovere le bolle d'aria quando si inserisce il pestello nella soluzione, a non rimuovere il pestello sopra il liquido e a utilizzare una velocità costante con passaggi continui. Trasferire la soluzione omogeneizzata in una provetta conica da 50 millilitri.

Quindi aspirare la soluzione in una siringa da tre millilitri utilizzando un ago da 18 gauge, uno in mezzo pollice ed espellerla nuovamente nel tubo conico sul ghiaccio con un ago da 27 gauge da mezzo pollice. Fare attenzione ad espellere la soluzione contro la parete interna del tubo per utilizzare quella forza per la rottura della membrana cellulare. Ripetere i passaggi della siringa per un totale di cinque volte, quindi trasferire la soluzione in una provetta conica da 15 millilitri e centrifugare per cinque minuti a 600 volte G e quattro gradi Celsius in una centrifuga da tavolo utilizzando un rotore a secchiello oscillante.

I mitocondri si trovano nel surnatante dopo questa prima centrifuga a bassa velocità, mentre alcune membrane e cellule intatte vengono pellettate, rimuovono con cura il surnatante e distribuiscono in tre provette da 1,5 millilitri. Quindi centrifugare le tre provette in un rotore ad angolo fisso a 10.000 volte G quattro gradi Celsius per cinque minuti. I mitocondri delle cellule coltivate appaiono di colore biancastro.

Esporta il fegato da ogni animale e metti un XPBS ghiacciato, senza calcio o magnesio per sciacquare via il sangue. Trasferisci il tessuto epatico in un piatto da lontano con ghiaccio e taglialo a pezzi sottili usando una lama di rasoio fresca per un minuto. Quindi, aggiungere il tessuto e il tampone appropriato al recipiente fino a quando il tampone non raggiunge la prima linea.

Procedere all'omogeneizzazione del fazzoletto su ghiaccio con il pestello a mano per cinque passaggi. Prestare attenzione a rimuovere le bolle d'aria quando si inserisce il pestello nella soluzione, a non rimuovere il pestello sopra il liquido e a utilizzare una velocità costante con passaggi continui. Continuare a processare i campioni con centrifugazione e omogeneizzazione come richiesto nel protocollo di testo.

Dopo aver combinato i nuovi surnatanti con il primo surnatante di ciascun campione, centrifugare le provette in un rotore ad angolo fisso a 10.000 volte G quattro gradi Celsius per cinque minuti. Aspirare con cura lo strato bianco soffice superiore utilizzando la punta di una pipetta e/o spingendolo ai lati della provetta. Quindi versare delicatamente il resto del surnatante e risus.

Sospendere i pellet dei mitocondri epatici in 500 microlitri di isolamento mitocondriale. I mitocondri tampone dal fegato sono marroni. Posizionare rapidamente i campioni sul ghiaccio immediatamente prima che le reazioni vengano impostate.

Diluire i mitocondri a 0,5 milligrammi per millilitro. Concentrazione di lavoro con tampone sperimentale. Aggiungere i trattamenti appropriati come elencato nel protocollo di testo per separare i tubi a un decimo del volume totale dei mitocondri diluiti.

Quindi, posizionare i mitocondri diluiti in ciascuna provetta di reazione e agitare delicatamente ciascuna provetta per garantire una miscelazione corretta. Incubare le reazioni sul banco di lavoro per sette minuti. Quindi aggiungere un volume uguale di due micromolari tetraetile, domine a bastoncello, estere etilico, abbreviato TMRE al volume di reazione mitocondriale.

Ancora una volta, agitando delicatamente ogni tubo per garantire una miscelazione corretta. Dopo aver incubato le reazioni sul banco di lavoro per altri sette minuti, pellettare i mitocondri mediante centrifugazione in un rotore ad angolo fisso a 10.000 volte G quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi caricare metà del volume del surnatante di ciascun campione su un 3 84.

La piastra del pozzetto procede a leggere la fluorescenza dei campioni e quindi calcola la differenza di piega nella fluorescenza tra il controllo e ciascun trattamento, come descritto nel protocollo di testo, il trattamento delle cellule T HEK 2, 93 con TNF alfa, IL, un beta e IFN gamma per 24-48 ore porta a quantità progressive di morte cellulare. La vitalità cellulare è stata valutata utilizzando saggi MTT che dimostrano costantemente che vi è una diminuzione di circa il 10% della vitalità cellulare con un trattamento di 24 ore e una diminuzione di circa il 20%. Con un trattamento di 48 ore, le cellule trattate con concentrazioni simili producono risultati di morte cellulare simili a 48 ore.

E il trattamento con singole citochine rivela che la diminuzione della vitalità è dovuta a effetti combinatori. I dati di vitalità rappresentano la deviazione standard media di tre esperimenti separati. Ogni corsa in triplice copia e la tenuta delle barre di errore dimostrano la riproducibilità dei dati.

La percentuale di diminuzione del potenziale di membrana nei mitocondri isolati da cellule trattate con citochine significa che la salute dei mitocondri è stata influenzata dai trattamenti con citochine, corroborando i dati di vitalità A seguito di questa procedura. Altri metodi, come la valutazione di una generazione di TP, di un TP totale o del consumo di ossigeno, possono essere formati per valutare ulteriori domande, come quali differenze di energia e respirazione tra i diversi campioni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i mitocondri funzionali intatti e valutare la forza del loro potenziale di membrana come riflesso dello stato cellulare.