Name: Isolamento, Crioconservazione e Cultura umani Cellule epiteliali Amnion per le applicazioni cliniche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Scopri l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali amniotiche umane senza prodotti animali, conforme alle linee cGMP per applicazioni cliniche e medicina rigenerativa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori riconoscono il sostegno finanziario del Programma di Supporto alle Infrastrutture Operative del Governo del Victoria.

NOTA: placenta dovrebbe essere raccolto da gravidanze sane Singleton, con una preferenza per tagli cesarei elettivi termine. Scritto, consenso informato deve essere dato per la raccolta dei loro placenta. Il tuo comitati etici di ricerca umani dovrebbero approvazione tutta la linea e l&#39;utilizzo di tessuti umani. 1. Isolamento di cellule epiteliali Amnion <ol style="margin-left: 40px;"><li> Posizionare la placenta su una superficie sterile all&#39;interno di una cappa di sicurezza biologica di classe II. </li><li> Utilizzando matasse sterili soluzione salina bilanciata (HBSS), lavare il più sangue possibile dalla superficie della placenta e le membrane. </li><li> Con la placenta disposto con il cordone ombelicale rivolto verso l&#39;alto, separare meccanicamente il bordo esterno delle membrane amnion e corion. </li><li> Una volta separati, striscia manualmente la membrana amniotica dalla membrana corion della placenta, lavorando intorno al bordo della membrana, verso il cordone ombelicale. NOTA: Essere Careful per rimuovere eventuali pezzi di contaminanti membrana chorion dalla membrana amniotica. </li><li> Usando forbici sterili, tagliare la membrana amniotica 2 cm circa dalla base del cordone ombelicale e posto in un contenitore sigillato 500 ml contenente 250 ml HBSS. </li><li> Lavare accuratamente agitando la bottiglia sigillata contenente la membrana amniotica. </li><li> Rimuovere la membrana amniotica dal contenitore di raccolta con pinza sterile, e posto in una capsula di Petri 15 cm. </li><li> Tagliare la membrana amniotica in pezzi lunghi circa 5 cm (se tenuto in verticale con le pinze), scartando i pezzi sanguinosi o strappati. </li><li> Mettere in un contenitore sigillato da 500 ml e lavare con 250 ml HBSS circa 3-5 volte o fino a quando la membrana amniotica diventa traslucida con niente sangue contaminante. NOTA: Qualsiasi sangue presente può ridurre l&#39;efficienza della enzimatica soluzione di analisi. </li><li> Trasferire tutti i pezzi di membrana amniotica in un recipiente contenente 50 ml della soluzione enzimatica digerire, avendo cura diridurre al minimo riporto di HBSS. </li><li> Incubare i pezzi amnion in enzimatica digeriscono soluzione in un bagno d&#39;acqua o camera calda a 37 ° C per 15 minuti con agitazione per rimuovere il sangue residuo. </li><li> Togliere i pezzi di membrana amnion dalla enzimatica digerire soluzione in un nuovo contenitore sterile. </li><li> Aggiungere 100 ml di soluzione enzimatica fresco digerire alla membrana amniotica e incubare a 37 ° C per 60 minuti in un bagno d&#39;acqua o una stanza calda con agitando delicatamente (prima digestione). </li><li> Togliere i pezzi di membrana amnios e inserire in un nuovo contenitore cura presa per consentire alla enzimatica digerire soluzione per drenare da ogni pezzo di membrana. NOTA: Ciò può essere ottenuto trascinando pezzi amnion lungo il bordo interno del contenitore. </li><li> Aggiungere 100 ml di enzimatica fresco digeriscono soluzione ai pezzi di membrana amnios e incubare 60 minuti in un bagno di acqua o camera calda a 37 ° C con un leggero scuotimento (seconda digestione). </li><li> Passare il suspensi cellulareon dal punto 1.14 attraverso un filtro 70 micron e centrifugare a 1000 xg per 10 min. </li><li> Rimuovere e scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 4 ml HBSS contenente 1 mg / inibitore basato soia-ml. Pipettare delicatamente ripetutamente con una pipetta 1 ml per ottenere una sospensione di cellule singole. NOTA: In questa fase le cellule possono essere lasciati in ghiaccio fino cellule dal secondo digest sono nella stessa fase di lavorazione. </li><li> Togliere i pezzi di membrana amnios e inserire in un nuovo contenitore cura presa per consentire alla enzimatica digerire soluzione per drenare da ogni pezzo di membrana. NOTA: Ciò può essere ottenuto trascinando pezzi amnion lungo il bordo interno del contenitore. </li><li> Passare la sospensione cellulare dal punto 1.18 attraverso un filtro 70 micron e centrifugare a 1000 xg per 10 min. </li><li> Rimuovere e scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 4 ml HBSS contenente 1 mg / inibitore basato soia-ml. Pipettare delicatamente ripetutamente con un 1 ml pipette per ottenere una sospensione di cellule singole. </li><li> Cellule piscina dal due digest o in alternativa mantenere digest cellule separate fino a dopo il conteggio delle cellule. NOTA: Questo impedisce la miscelazione di cellule viabilità potenzialmente bassi con cellule di alta redditività. </li><li> Aggiungere HBSS ad un volume finale di 10-20 ml ed eseguire la conta delle cellule utilizzando trypan blu per misurare la vitalità. </li><li> Confermare il fenotipo delle cellule epiteliali mediante citometria a flusso. Make up adeguati cocktail di anticorpi con anti-EpCAM-PE (diluizione 1: 2) anti-CD90-PeCy5 (1: 250) e anti-CD105-APC (1: 100) in HBSS. </li><li> Risospendere un sottoinsieme di cellule da uno o entrambi i digest del cocktail di anticorpi ad una concentrazione di 25 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Per la citometria a flusso, macchia 1 x 10 6 cellule con un cocktail di anticorpi contenenti controlli isotipici (ad es. Controllo-PE IgG 1 isotipo + anti-CD90-PeCy5 + anti-CD105-APC). Mantenere ~ 1 x 10 6 cellule senza macchia per citofluorimetro set-up. </li><li> Incubare cellule anticorpococktail a 4 ° C per 60 min. </li><li> Lavare le cellule 3x in HBSS e risospendere tra i 5 ei 10 milioni di cellule per ml di citometria a flusso. </li><li> Eseguire citometria di flusso e risultati di nota. La purezza del campione isolato cella (la percentuale di EpCAM positive e CD90 / CD105 cellule negative) dovrebbe essere rispettivamente 90-95% e &lt;1%. </li><li> Mettere da parte un adeguato numero di cellule per test di criteri di controllo della qualità o di rilascio appropriate come determinato dall&#39;applicazione finale. NOTA: Questo può includere malattia / di screening virale, o altro di sicurezza o criteri biologici. </li><li> Per le cellule rimanenti, seguire il protocollo di crioconservazione, o in alternativa, inserire direttamente nella cultura (diretta alla cultura passo 3.6). </li></ol> 2. Crioconservazione di hAECs <ol style="margin-left: 40px;"><li> Determinare numero di cellulare e la vitalità con citometria a flusso di dati o di conteggio manuale con trypan esclusione blu. </li><li> Centrifugare a 700 xg per 5 min. </li><li> Cell Risospenderes tra 1-10000000 cellule per ml in animali crioconservazione multimediale gratuito prodotto. </li><li> Pipettare un volume adeguato di cellule in vials crioconservazione O-anelli e posto in un apparato velocità di congelamento controllato dove avviene il raffreddamento a circa 1 ° C / min fino a -80 ° C si ottiene. </li><li> Trasferire fiale in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. </li></ol> 3. scongelamento e Cultura Cyropreserved hAECs <ol style="margin-left: 40px;"><li> Rimuovere le fiale di crioconservazione di azoto liquido e disporli sul ghiaccio. NOTA: solo per il trasferimento - procedere rapidamente alla fase successiva. </li><li> Scongelare le fiale crioconservazione rapidamente a 37 ° C fino a che solo una piccola parte (~ 5 mm x 5 mm) del ghiaccio rimane. NOTA: È importante che la soluzione cella non riscalda per ridurre gli effetti tossici di DMSO nei media crioconservazione. </li><li> Diluire mezzi crioconservazione 10 volte con il freddo (~ 4 ° C), i media senza siero, goccia a goccia in un formato adatto aggiuntod tubo o contenitore. </li><li> Centrifugare a 700 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere in mezzo privo di siero, ad una concentrazione di circa 1 milione di cellule per ml. Determinare numero di cellulare e la vitalità con conteggio automatico o manuale con trypan esclusione blu. Previsto vitalità post-scongelamento sarà 5-10% in meno rispetto redditività pre-crioconservazione. </li><li> Cellule piastra su standard di coltura cellulare trattati e plastico, o in alternativa utilizzare collagene di tipo I per le superfici di cultura cappotto. </li><li> Per tipo I rivestimento collagene seguire il protocollo di seguito <ol><li> Preparare l&#39;acido tipo solubile I collagene dalla placenta umana (15 mg di collagene con 25 ml di acqua deionizzata e 50 ml di acido acetico glaciale). </li><li> Coprire bicchiere con Parafilm e agitazione moderata a 37 ° C fino a filamenti di collagene sono sciolte. </li><li> Soluzione filtro collagene sterile utilizzando un filtro di 0,22 micron. </li><li> Diluire il collagene magazzino 01:10 filtrata con acqua deionizzata. Questa azione diluito è la conce di lavoroSoluzione ntration per superfici di rivestimento in plastica e membrana. </li><li> Collagene plastica cappotto, superfici di vetro e membrana per 2 ore a temperatura ambiente a 37 ° C, o O / N a 2-8 ° C. </li><li> Rimuovere il liquido in eccesso dalla superficie rivestita, e lasciarlo asciugare O / N. </li><li> Risciacquare con acqua di grado colture di tessuti sterili o HBSS prima di introdurre cellule e mezzo. </li></ol></li><li> HAECs piastra a una densità di 25.000 cellule / cm 2 in terreno privo di siero, e consentono il collegamento a verificarsi per 72-96 ore. </li><li> Dopo allegato, cambiare supporto con attenzione aspirare e sostituirli con un opportuno volume di mezzo privo di siero ogni 2-3 giorni. </li><li> Cellule Passage che utilizzano il protocollo di seguito <ol><li> Mezzi di coltura cellulare Aspirare e lavare con il volume di 1x sterile HBSS </li><li> Aggiungere il volume 1x enzimatica digerire soluzione e incubare per 5-15 minuti, o fino a quando le cellule sono osservati staccano dalla superficie di coltura cellulare. </li><li> Raccogliere enzimatica digerire soluzione contenente le cellule, garantendo cells sono staccati dalla superficie coltura cellulare pipettando ripetutamente il enzimatica digerire soluzione contro la superficie di coltura cellulare </li><li> Centrifugare a 700 xg per 5 min. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in un volume adeguato di HBSS contenente 1 mg / inibitore enzimatico a base di soia-ml. Pipettare delicatamente ripetutamente con una pipetta 1 ml per ottenere una sospensione di cellule singole. </li><li> Aggiungere mezzo privo di siero ad una concentrazione approssimativa di 1 milione di cellule / ml. Determinare numero di cellulare e la vitalità con conteggio automatico o manuale con trypan esclusione blu. </li><li> HAECs piastra a una densità di 25.000 cellule / cm 2 in terreno privo di siero, e continuare con i metodi di coltura standard. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurphy%2C+SV+%22Stem+Cells+and+Regenerative+Medicine%22">Stem Cells and Regenerative Medicine</a>. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).</li>
<li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+fluid+and+placental+membranes%3A+unexpected+sources+of+highly+multipotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Reprod.+Med%22%5BJournal%5D)">Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells.</a> Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).</li>
<li>Parolini, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+isolation+and+characterization+of+cells+from+human+term+placenta%3A+outcome+of+the+first+international+Workshop+on+Placenta+Derived+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells.</a> Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).</li>
<li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preterm+human+amnion+epithelial+cells+have+limited+reparative+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential.</a> Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).</li>
<li>Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+pluripotent+stem+cell+line+derived+from+human+amniotic+membranes+and+initiation+of+germ+layers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro.</a> Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).</li>
<li>Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+amniotic+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of amniotic epithelial stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3(2007).</li>
<li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amnion+epithelial+cell+isolation+and+characterization+for+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6(2010).</li>
<li>Ilancheran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+derived+from+human+fetal+membranes+display+multilineage+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential.</a> Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).</li>
<li>Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+amnion+epithelium+into+skin+and+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles.</a> Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).</li>
<li>Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+characteristics+of+amniotic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells.</a> Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).</li>
<li>Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+ocular+surface+with+heterologous+limbal+epithelium+and+amniotic+membrane+in+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model.</a> Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).</li>
<li>Sankar, V., Muthusamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+human+amniotic+epithelial+cell+transplantation+in+spinal+cord+injury+repair+research%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research.</a> Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).</li>
<li>Yuge, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+human+amniotic+epithelial+cells+express+connexin+26+and+Na-K-adenosine+triphosphatase+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear.</a> Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppressive+factors+secreted+by+human+amniotic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amniotic+epithelial+cells+ameliorate+behavioral+dysfunction+and+reduce+infarct+size+in+the+rat+middle+cerebral+artery+occlusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model.</a> Shock. 29 (5), 603-611 (2008).</li>
<li>Venkatachalam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+neurotrophic+factor+secreted+by+amniotic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biocell%22%5BJournal%5D)">Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells.</a> Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).</li>
<li>Manuelpillai, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amniotic+epithelial+cell+transplantation+induces+markers+of+alternative+macrophage+activation+and+reduces+established+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis.</a> PLoS One. 7 (6), e38631(2012).</li>
<li>Wei, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion-isolated+cells+normalize+blood+glucose+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).</li>
<li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion+epithelial+cells+prevent+bleomycin-induced+lung+injury+and+preserve+lung+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function.</a> Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).</li>
<li>Murphy, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion+epithelial+cells+induced+to+express+functional+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> PLoS One. 7 (9), e46533(2012).</li>
<li>Murphy, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion+epithelial+cells+do+not+abrogate+pulmonary+fibrosis+in+mice+with+impaired+macrophage+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function.</a> Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).</li>
<li>Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amnion+epithelial+cells+as+a+candidate+therapy+for+acute+and+chronic+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+Int%22%5BJournal%5D)">Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury.</a> Stem cells Int. 2012, 709763(2012).</li>
<li>Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion+epithelial+cells+mediate+lung+repair+by+directly+modulating+macrophage+recruitment+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization.</a> , (2013).</li>
<li>Litvinov, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule+%28Ep-CAM%29+modulates+cell-cell+interactions+mediated+by+classic+cadherins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).</li>
<li>Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial+cell+adhesion+molecule+%28Ep-CAM%29+as+a+morphoregulatory+molecule+is+a+tool+in+surgical+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology.</a> The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).</li>
<li>Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mesenchymal+stem+cells+obtained+from+different+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues.</a> Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).</li>
<li>Park, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPark%2C+A+%22Newborn+Stem+Cells%3A+Identity%2C+Function%2C+and+Clinical+Potential%22">Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential</a>. , John Wiley & Sons, Inc. 119-137 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ci sono diversi parametri critici che possono avere un impatto significativo per il successo di questa metodologia. Conservazione della placenta o amnion fino a 3 ore prima isolamento di hAECs può essere desiderabile per scopi logistici o di programmazione, ma si raccomanda che il tessuto viene elaborata appena possibile. Se il tessuto deve essere memorizzato, si raccomanda di memorizzazione eseguito in seguito dissezione e lavaggio della membrana amnion. Amnion può essere immagazzinato in HBSS sterili contenenti antibi...

Le cellule derivate da fonti perinatali, come la placenta, membrane placentari, cordone ombelicale e liquido amniotico hanno attirato l&#39;attenzione dei ricercatori e clinici come potenziale fonte di cellule per la medicina rigenerativa 1,2. La ragione di questo interesse è che questi tipi di cellule tutti possiedono un certo grado di plasticità e immunomodulatorie capacità 3, proprietà che sono fondamentali per loro potenziali applicazioni terapeutiche. hAECs sono una popolazione eterogenea epiteliale che può derivare dal termine o pre-termine membrana amniotica 4, fornendo una abbondante fonte potenziale di materiale cellulare rigenerativa. Le proprietà che rendono hAECs accattivanti come terapia cellulare comprendono la multipotenza, bassa immunogenicità, e le proprietà anti-infiammatorie. hAECs sono stati trovati per essere altamente multipotenti sia in vitro che in vivo, in grado di differenziarsi in linee mesodermici (cardiomyocytes, miociti, osteociti, adipociti), lignaggi endodermici (cellule pancreatiche, cellule epatiche, cellule polmonari) e lignaggi ectodermiche (capelli, pelle, cellule neurali e astrociti) 5-10. Rassicurante, nonostante le loro hAECs multipotenza non sembrano né formare tumori o promuovere lo sviluppo del tumore in vivo. Inoltre, hAECs sono immuni privilegiata, esprimendo bassi livelli di classe II antigeni leucociti umani (HLA) 8. La struttura, probabilmente alla base la capacità di eludere rigetto immunitario dopo il trapianto allogenico e xenogenica, come dimostrato in studi che utilizzano scimmie immunitarie competenti, conigli, cavie, topi e maiali 11-13. hAECs visualizzare potenti immunomodulante proprietà immunosoppressive e quindi offrono notevoli vantaggi pratici per le potenziali applicazioni cliniche nella terapia delle malattie autoimmuni. hAECs si ritiene di esercitare le funzioni di immunomodulatori sia sul sistema immunitario innato e adattativo. Sue dei meccanismi proposti, è attraverso la secrezione di fattori immunomodulante 14. Le attuali applicazioni di hAECs in modelli di malattia degli animali pre-clinici comprendono il trattamento di ictus, sclerosi multipla, malattia del fegato, diabete e malattie polmonari croniche e acute. I ricercatori hanno mostrato interesse ad utilizzare hAECs per il trattamento di post-ictus infiammazione del cervello a causa delle loro proprietà uniche. Ci sono prove che hAECs può attraversare la barriera emato-encefalica, dove possono innestare, sopravvivere fino a 60 giorni, differenziarsi in neuroni, diminuire l&#39;infiammazione e promuovere la rigenerazione del tessuto danneggiato del sistema nervoso centrale in modelli animali di malattie neurologiche 15. hAECs offrono la possibilità di individuare e invertire molteplici percorsi patologici che contribuiscono allo sviluppo e la progressione della sclerosi multipla. Ad esempio, i risultati di studi su animali pre-clinici suggeriscono che hAECs fortemente immunosoppressiva epuò potenzialmente indurre tolleranza immunitaria periferica e invertire risposte infiammatorie in corso. hAECs hanno anche dimostrato di avere la capacità di differenziarsi in cellule neurali in vivo e migliorare neurorigenerazione endogena attraverso la secrezione di una vasta gamma di fattori neurotrofici 16. Cellule epiteliali umane e roditori amniotiche hanno già dimostrato la loro efficacia terapeutica per il trattamento della malattia epatica in modelli animali. In un modello di tetracloruro di carbonio induzione danni delle malattie del fegato, il trapianto haec portare ad attecchimento di hAECs vitali nel fegato, accompagnato con una ridotta epatociti apoptosi, e diminuito l&#39;infiammazione epatica e fibrosi 17. hAECs può essere stimolato da fattori pancreatiche espresse compreso insulina e glucosio trasportatori. Diversi studi hanno indagato la possibilità di hAECs per ripristinare i livelli di glucosio nel sangue in topi diabetici 18. Nei topi che ricevehAECs, sia di peso e di glucosio nel sangue i livelli del corpo animale è sceso a livelli normali dopo l&#39;iniezione di cellule. Questi studi presentano un caso forte per l&#39;uso di hAECs per il trattamento del diabete mellito. hAECs hanno un ruolo provata nella prevenzione e riparazione di sperimentale danno polmonare acuto e cronico in modelli neonatali 19 adulti e. Questi studi hanno trovato che hAECs differenziano in vitro in cellule epiteliali polmonari funzionale che esprimono più proteine ​​polmonari associate, tra cui la fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR), il canale ionico che è mutato in pazienti affetti da fibrosi cistica 20. Inoltre, quando hAECs vengono consegnati l&#39;adulto ferito e polmonare neonatale, che esercitano i loro effetti riparatori tramite la modulazione delle cellule immunitarie dell&#39;ospite, riducendo il reclutamento dei leucociti polmonare, tra cui neutrofili, macrofagi e linfociti 21-23. Data la loro abbondanza,record di sicurezza, e le applicazioni cliniche collaudate per più malattie, studi clinici utilizzando hAECs è inevitabile. Con l&#39;obiettivo di accelerare la traduzione di terapie HAEC in sperimentazioni cliniche, abbiamo sviluppato metodi per isolare, criopreservare e hAECs cultura in un modo adatto per la sperimentazione clinica, utilizzando reagenti senza prodotti di origine animale in conformità alle buone pratiche di fabbricazione (cGMP) le linee guida . Abbiamo basato questo protocollo un protocollo precedentemente pubblicato che stavamo usando con successo per isolare hAECs utilizzando reagenti di origine animale 6. Abbiamo modificato il protocollo originale di sostituire i prodotti di origine animale con reagenti privi di prodotti animali, e la successiva ottimizzazione è stata eseguita per ottimizzare il rendimento delle cellule, la vitalità e purezza. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un protocollo che rispettare le norme regolamentari per la produzione di celle per test clinici sull&#39;uomo.

<table><tbody><tr><td>Kit</td><td></td><td></td><td></td>di raccolta</tr><tr><td>Vassoio di strippaggio</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-361B</td><td></td></tr><tr><td>Pinza per medicazione Liberty, appuntita 13 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17329&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Forbici - Affilate/Smussate Dritte</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0562592&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Guanti sterili in lattice&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-014-643&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Abbigliamento</td><td></td><td></td><td></td>protettivo</tr><tr><td>Abbigliamento protettivo (camice)</td><td>U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>Camici isolanti</td><td>U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>Guanti sterili in lattice&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-014-643&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mascherina per uso generico</td><td>Cardinal Health</td><td>AT7511</td><td></td></tr><tr><td>Cofani</td><td>Medline</td><td>CRI1001</td><td></td></tr><tr><td>Copriscarpe</td><td>U-line</td><td>S-7873W</td><td></td></tr><tr><td>Media e reagenti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Soluzione salina bilanciata (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td>senza calcio o magnesio</td></tr><tr><td>TrypZean (prodotto animale... tripsina ricombinante libera)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3449</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina di soia&nbsp; 1g/50mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS5</td><td>BioLife Solutions</td><td>205102</td><td></td></tr><tr><td>Reagente blu di tripano</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EpCam-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130 - 091-253</td><td></td></tr><tr><td>Isotipo PE controllo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-845</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD90-PeCy5</td><td>BD Pharmingen</td><td>555597</td><td></td></tr><tr><td>controllo dell'isotipo PeCy5</td><td>BD Pharmingen</td><td>557224</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD105-APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>562408</td><td></td></tr><tr><td>controllo dell'isotipo APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>340754</td><td></td></tr><tr><td>Collagene di tipo VI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7521</td><td></td></tr><tr><td>Materiali di</td><td></td><td></td><td></td>consumo</tr><tr><td>Pipetta graduata da 50 ml</td><td>BD/Falcon</td><td>356550</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta graduata da 10 ml</td><td>BD/Falcon</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta graduata da 5 ml</td><td>BD/Falcon</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>Provette Falcon da 50 ml</td><td>BD/Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Provette Falcon da 15 ml</td><td>BD/Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Piastre Petri da 15 cm</td><td>Corning</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m filtri</td><td>BD/Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m filters</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Puntali per pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-401</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l Puntali per pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-409</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 20 ml</td><td>BD/Medical</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>Spatola in plastica</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-245-97&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pesatrice in plastica</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-102&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fiale criogeniche</td><td>Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mr Frosty</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Armadio</td><td></td><td></td><td></td> a rischio biologico</tr></tbody></table>

isolamento, crioconservazione e cultura umani cellule epiteliali amnion per le applicazioni cliniche

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Le cellule epiteliali amniologiche umane (hAEC) derivate da membrane amnioiche a termine o pre-termine hanno attirato l'attenzione di ricercatori e medici come potenziale fonte di cellule per la medicina rigenerativa. La ragione di questo interesse è l'evidenza che queste cellule hanno un'elevata capacità di differenziazione multipotente, bassa immunogenicità e funzioni antinfiammatorie. Queste proprietà hanno spinto i ricercatori a studiare il potenziale degli hAEC da utilizzare per trattare una varietà di malattie e disturbi in studi preclinici sugli animali con molto successo.
hAEC hanno trovato ampia applicazione per il trattamento di una serie di malattie e disturbi. Le potenziali applicazioni cliniche degli hAEC includono il trattamento dell'ictus, della sclerosi multipla, delle malattie epatiche, del diabete e delle malattie polmonari croniche e acute. Il passaggio dagli studi preclinici sugli animali agli studi clinici richiede uno standard più elevato di controllo della qualità e sicurezza per i prodotti di terapia cellulare. Per considerazioni sulla sicurezza e sul controllo della qualità, è preferibile che i protocolli di isolamento cellulare utilizzino reagenti privi di prodotti di origine animale. 
Abbiamo sviluppato protocolli per consentire ai ricercatori di isolare, crioconservare e coltivare hAEC utilizzando reagenti privi di prodotti animali. Il vantaggio di questo metodo è che queste cellule possono essere isolate, caratterizzate, crioconservate e coltivate senza il rischio di veicolare agenti patogeni animali potenzialmente dannosi per l'uomo, mantenendo al contempo rese cellulari, vitalità e potenziale di crescita adeguati. Per i ricercatori che passano dagli studi preclinici sugli animali agli studi clinici, queste metodologie accelereranno notevolmente l'approvazione normativa, ridurranno i rischi e miglioreranno la qualità della loro popolazione di cellule terapeutiche.

Quando questa procedura è seguita correttamente, una resa media di 120 milioni di hAECs dovrebbe essere previsto, con un raggio di 80-160,000,000 cellule. Da queste rese, una redditività media di 83 ± 4% può essere previsto. La maggiore resa media e leggermente inferiore redditività nel metodo clinica possono essere dovuti all'attività tripsina superiore prodotto di origine animale, e forse anche a causa della mancanza di proteine ​​del siero. Isolati hAECs hanno un profilo medio della superficie cellulare del 92% EpCAM...

Descriviamo un protocollo per isolare e coltivare cellule epiteliali amniologiche umane (hAEC) utilizzando reagenti privi di prodotti animali in conformità con le attuali linee guida sulle buone pratiche di fabbricazione (cGMP).

Isolamento, Crioconservazione e Cultura umani Cellule epiteliali Amnion per le applicazioni cliniche

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare la popolazione di cellule epiteliali da una membrana amnionica umana. Ciò si ottiene rimuovendo prima la membrana amnionica dalla membrana corionica e la placenta nella seconda fase. La membrana dell'amnio viene lavata da tutte le tracce di sangue e quindi digerita con una soluzione enzimatica di tripsina priva di prodotti animali.Nella fase finale, l'impasto tissutale viene filtrato per raccogliere le cellule epiteliali isolate. In definitiva, la purezza della popolazione di cellule epiteliali amniologiche può essere valutata mediante analisi citofluorimetrica. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che non richiede l'esposizione delle cellule a prodotti animali animali, il che significa che queste cellule sono utili per gli studi clinici.Per isolare le cellule epiteliali dell'amnio, iniziare posizionando la placenta su una superficie sterile all'interno di una cabina di sicurezza biologica di classe due. Quindi utilizzare HBSS sterile per lavare quanto più sangue possibile dalla superficie della placenta. Quindi, posizionare la placenta in modo che il cordone ombelicale e le membrane placentari siano rivolte verso l'alto e rimuovere manualmente la membrana amnionaria dalla membrana corionica della placenta lavorando attorno al bordo della membrana verso il cordone ombelicale.Fare attenzione a rimuovere eventuali pezzi di membrana di corion contaminante dall'amnio, quindi utilizzare forbici sterili per tagliare la membrana dell'amnio a circa due centimetri dalla base del cordone ombelicale e posizionare la membrana in un recipiente da 500 millilitri contenente 250 millilitri di HBSS, sigillare il contenitore e agitarlo accuratamente per lavare il tessuto, e quindi utilizzare una pinza sterile per trasferire la membrana in una capsula di Petri da 15 centimetri. Ora, taglia la membrana in pezzi verticali lunghi cinque centimetri e lava i pezzi altre tre o cinque volte come appena dimostrato fino a quando la membrana diventa traslucida senza sangue contaminante. Quando tutto il sangue è stato rimosso, trasferire i pezzi di tessuto in 50 millilitri di soluzione di digestato enzimatico, prendendo ker per ridurre al minimo il carryover di qualsiasi HBSS e incubare il tessuto amnionico in una stanza calda a 37 gradi Celsius con una leggera agitazione per rimuovere il sangue rimanente dopo 15 minuti, trascinare ogni pezzo lungo il bordo interno del contenitore per drenare la vecchia soluzione digestiva e aggiungere i pezzi a 100 millilitri di soluzione di digestato enzimatico fresco.Dopo un'ora di digestione nelle stesse condizioni, trasferire le membrane in un nuovo contenitore di soluzione Enzymatic Digest. Avendo cura di drenare i tessuti come appena dimostrato e agitare delicatamente le membrane per gli ultimi 60 minuti successivi alla seconda digestione. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 70 micrometri, quindi centrifugare il liquame cellulare per 10 minuti A 1000 Gs e temperatura ambiente, risospendere delicatamente il pellet in quattro millilitri di inibitore enzimatico a base di soia per creare una sospensione cellulare singola, quindi aggiungere HBSS alle cellule fino a un volume finale da 10 a 20 millilitri.Determinare il numero di cellule vitali mediante esclusione triam blue, quindi crioconservare le cellule epiteliali dell'amnio isolate. Per prima cosa, piegateli per cinque minuti a 700 formaggi e a temperatura ambiente. Quindi risospendere il pellet in una volta 10 delle sei o una volta 10 delle settime cellule per millilitro in terreni di crioconservazione privi di prodotti animali e pipettare un volume adeguato di cellule in fiale di crioconservazione con o ring.Infine, posizionare le fiale in un apparecchio di congelamento a velocità controllata in cui il raffreddamento avviene a circa un grado Celsius al minuto fino a raggiungere meno 80 gradi Celsius, quindi trasferire le fiale in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Molti mezzi privi di prodotti di origine animale funzionano in modo adeguato. Tuttavia, la concentrazione ottimale di DMSO è di circa il 5-10%In genere, la vitalità attesa dopo lo scongelamento è del 5-10% inferiore alla vitalità pre-crioconservazione e può essere significativamente maggiore per l'utente inesperto.La coltura cellulare può essere eseguita con cellule epiteliali amnioiche umane per consentire la caratterizzazione o la differenziazione delle cellule per ulteriori analisi a valle, poiché mantengono il loro fenotipo epiteliale in terreni di coltura privi di siero. Oltre a possedere proprietà immunoregolatorie e antinfiammatorie, le cellule epiteliali dell'amnio umano hanno dimostrato di essere altamente multipotenti, in vitro e in vivo, differenziandosi in linee cellulari rappresentative dei tre strati germinali primari dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori per eseguire studi clinici per condizioni come la malattia polmonare e la malattia del trapianto contro l'ospite.

isolation-cryopreservation-culture-human-amnion-epithelial-cells-for

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Dal momento che James Thomson et al sviluppato una tecnica nel 1998 per isolare e far crescere hES in coltura, le cellule per un uso successivo congelamento e scongelamento ed espandere cellule da uno stock congelati sono diventati importanti procedure di routine effettuato in colture cellulari hES. Dato che le cellule hES sono molto sensibili alle sollecitazioni di gelo e disgelo, particolare cura deve intraprendere. Qui mostriamo la tecnica adeguata per il rapido scongelamento cellule hES...

Congelamento e scongelamento cellule staminali embrionali umane

Questo protocollo descrive la riprogrammazione di primaria amniotico liquido e membrana di cellule staminali mesenchimali in cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un approccio episomal non-integrazione in condizioni completamente chimicamente definite. Procedure di estrazione, cultura, riprogrammazione e caratterizzazione delle cellule staminali pluripotenti indotte risultanti dai rigorosi metodi sono dettagliate.

Riprogrammazione primario del liquido amniotico e le celle a membrana di pluripotenza in condizioni prive di Xeno

Questo studio presenta una procedura convalidata e ottimizzata per l'isolamento e la coltura delle cellule stromali dell'endometrio umane per condurre l'analisi in vitro decidualizzazione. Inoltre, questo studio fornisce un metodo dettagliato per atterramento in modo efficiente un gene specifico utilizzando siRNA in cellule stromal dell'endometrio umane.

Isolamento delle cellule stromali dell'endometrio umane per In Vitro decidualizzazione

Questo protocollo descrive l'isolamento delle cellule epiteliali da diverse regioni anatomiche della membrana amniotica umana per determinarne l'eterogeneità e le proprietà funzionali per una possibile applicazione nei modelli clinici e fisiopatologici.

Cultura in vitro di cellule epiteliali provenienti da diverse regioni anatomiche della membrana amniotica umana

Qui, descriviamo un metodo per riscaldare le blastocisti umani vetrificati, maficandoli attraverso il periodo di impianto in vitro, digerindoli in singole cellule e raccogliendo cellule trofoblaste precoci per ulteriori indagini.

Raccolta a cella singola di cellule di trofoblasto in peri-impianto Stadio Embrioni Umani

Il presente studio riporta un protocollo per lo screening cromosomico di embrioni umani che utilizza un terreno di coltura esausto, che evita la biopsia embrionale e consente l'identificazione della ploidia cromosomica utilizzando NGS. Il presente articolo presenta la procedura dettagliata, compresa la preparazione del terreno di coltura, l'amplificazione dell'intero genoma (WGA), la preparazione della libreria di sequenziamento di nuova generazione (NGS) e l'analisi dei dati.

Screening cromosomico di embrioni umani preimpianto mediante l'utilizzo di terreno di coltura esausto: raccolta del campione e analisi della ploidia cromosomica

Qui descriviamo l'isolamento, l'amplificazione e la differenziazione delle cellule epiteliali nasali umane primarie (HNE) all'interfaccia aria-liquido e un protocollo di biobanking che consente di congelare e quindi scongelare con successo l'HNE amplificato. Il protocollo analizza le proprietà elettrofisiologiche delle cellule HNE differenziate e la correzione della secrezione di cloruro correlata al CFTR su diversi trattamenti modulatori.

Cellule epiteliali nasali umane primarie: biobanking nel contesto della medicina di precisione

Questo studio fornisce un protocollo dettagliato per l'efficiente crioconservazione delle cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali umane.

Crioconservazione di cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali embrionali umane allo stadio ottimale

Il presente studio riporta un protocollo più semplice, rapido ed economico per isolare e far crescere in modo efficiente le cellule epiteliali mammarie umane primarie (HMEC) da piccole quantità di tessuto mammario. Questo protocollo è adatto per la produzione rapida di HMEC primari sia per applicazioni di laboratorio che cliniche.

Isolamento e coltura di cellule epiteliali mammarie umane primarie

Questo protocollo descrive un nuovo modello di coltura tridimensionale (3D) che utilizza un idrogel di acido ialuronico legato alla tiramina per incapsulare e coltivare follicoli preantrali dall'ovaio di topo. Descriviamo anche due approcci alla crioconservazione del follicolo ovarico mediante vitrificazione.

Applicazione di un nuovo idrogel di acido ialuronico per la coltura tridimensionale dei follicoli e metodologia per la crioconservazione dei follicoli ovarici di topo

Scopri l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali amniotiche umane senza prodotti animali, conforme alle linee cGMP per applicazioni cliniche e medicina rigenerativa.

Isolamento, Crioconservazione e Cultura umani Cellule epiteliali Amnion per le applicazioni cliniche

Esplora altri video