L'isolamento potenziato Hsp104 Varianti Utilizzando lievito Proteinopathy modelle

Lo scopo del seguente esperimento è quello di selezionare librerie HS P 1 0 4 per la selezione di varianti che sopprimono la tossicità delle proteine associate ai disturbi del misfolding proteico. Ciò si ottiene trasformando co-trasformando HSP 1 0 4 librerie di varianti con un substrato associato alla malattia nel lievito e nel coex che esprime le due proteine come secondo passo. I lieviti selezionati vengono trattati con cinque acido fluorurgico o cinque FOA per controselezionare il plasmide HSP 1 0 4.

Successivamente, i risultati vengono sequenziati amplificando la regione mutagena mediante PCR di colonia o identificazione delle mutazioni nel gene HSP 1 0 4. In definitiva, la soppressione della tossicità del substrato associato alla malattia può essere valutata per identificare le varianti HS P 1 0 4 che sono più promettenti per un'ulteriore caratterizzazione. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le selezioni basate sul legame, è che questa tecnica consente la selezione di varianti che sopprimono la tossicità del substrato associato alla malattia.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del ripiegamento delle proteine, identificando le proteine che possono invertire il ripiegamento errato delle proteine. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul potenziamento dell'HS P 1 0 4, può anche essere applicato alle librerie di screening di qualsiasi proteina per la soppressione della tossicità di qualsiasi substrato tossico nel lievito. In generale, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché molte colonie potrebbero aver bisogno di essere sottoposte a screening per trovare risultati validi. Per lo screening della soppressione della tossicità della protea, iniziare lavando le colonie HSP 1 0 4 dalle piastre con terreni di caduta integrati con raffinosio, una pipetta sierologica e legno sterile e gli applicatori trasferiscono i lavaggi liquidi in un tubo conico da 50 millilitri e agitano accuratamente le colonie per separare eventuali grumi cellulari.

Successivamente, diluire la sospensione cellulare in una coltura leggermente torbida e far crescere le cellule durante la notte in terreno di dropout Raffinose agitando a 30 gradi Celsius. Coltiva anche i controlli HSP 1 0 4 wild type e vector in parallelo in questo momento. La mattina seguente la piastra, una gamma di concentrazioni cellulari su singole piastre di galattosio per generare almeno una piastra per gruppo con singole colonie.

Normalizzare le impostazioni cultura vettoriali e HSP 1 0 4 con OD 600 della libreria e della piastra. Volumi uguali di queste cellule alle concentrazioni del ceppo sperimentale per confrontare la crescita della libreria rispetto ai controlli per valutare la selezione. Il rigore impiatta anche la libreria su terreni di repressore del glucosio e quindi incuba tutte le piastre per due o tre giorni a 30 gradi Celsius fino a quando le colonie sembrano utilizzare cinque FOA per la selezione delle cellule, che non mantengono più i plasmidi che esprimono HSP 1 0 4 e successivamente strisciano le singole colonie da ciascun ceppo in duplicato su piastre di terreno a doppia e singola caduta per incubazione notturna a 30 gradi Celsius.

Queste piastre verranno utilizzate per il sequenziamento successivo per evitare che le piastre si secchino. Avvolgere le piastre SD sibilanti Euro in una pellicola para e installarle a quattro gradi Celsius mentre si eseguono i cinque schermi FOA. Quindi strisciare le colonie dalle piastre di sibilo SD a singole colonie su cinque piastre FOA per un'incubazione di uno o due giorni a 30 gradi Celsius fino a quando non compaiono singole colonie. Prossimo.

Da ogni cinque piastre FOA, selezionare e strisciare. Tre colonie sopravvissute su una SD Euro e una SD his plate per colonia sopravvissuta dopo altri uno o due giorni di incubazione a 30 gradi Celsius. Le colonie che hanno perso il plasmide HSP 1 0 4 cresceranno su piastre sibilanti SD, ma non su piastre SD Euro.

Coltiva queste varietà fino alla saturazione in terreni di abbandono del raffinosio nel 96. Piastre profonde da due millilitri durante la notte a 30 gradi Celsius con agitazione. Quindi, per eliminare eventuali falsi positivi, eseguire un test di spotting.

Verso la fine dell'incubazione c'è una pipetta multicanale per aliquotare 200 microlitri di terreno di dispersione del raffinosio per pozzetto in una nuova piastra da 96 pozzetti, riservando le colonne uno e sette per le colture pulite. Successivamente, aliquotare 250 microlitri di ciascuna delle 16 colture sature nelle colonne uno e sette della piastra e diluire in serie le colture cinque volte in ciascuna colonna della piastra, mescolando accuratamente con la pipetta multicanale. Quindi, per garantire una smacchiatura uniforme, rimuovere 50 microlitri della coltura diluita dalle colonne sei e 12 per garantire che il volume finale di ciascun pozzetto sia di 200 microlitri.

Quindi utilizzare uno strumento replicatore a 96 volt per individuare le colture in duplicato su piastre di sibilo SD ed escali. Dopo un'incubazione di due o tre giorni a 30 gradi Celsius, selezionare i ceppi di sequenziamento che mostrano tossicità sulle placche sibilanti dell'esca. Simile a quello dei ceppi falsi positivi dei controlli, che non sono così tossici come i controlli possono essere scartati.

Scartare anche i ceppi che presentano un difetto di crescita sulla sd. Le sue piastre o che presentano una tossicità sostanzialmente maggiore rispetto al solo substrato della malattia. Per sequenziare le varianti HSP 1 0 4 mediante PCR a colonia, prima raschiare circa 10 microlitri di lievito dalle piastre Euro sibilanti SD in tre microlitri di idrossido di sodio da 20 milli in provette spogliate dalla PCR per limare le cellule mediante congelamento, disgelo.

Per prima cosa metti le strisce in un congelatore a meno 80 gradi Celsius. Dopo 10 minuti nel congelatore, incubare le provette a 99 gradi Celsius nel termociclatore per 10 minuti, quindi diluire i ceppi a 100 microlitri con acqua di grado PCR utilizzando un'alta concentrazione di primer. Successivamente, eseguire un programma PCR standard sui campioni, quindi analizzare i campioni mediante elettroforesi agel per confermare l'amplificazione del prodotto A PCR della dimensione appropriata.

Infine, sequenziare i prodotti della PCR avendo cura di analizzare a fondo i cromatogrammi di sequenziamento per le mutazioni. Le mutazioni possono essere osservate come una miscela di due nucleotidi in un determinato sito, poiché il lievito spesso ospita più plasmidi. In questo esperimento rappresentativo, dopo la costruzione di una libreria di varianti di HSP 1 0 4 randomizzate nel dominio medio, la libreria è stata trasformata in lievito contenente un plasmide per l'espressione inducibile del TDP 43 con galattosio

I trasformanti sono stati quindi recuperati e piastrati su piastre di glucosio e galattosio per valutare il rigore dello schermo I colpi sono stati selezionati dalla piastra di galattosio. Dopo cinque saggi di individuazione del trattamento FOA di un sottogruppo delle varianti selezionate nello screening iniziale. Ha indicato che delle quattro colonie selezionate, due mostravano HSP 1 0 4, mediava la soppressione della tossicità TDP 43.

Uno era un falso positivo e l'altro mostrava una maggiore tossicità. Dopo cinque trattamenti con FOA, i due veri successi sono stati sequenziati mediante PCR di colonia per identificare le mutazioni del dominio medio. Queste mutazioni HS P 1 0 4 possono quindi essere effettuate nel plasmide HSP 1 0 4 parentale per mutagenesi sito-diretta per confermare la loro soppressione della tossicità. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per eseguire lo screening fino a 200 risultati alla volta nei cinque FO, un passaggio nel corso di una o due settimane se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante analizzare attentamente i risultati del sequenziamento poiché spesso si ottengono miscele di plasmidi seguendo questa procedura. Altri metodi, come la microscopia a fluorescenza, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio: in che modo le varianti HSP 1 0 4 influenzano l'aggregazione del substrato associato alla malattia? Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esaminare le librerie di HSP 1 0 4 varianti per la selezione dei soppressori di tossicità.