In vivo e in vitro Allevamento di Nematodi entomopatogeni (Steinernematidae e Heterorhabditidae)

L'obiettivo di questa presentazione è quello di dimostrare in vivo e in vitro tecniche per l'allevamento di nematodi entomopatogeni. Metodi in vivo considerano l'allevamento di questi nematodi con un host insetto, mentre i metodi in vitro utilizzano rich media agar.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dimostrare tecniche in vivo e in vitro per l'allevamento di nematodi enteropatogeni. Il metodo in vivo si ottiene incubando prima le larve di stadio della falena della cera maggiore garia melanoma con sospensione giovanile infettiva o IJ. Successivamente, i cadaveri infetti da nematodi vengono trasferiti in una trappola bianca modificata in modo che possano essere raccolti.

Il metodo di coltura in vitro viene eseguito riparando prima le piastre di agar epatiche, renali o lipidiche e i batteri simbiotici desiderati vengono eliminati. Quindi la sospensione IJ viene aggiunta alle piastre e i nematodi possono svilupparsi. Infine, la capsula di agar viene trasferita in una trappola bianca modificata per la raccolta dei nematodi.

In definitiva, queste tecniche stabiliscono con successo colture EPN e costituiscono anche la base per altri saggi biologici che utilizzano questi organismi per la ricerca. I metodi inbivo e in vitro mostrati in questa presentazione possono essere utilizzati non solo per la ricerca con nematodi patogeni, ma anche per una vasta gamma di esperimenti volti a comprendere ProCard e le interazioni aeree. A dimostrare le procedure sarà John McMullen, studente laureato nel mio laboratorio.

Per iniziare l'allevamento in vivo di nematodi enteropatogeni, capovolgere una capsula di Petri di plastica di 100 x 15 millimetri e posizionare due dischi di carta da filtro nel coperchio della capsula per distribuire uniformemente un millilitro di sospensione infettiva giovanile o IJ. Sulla carta da filtro, aggiungi 10 larve di stella della falena della cera maggiore garia melanoma al piatto per creare circa 100-200 IJs pal lava. Copri il coperchio con il fondo della capsula di Petri ed etichettala.

Quindi posizionare il piatto all'interno di un sacchetto di plastica, chiuderlo ermeticamente e incubarlo al buio tra i 20 e i 25 gradi Celsius. Dopo tre-cinque giorni, rimuovere i cadaveri con segni di infezione da nematodi in una trappola bianca modificata per eseguire il metodo del rene epatico per l'allevamento in vitro di nematodi con i loro batteri. Tritate il fegato e i reni a pezzetti e metteteli in un frullatore con il cloruro di sodio, l'agar e 300 millilitri di acqua frullate fino a quando la carne non diventa una polpa liquida, una pasta densa o una purea.

Trasferire il composto in un pallone Meyer e utilizzare 200 millilitri di acqua per sciacquare il recipiente del frullatore. Decantare il terreno nel pallone. Autoclavare la miscela per 15 minuti a 121 gradi Celsius.

Versare circa 20 millilitri di agar in piastre di Petri da cinque o sei centimetri e lasciare solidificare l'agar prima di riporre le piastre a quattro gradi Celsius fino al momento del bisogno. Per preparare i nematodi utilizzando il metodo dell'agar lipidico, striare i batteri simbiotici desiderati su una piastra di agar lipidico e incubare le piastre al buio tra 20 e 25 gradi Celsius per 24-48 ore. Il giorno successivo a circa 0,4 millilitri di sospensione di nematodi sterilizzata in superficie composta da uova o giovani infettivi, e incubare le piastre a temperatura ambiente al buio o in un'incubatrice a 23 gradi più o meno tre gradi Celsius.

Monitorare quotidianamente le colture per la generazione di IJ, che dovrebbe avvenire in circa 12 giorni. Non appena si vedono i nematodi, strisciano sui lati del piatto sotto una cappa di flusso a lamina. Raccoglili trasferendo il fondo del piatto con l'agar in una trappola bianca modificata.

Quando gli IJ emergono dalla trappola bianca, raccoglierli e utilizzare acqua sterilizzata per sciacquare la sospensione di IJ. Per rimuovere eventuali detriti medi, conservare gli IJ in acqua distillata sterilizzata a 10 gradi Celsius al freddo, oppure utilizzarli immediatamente utilizzando gli IJ nella specie di nematode desiderata. Infettare da 10 a 20 larve di gella o abbastanza per produrre il numero desiderato di uova.

Dopo tre o quattro giorni, raccogli i cadaveri. Mettere ogni cadavere singolarmente in una capsula di Petri con soluzione salina o tampone M nove. Per sezionare un cadavere, usa una pinza a punta fine per tirare la testa.

Usa un ago sottile a forma di L per raccogliere almeno 20 femmine GRD con uova e mettile in un vetro da orologio contenente 10 millilitri di tampone M nine. Dopo aver preparato una soluzione ionizzante secondo il protocollo di testo, utilizzare il tampone M nine per sciacquare le femmine almeno tre volte riempiendo il vetro dell'orologio con il tampone e aspirando accuratamente la soluzione. Quindi, aggiungi immediatamente la soluzione ionizzante e lascia che le femmine rimangano nella soluzione per non più di 10-15 minuti.

Per accelerare il processo di disintegrazione, usa un ago o un bisturi per tagliare i corpi femminili. Rimuovere le uova pipettandole in provette da microcentrifuga. Per rimuovere ulteriormente il tessuto nematode attaccato alle uova, utilizzare un'impostazione ad alta velocità per far vorticare i tubi per 15 secondi.

In alternativa, pipettare la soluzione su e giù più volte Dopo aver pellettato le uova a circa 18.000 g per due minuti. Rimuovere la soluzione ionizzante prima di utilizzare acqua distillata sterile per sciacquare le uova due volte. Centrifugare il tempo finale a 900 G per un minuto.

Quindi sospendere le uova in 300-500 microlitri di acqua distillata sterile e metterle in una capsula di Petri sterile di tre centimetri o sterilizzata. Vetro dell'orologio. Esamina le uova al microscopio da dissezione con un ingrandimento da 30 a 50 x per confermare che siano intatte prima di trasferirle su una piastra di cinque centimetri.

Con agar renale epatico. Conservare le targhette etichettate in posizione verticale al buio a 28 gradi Celsius. L'uovo dovrebbe schiudersi durante la notte, osservare periodicamente i piatti e scartare tutti i piatti che mostrano segni di contaminazione fungina o batterica.

Una volta che si vedono gli IJ, che migrano lungo la parete della capsula di Petri, rimuovere il coperchio e trasferire la piastra di agar in una trappola bianca modificata. Il metodo di allevamento in vivo utilizza insetti vivi come ospiti per la crescita e la riproduzione dei nematodi. Qui è mostrata una camera di infezione con le larve dell'ultimo stadio della falena della cera maggiore Garia, Melan Ella.

Questa figura mostra il metodo di allevamento in vitro utilizzando una piastra di agar lipidico con stadi di nematodi femmina matura. La presenza di goccioline lipidiche nell'agar è molto comune e di solito non interferiscono con la crescita o la maturazione dei nematodi. In questa figura, si vedono gli IJ strisciare sul lato di una placca renale epatica.

Uno svantaggio di questo metodo è che è soggetto a contaminazione con batteri o funghi a causa della natura ricca del substrato visto qui come una piastra renale epatica con nematodi Steiner ne in una trappola bianca modificata per la raccolta della progenie di IJ. In questa trappola, gli stadi IJ dei nematodi migreranno verso l'acqua dove possono essere raccolti per l'uso negli esperimenti o essere conservati fino al momento del bisogno. Per l'allevamento di nematodi simbionti APO, si raccomanda di macinare gli IJ e LB e di placcare la sospensione su terreno NBTA per confermare ulteriormente l'assenza del simbiante batterico.

Gli utenti devono essere consapevoli del fatto che la classificazione dei nematodi patogeni senza la loro simbianza batterica su più generazioni può avere implicazioni sulla sopravvivenza e la riproduzione dei nematodi nel tempo.