Name: Large-Scale Purificazione di suino o bovino fotorecettore Outer Segmenti per fagocitosi saggi su cellule retiniche dellepitelio pigmentato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Impara la purificazione su larga scala di segmenti esterni dei fotorecettori da retina suina o bovina per saggi di fagocitosi su cellule dell'epitelio pigmentato retinico. Questo metodo consente di studiare l'attività fagocitaria ritmica.

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Questo lavoro è stato sostenuto da Agence Nationale de la Recherche (Jeunes Chercheuses / Jeunes Chercheurs a EFN), Fondation Voir et Entendre e Fondation Bettencourt Schueller (Young Investigator Grants a EFN), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, posizione permanente per EFN) , e il National Eye Institute dei National Institutes of Health (R01-EY13295 a SCF). Inoltre, l&#39;Institut de la Vision è finanziato dal Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Pierre et Marie Curie di Parigi-6, Centre National de la Recherche Scientifique e attrezzature de Paris.

Questo esperimento di isolamento POS richiede tempo e può richiedere fino a 12 ore per completare se POS sono etichettati prima di riporlo. Il protocollo è stato adattato da un documento pubblicato da RS Molday e colleghi nel 1987 31 e modificato da SC Finnemann e colleghi nel 1997 10. Gli animali sono stati trattati secondo l&#39;Associazione per la Ricerca e la Visione e Ophthalmology (ARVO) Dichiarazione per l&#39;uso di animali in Oftalmica e Vision Research. Protocolli sono stati esaminati e approvati dal Comitato Etico Charles Darwin dell&#39;Università Pierre e Marie Curie di Parigi-06 e la Istituzionale Animal Care and Use Committee Fordham University. 1. Generale Set Up <ol><li> Ottenere 80 fresche di maiale o vacca occhi fresco come appena dopo la macellazione possibile e tenerli freddo al buio. Fornire istruzioni al provider così l&#39;azienda procede nello stesso modo. Questo protocollo è ottimizzato per 80 occhi. Aprocedere con più occhi e ottenere scorte più grandi (ad esempio, dal 160 occhi), il doppio della quantità di soluzione ed effettuare 2 giri di ultracentrifugazione; campioni piscina più tardi nella fase di raccolta (vedi punto 2.2.2). </li><li> Impostare sulla panchina della lampada luce di sicurezza rossa, tamponi assorbenti, salviette (tavolo Materials). Preparare 15 centimetri piatti e sacchetti per la raccolta dei rifiuti a rischio biologico (parti dell&#39;occhio inutilizzato, vetrose ...). Indossare aderente labcoat, guanti, protezioni maniche e occhiali. </li><li> Precauzioni: <ol><li> Pre-raffreddare tutte le soluzioni poi tenerli freddo durante tutte le fasi. Mantenere occhi e gradienti raffreddata su ghiaccio per quanto possibile. </li><li> Mantenere occhi e tessuti derivati ​​nel buio più possibile fino alla fase di raccolta dopo l&#39;ultracentrifugazione per evitare photobleaching di pigmenti visivi e della perdita del colore rosa-arancio della forma attiva della fotopigmenti. </li></ol></li></ol> 2. Protocollo Azioni <ol><li> Preparare soluzioni e gradienti: <ol><li> Taurina Thaw magazzino completamente con un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Preparare tutte le soluzioni di soluzioni madre (Tabella 1, soluzioni di archivio) e mescolare bene il saccarosio con altri ingredienti con un agitatore magnetico per ogni soluzione. <ol><li> Preparare 15 ml della soluzione di omogeneizzazione ad una concentrazione finale del 20% di saccarosio, 20 mM Tris pH7.2 acetato, 2 mM MgCl 2, 10 mM glucosio e taurina 5 mM. </li><li> Preparare la soluzione di saccarosio al 25% ad una concentrazione finale del 25% di saccarosio (utilizzando 70% stock saccarosio), 20 mM tris acetato pH 7,2, glucosio 10 mM e taurina 5 mM. </li><li> Preparare la soluzione di saccarosio al 60% ad una concentrazione finale del 60% di saccarosio (utilizzando polvere saccarosio), 20 mM Tris pH7.2 acetato, glucosio 10 mM e taurina 5 mM. </li><li> Preparare la soluzione di lavaggio 1 per una concentrazione finale di 20 mM acetato tris pH 7,2 e 5 taurina mm. </li><li> Preparare la soluzione di lavaggio 2ad una concentrazione finale del 10% di saccarosio, 20 mM Tris acetato pH 7,2 e 5 mM taurina. </li><li> Preparare la soluzione di lavaggio 3 ad una concentrazione finale del 10% di saccarosio, 20 mM sodio fosfato pH 7,2 taurina e 5 mM. </li></ol></li><li> Fissa Il creatore gradiente su un agitatore magnetico e inserire una ancoretta nella camera vicina all&#39;uscita cui verrà inserita la soluzione al 60%. Utilizzare una cut-off punta P200 pipetta posto all&#39;uscita del tubo per ottenere la corretta velocità di colata. </li><li> Cast gradienti lineari delicatamente diluendo e agitando la soluzione di saccarosio del 60% a quello del 25% con 12 ml di ciascuna soluzione (cioè, totale 6 tubi per 80 occhi) in tubi ultracentrifuga pre-refrigerati. Mescolare bene la soluzione di saccarosio gradualmente-diluizione del 60%. Stazionario il gradiente di velocità del flusso, versando la soluzione uniformemente e non troppo veloce. NOTA: Al fine di ottenere un continuo, gradiente lineare, mantenere l&#39;apertura puntale destra alla superficie della soluzione per l&#39;intero gradiente formation. </li><li> Lasciate che i gradienti sedersi sul ghiaccio per circa 1 ora per la stabilizzazione. Tenere i gradienti refrigerate fino caricato. Non agitare le provette per evitare di disturbare il gradiente. </li></ol></li><li> Collezione Tessuto: <ol><li> Raccogliere tessuti sotto fioca luce rossa. Dai un occhio in una mano e colpire la parte anteriore con bordo di lama di rasoio tenendo l&#39;occhio lontano (per evitare spruzzi; Figura 1). Utilizzare la lama di rasoio per tagliare il bulbo oculare anteriore in 2 metà (cornea più di almeno 5 mm nella sclera). Rimuovere la lente e capovolgere l&#39;oculare dentro e fuori in modo che possa essere tenuto sopra la punta di un dito esponendo così la retina. </li><li> Utilizzando la lama di rasoio in un angolo, raschiare delicatamente la retina, staccando facilmente e costituirsi strato rosata, la superficie tapetum tagliati a testa del nervo ottico (Figura 1). Raccogliere tutte le retine in 2 x 50 ml tubetti contenenti ciascuno 15 ml di soluzione di omogeneizzazione sul ghiaccio. </li><li> Homo Retinagenization: <ol><li> Agitare la sospensione vigorosamente a mano per 2 minuti per interrompere i diversi strati cellulari, rompere POS fuori dal resto della cellula PR, frammento POS e omogeneizzare la sospensione retina. </li><li> Filtro 3x attraverso un doppio strato di garza pulita per rimuovere frammenti di tessuto di grandi dimensioni e raccogliere il flusso continuo in clean 50 ml tubi (Figura 1). La sospensione della retina di essere abbastanza spessa, per massimizzare la resa, premere delicatamente sulla garza per rilasciare rimanenti tessuti frammentati dopo ogni filtrazione. </li></ol></li></ol></li><li> Fotorecettore esterno frammento segmento (POS) isolamento: <ol><li> Adagiare la retina preparazione greggio, intorno 6-7 ml per provetta, oltre 6 x 30 ml tubi ultracentrifuga ciascuno contenente 24 ml di fresche refrigerate continua 25 - 60% di saccarosio gradiente (Figura 1). Bilanciare i tubi opposte come appropriato per essere utilizzato il rotore. Ultracentrifuga a 106.000 xg per 50 min a 4 ° C. </li&gt; <li> Rimuovere la maggior parte della soluzione sopra la banda rosa-arancio nel terzo superiore del gradiente per aspirazione (Figura 2A). Raccogliere la banda rosa-arancio con un cut-off P1000 punta in un bicchiere. Eliminare il riposo dopo neutralizzazione con candeggina (rifiuti biologici). </li><li> Diluire con ~ 4 - 5 volumi di ghiacciata Wash 1 soluzione. Separare in altrettanti tubi 30 ml come necessario. Centrifugare a 3.000 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare con cautela il surnatante. </li><li> Pellet Risospendere in 10 ml di Wash 2 soluzione e far girare a 3000 g per 10 minuti come descritto sopra. Risospendere pellet in 15 ml Lavare 3 e girano di nuovo a 3000 xg per 10 min. Combina le sospensioni da diverse pellet per ridurre il numero di tubi necessari prima della centrifugazione in Wash 2 e lavare 3 soluzioni. </li></ol></li><li> POS aliquotando senza etichettatura: <ol><li> Risospendere POS in 10-20 ml DMEM. Prediluito 10 ml in 490 microlitri DMEM (1:50) e contano allungata così come POS turbinava in uncamera di conteggio delle cellule (Figura 2B). Calcola la resa e la concentrazione in particelle POS per mL. NOTA: La resa varia a seconda principalmente dall&#39;età e ceppo di suini / mucche e dimensioni degli occhi, per esempio, una buona preparazione varia da 5 - occhi 8 x 10 9 POS da 80 suini. </li><li> Stabilire volume finale DMEM (tipicamente 10 - 20 ml) e aggiungere saccarosio per ottenere una concentrazione finale di 2,5% di saccarosio. </li><li> Preparare aliquote della dimensione desiderata, ad esempio, 5 x 10 7 POS per provetta per un volume risospensione 2 ml per un esperimento a 96 pozzetti a 40 microlitri / pozzetto. Spin 1 aliquota per 5 min a 2300 xg a temperatura ambiente e valutare le dimensioni del pellet. Preparare varie dimensioni aliquote per i diversi volumi di applicazione come POS non deve essere congelato e scongelato due volte. </li><li> Congelare aliquote POS a -80 ° C fino a nuovo uso. NOTA: Aliquote sono stabili per molti mesi. Nelle nostre mani, senza etichetta o con etichetta POS può essere conservato per almeno un anno. </li></ol></li><li> Etichettatura POS e in aliquote: NOTA: Usiamo tipicamente FITC etichettare POS per la quantificazione dei test di fagocitosi, ma altri coloranti possono essere utilizzati come pure a seconda delle esigenze. <ol><li> Risospendere 1 10 mg FITC flaconcino a 2,5 mg / ml in concentrazione 0,1 M Na tampone carbonato pH 9,5 mescolando 2,6 ml 0,1 M NaHCO3 pH 8,4 con 1,4 ml di 0,1 M Na 2 CO 3 pH 11,5 (Tabella 2, Soluzioni di riserva). Ruotare per 1 ora a temperatura ambiente, proteggendo dalla luce e girare per 5 minuti alla massima velocità per far sedimentare i solidi FITC non risospese. </li><li> Risospendere il pellet POS in 10 ml di soluzione di lavaggio 3 (o DMEM) e aggiungere 2 ml di soluzione FITC per 80 occhi. Conservare rimasto FITC congelato a -80 ° C. Ruotare per almeno 1,5 ore a temperatura ambiente. Proteggere dalla luce utilizzando un foglio di alluminio. </li><li> Lavare POS etichettato due volte con soluzione di lavaggio 3 come descritto nel paragrafo 2.3.4, quindi una o due volte in DMEM fino quasi nessun FITC gratuito è visto nel surnatante fraction. Risospendere POS in DMEM e procedere come per il POS senza etichetta per il conteggio e la suddivisione in aliquote (sezione 2.4). </li></ol></li><li> Utilizzando POS in esperimenti: <ol><li> POS Scongelare a temperatura ambiente, e tenerli all&#39;oscuro il più possibile se sono fluorescenza etichettati. Spin per 5 min a 2300 xga RT. Aspirare il surnatante. </li><li> Subito risospendere in volume appropriato di soluzione di dosaggio come dettato dall&#39;esperimento. In caso di diversi momenti della sfida POS, negozio risospeso POS a RT al buio tra i punti temporali per diverse ore. </li></ol></li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente.

Tre passaggi o condizioni sono cruciali per la purificazione ottimale: qualità del gradiente di colata e delicata manipolazione tubi gradiente, mantenendo tessuti refrigerati e al buio fino alla fase di raccolta, la forza di scuotimento di omogenati retina per ottenere il corretto isolamento POS dal resto del PR cell. Se alcuni problemi sorgono nel vedere il gruppo arancione correttamente, sono molto probabilmente a causa di uno dei tre motivi di cui sopra (si veda anche il secondo paragrafo della sezione Risult...

Nella retina, la visione viene attivato per isomerizzazione di molecole fotosensibili denominate opsine, prima di essere trasformato in un segnale che può essere trasmesso tra i neuroni fino alle aree visive del cervello. Queste molecole sono incorporati in pile di dischi membranose simili a frittelle che costituiscono le porzioni segmento esterno dei fotorecettori (PRS). Essere sottoposti a costante esposizione alla luce e quindi notevoli livelli di stress ossidativo, PR continuamente rinnovare i loro segmenti esterni per limitare il potenziale danno ossidativo. Segmenti esterni dei fotorecettori sono in stretto contatto con microvilli apicale delle retina epiteliali del pigmento (RPE) cellule vicine. Cellule RPE costituiscono la parte esterna della barriera emato-retinica e garantire numerosi compiti che sono cruciali per la salute e la funzione fotorecettori 1, come tempra raggi luminosi con pigmenti di melanina, ri-isomerizzazione del componente opsin fotoreattivo retina, fornendo nutrienti e gCRESCITA fattori, partecipando a disposizione PR metabolita. Inoltre, le cellule RPE eliminano spesi POS e riciclano i loro componenti, un&#39;occupazione quotidiana che è regolato dal ritmo circadiano in retina di mammifero 2,3. La clearance di capannone POS è assolutamente necessario per la sopravvivenza PR. Quando è completamente abrogato, POS detriti si accumulano e PRS degenerano causando una rapida 4,5 perdita della vista. Se il profilo ritmica viene persa e sostituita da un&#39;attività costante, PR e RPE difetti accumulano con l&#39;età 6. Pertanto, è molto importante per caratterizzare la regolazione molecolare di RPE fagocitosi in vitro per comprendere fenotipi legati al suo erettile. È interessante notare che il macchinario molecolare in cellule RPE è molto simile a quello utilizzato dai macrofagi per eliminare cellule apoptotiche ed entrambi sono determinati dal riconoscimento della fosfatidilserina esposta su detriti fagocitica 7-9. Tuttavia, le cellule RPE e macrofagi regolano phagocytosis diversamente, come macrofagi optare per l&#39;eliminazione immediata di cellule apoptotiche al momento dell&#39;incontro, mentre le cellule RPE ritmicamente inghiottire POS solo una volta al giorno, nonostante il loro contatto permanente con i segmenti esterni. Questo suggerisce specifici meccanismi di regolazione che non sono ancora pienamente compresi. Molte delle molecole implicati nel meccanismo RPE fagocitica sono stati identificati o convalidato grazie all&#39;utilizzo di POS isolata e coltura cellulare saggi fagocitosi. Il recettore alphavbeta5 integrina situata sulla superficie cellulare apicale RPE, in coordinamento con il suo ligando MFG-E8, si lega selettivamente al POS 10-12, che vengono poi interiorizzata attraverso il MerTK tirosina chinasi del recettore 13-15. Il recettore scavenger CD36 ha dimostrato di partecipare aspirazione POS ed influenzare la velocità 16,17, e potrebbe essere utilizzato come sensore di fosfolipidi ossidati in superficie POS 18. Internalizzazione deve il reclutamento di F-actina citoscheletro-assproteine ​​ociated quali annessina 2 19, miosina II 20 e miosina VIIA 21,22. Sono utilizzati anche POS Native o ossidato in vitro per capire invecchiamento fenotipi di cellule RPE in vivo legati all&#39;accumulo di mal digerito POS ossidato 23-28. La generazione di cellule RPE derivate da cellule staminali ha avviato una nuova applicazione per POS isolati che vengono utilizzati per dimostrare la funzionalità delle cellule prima di essere trapiantate in animali o pazienti 29,30,27. Prima descritto da Molday e colleghi nel 1987 31, il protocollo per l&#39;isolamento di POS bovina combina un passo ultracentrifugazione di omogenati retiniche sui continui gradienti di saccarosio con l&#39;osservazione del caratteristico aspetto arancione di greggi fotopigmento retinica (portando 11- retinica cis). Negli ultimi 10 anni, a causa di precauzioni prese, al fine di minimizzare il rischio di morbo della mucca pazza, l&#39;uso degli occhi suina è diventato sempre più dinamicongly prominente. Il protocollo qui descritto viene illustrato come ottenere grandi quantità di POS da suina o bovina occhi che possono essere aliquotati e conservati per lunghi periodi di tempo. Questo elimina la necessità di preparare POS da occhi roditore, che richiede l&#39;utilizzo di un gran numero di animali per la preparazione e il dosaggio POS 32,33,21,22. Inoltre, dettagli di etichettatura POS prima memorizzazione utilizzando molecole fluorescenti sono indicati, per quantificare e visualizzare POS in modo semplificato e comparabile per alcune applicazioni rispetto all&#39;etichettatura POS dopo la fagocitosi dosaggio 32,10. Pertanto, queste grandi scorte consentono riproducibilità e facilità d&#39;uso in molti diversi tipi di esperimenti.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiale/Attrezzatura specifica Creatore</td></tr><tr><td></td><td></td> di<td>gradienti a 2 camere</td><td>Creatore di gradiente</td></tr><tr><td></td><td></td> con camere da 30 ml<td>Tubi in silicone di 3 mm di diametro</td><td>per colata in gradiente</td></tr><tr>Barra <td></td><td></td> di<td>agitazione magnetica di piccole dimensioni</td><td>Barra di agitazione che si adatta alla camera di creazione del gradiente Lampada</td></tr><tr><td></td><td></td><td>a luce di sicurezza rossa</td><td>Lampada inattinica per la dissezione nel provette scure</td></tr><tr><td>Ultra Clear 25 x 89 cm</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>Provette per ultracentrifugazione</td></tr><tr><td>PP Oak Ridge Provette</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050</td><td>Provette per centrifugazione da 30 ml</td></tr><tr><td>Optima LE-80K</td><td>Beckman Coulter</td><td>365668</td><td>Ultracentrifuge</td></tr><tr><td>SW 32Ti rotore oscillante</td><td>Beckman Coulter</td><td>369694</td><td>Rotore oscillante per ultracentrifuga</td></tr><tr><td>Avanti J-26 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>393124</td><td>Centrifuga</td></tr><tr><td>JA-25.50 Rotore</td><td>Beckman Coulter</td><td>363058</td><td>per centrifuga Avanti J-26 XP</td></tr><tr><td>FITC Isomero I</td><td>Life Technologies</td><td>F-1906</td><td>Colorante fluorescente</td></tr><tr><td colspan="4">Altro materiale/attrezzatura</td></tr><tr><td>Camera di conteggio (come Neubauer o Malassez)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Secchielli per ghiaccio scuri con coperchi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bilance</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitatore magnetico e asta</td><td></td><td></td><td></td>di sostegno</tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td></td><td></td><td></td>refrita</tr><tr><td>37 gradi C bagnomaria-80</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>gradi C freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materiali di consumo Camice</td></tr><tr><td></td><td></td><td>da laboratorio</td><td>Salute e sicurezza</td></tr><tr><td>Guanti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protezioni per maniche Occhiali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuscinetti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>assorbenti</td></tr><tr><td>Sacchetti e bidoni della</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>spazzatura a rischio biologicoLame <td></td><td>Weck-Prep</td><td>Dissezione</td><td>Lamette da barba larghe 60 mm/2,25 pollici</td></tr><tr>Piatto <td></td><td></td><td></td><td>di plastica da 15 cm</td></tr><tr><td>Fogli</td><td></td><td></td><td></td>di garza sterili Provette</tr><tr><td></td><td></td> da<td>15 e 50 ml</td> Materiali <td>di consumo comuni</td></tr><tr><td>Microprovette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foglio di</td><td></td><td></td><td></td> alluminio</tr></tbody></table>

large-scale purificazione di suino o bovino fotorecettore outer segmenti per fagocitosi saggi su cellule retiniche dell&#39;epitelio pigmentato

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Analisi di una delle funzioni vitali epiteliale pigmentato retinico (RPE) cellule, la fagocitosi delle passate età frammenti distali dei segmenti esterni fotorecettori (POS) può essere eseguita in vitro. Fotorecettore segmenti esterni con pile di dischi membranose contenenti la macchina phototransduction vengono continuamente rinnovati nella retina. POS esausti vengono eliminati tutti i giorni dalle cellule RPE. Roditore, suina / bovini e cellule RPE umani riconoscono POS da varie specie in un modo simile. Per facilitare l&#39;esecuzione di grandi serie di esperimenti con poca variabilità, un grande magazzino di POS può essere isolato da occhi suini e conservato congelato in aliquote. Questo protocollo sfrutta la caratteristica di fotopigmenti che visualizzano un colore arancione quando tenuti all&#39;oscuro. Sotto fioca luce rossa, retine sono raccolti in un buffer da paraocchi aperte tagliate a metà. La sospensione cellulare retina viene omogeneizzata, filtrata e caricato su un gradiente di saccarosio continuo. Dopo centrifugation, POS sono situati in una banda discreta nella parte superiore della sfumatura che ha un caratteristico colore arancione. POS vengono poi raccolti, filato, risospese in sequenza in tamponi di lavaggio, contati e aliquotati. POS ottenute in questo modo possono essere utilizzati per saggi di fagocitosi ed analisi di attivazione della proteina, localizzazione o interazione in vari momenti dopo sfida POS. In alternativa, POS può essere etichettato con fluorofori, e. G., FITC, prima che si dispensa per la successiva quantificazione di fluorescenza di POS vincolanti o engulfment. Altre possibili applicazioni includono l&#39;uso di modificato POS o POS sfida combinato con condizioni di stress per studiare l&#39;effetto dello stress ossidativo o invecchiamento sulle cellule RPE.

La combinazione del gradiente di saccarosio lineare e l'ultracentrifugazione permette la separazione dei vari componenti della sospensione retinica per densità. Cellule e detriti RPE grande retiniche pesanti si depositano o vicino al fondo del gradiente (Figura 2A). Accendino POS e cellule singole leggeri o detriti cellulari dalla retina migrano bande come separati per raggiungere la metà superiore del gradiente entro la fine del periodo di centrifugazione. Mantenendo gli occhi ed i campioni al buio fin...

Questo articolo descrive il protocollo per la purificazione di frammenti del segmento esterno del fotorecettore (POS) tramite ultracentrifugazione da retine suine/bovine utilizzando l'omogeneizzazione e la centrifugazione in gradiente di saccarosio. Questo protocollo consente la preparazione di grandi scorte di aliquote POS, etichettate o non etichettate, che possono poi essere conservate a -80 °C.

Large-Scale Purificazione di suino o bovino fotorecettore Outer Segmenti per fagocitosi saggi su cellule retiniche dell&#39;epitelio pigmentato

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare stock su larga scala di segmenti esterni di fotorecettori, purificati dai segni di guerra o dagli occhi dei bovini. Studiare una delle funzioni più importanti del pigmento retinico, le cellule epiteliali, la loro attività ritmica giornaliera dell'acido OC. Ciò si ottiene colando prima dal 25 al 60% di saccarosio, gradienti in provette per ultracentrifuga.Successivamente gli occhi di suino o bovino vengono sezionati e i Rey vengono raccolti e omogeneizzati. Successivamente, i re vengono filtrati e caricati sul gradiente di saccarosio e centrifugati per separare i segmenti esterni dei fotorecettori. Infine, la banda arancione contenente i segmenti esterni del fotorecettore viene raccolta in un'aliquota immagazzinata così com'è, oppure etichettata prima di Ali, citando e conservando.In definitiva, la scansione fluorescente automatizzata, la microscopia fluorescente o l'immunoblotting vengono utilizzati per studiare l'attività fagocitaria di linee cellulari, cellule differenziate derivate da cellule staminali o colture primarie in varie condizioni. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto all'isolamento di segmenti auto dalla massa o dagli occhi per ogni esperimento è che lo stesso pool di materiale può essere utilizzato per diversi esperimenti, consentendo così un grado più elevato di riproducibilità. La dimostrazione visiva di questo metodo è pratica in quanto un passaggio critico risiede nella colata ionica perché condiziona la gamma di segmenti esterni isolati.A dimostrare la procedura saranno Celia Parino, una studentessa laureata, e contentamente un tecnico del mio laboratorio Dopo aver ottenuto 80 occhi freschi di maiale o mucca secondo il protocollo di testo, tenerli al buio e raffreddati su ghiaccio il più possibile. Per evitare il fotosbiancamento dei pigmenti visivi e la perdita del colore rosa arancio allestito sul banco, la lampada a luce rossa sicura assorbe e le salviette. Prepara un piatto da 15 centimetri, sacchetti per il rischio biologico per la raccolta dei rifiuti e lamette da barba.Una volta preparate tutte le soluzioni, secondo il protocollo di testo, pre raffreddarle e tenerle fredde durante tutti i passaggi. Fissare il creatore di gradienti su una piastra di agitazione magnetica e inserire l'ancoretta nella camera più vicina all'uscita dove verrà versata la soluzione al 60%. Utilizzare un puntale per pipetta P 200 posizionato all'uscita del tubo per ottenere una velocità di colata adeguata con 12 millilitri di ciascuna soluzione di saccarosio al 25% e al 60%.E mentre si agita la soluzione al 60%, gettare un gradiente lineare di saccarosio in una provetta da centrifuga pre-raffreddata, mantenendo l'apertura della punta della pipetta sulla superficie della soluzione a gradiente in continua ascesa. Per eseguire la raccolta dei tessuti, indossare un camice da laboratorio aderente, guanti, protezioni per le maniche e occhiali sotto la fioca luce rossa tenendo un occhio in una mano con la superficie di taglio rivolta verso l'esterno, utilizzare il bordo di una lama di rasoio per perforare la parte anteriore dell'occhio. Quindi usa la lama del rasoio per tagliare il bulbo oculare anteriore in due metà.Rimuovere la lente e capovolgere l'oculare in modo che possa essere tenuto sopra la punta di un dito. Esponendo così la retina usando la lama del rasoio ad angolo, raschiare delicatamente la retina, che si staccherà facilmente e apparirà come uno strato rosato dalla superficie del teto e taglierà la testa del nervo ottico. Trasferire le retine in una delle provette da due a 50 millilitri contenenti 15 millilitri di soluzione di omogeneizzazione su ghiaccio.Dopo aver raccolto tutte le retine, agitare energicamente la sospensione a mano per due minuti. Al fine di interrompere i diversi strati cellulari, rompere i segmenti esterni dei fotorecettori o POS dal resto dei fotorecettori, frammentare il POS e omogeneizzare la sospensione della retina. Per rimuovere i frammenti di tessuto di grandi dimensioni, utilizzare il doppio strato di garza pulita per filtrare la sospensione tre volte in un tubo da 50 millilitri.Premere delicatamente sulla garza per rilasciare i tessuti frammentati rimanenti. Dopo ogni filtrazione, stendere delicatamente il preparato di retina grezzo su gradienti da sei a 24 millilitri, dal 25 al 60% di saccarosio. Dopo aver bilanciato le provette, centrifugare Ultra a 106.000 Gs per 50 minuti a quattro gradi Celsius.Quando la centrifuga è completa, aspirare la maggior parte della soluzione sopra la banda rosa arancione nel terzo superiore del gradiente. Quindi, utilizzando una punta P 1000, raccogliere la banda rosa arancione in un bicchiere. Utilizzare circa quattro o cinque volumi di lavaggio uno per diluire la soluzione e aliquotare in tante provette da 30 millilitri quanto necessario.Centrifugare a 3000 GS per 10 minuti a quattro gradi Celsius e scartare con cura il surnatante. Quindi con lavare due soluzioni reus, sospendere i pellet prima di girare di nuovo. Utilizzare la soluzione di lavaggio tre per lavare i pellet.Una terza volta. Per aliquotare il POS. Utilizzare da 10 a 20 millilitri di DMM per risospendere le cellule.Quindi utilizzare 490 microlitri di DMM per diluire 10 microlitri di cellule e ricalcolare la resa e la concentrazione in particelle POS per millilitro. Decidere un volume finale di DMM e aggiungere saccarosio a una concentrazione finale del 2,5%Preparare le aliquote desiderate. Centrifugare una singola aliquota a 2.300 GS per tre-cinque minuti a temperatura ambiente.Valutare la dimensione del pellet e preparare vari volumi di aliquote per evitare il congelamento e lo scongelamento più di una volta. Per etichettare le celle prima del wattaggio Eloqua. Utilizzare un tampone di carbonato di sodio molare da 0,1 per risospendere una fiala da 10 milligrammi di ZI a una concentrazione di 2,5 milligrammi per millilitro.Ruotare per un'ora a temperatura ambiente al buio e centrifugare alla massima velocità per cinque minuti per pellettare i solidi ZI rimanenti. Utilizzando 10 millilitri di soluzione wash three o dmm, risospendere il pellet POS e aggiungere due millilitri della soluzione Fite per 80 occhi. Utilizzare un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce e ruotare per almeno 1,5 ore.A temperatura ambiente. Utilizzare la soluzione di lavaggio tre per lavare le cellule due volte come descritto in precedenza nel video, quindi DM EM una o due volte fino a quando non si vede quasi nessun adattamento libero nel surnatante. Utilizzare DM EM per sospendere il POS e contare un quat simile al POS senza etichetta, come mostrato qui.Mantenendo gli occhi e i campioni al buio fino a dopo la fase di centrifugazione, il divieto di gradiente di saccarosio contenente POS può essere immediatamente riconosciuto per il suo colore arancione brillante. E se sono danneggiati, appariranno come pezzi molto più piccoli, un po' come uno sfondo polveroso. In genere, se isolato correttamente, il POS dovrebbe apparire allungato, dritto o piegato.Se osservati al microscopio, a seconda del piano di messa a fuoco del microscopio, possono apparire scuri o lucidi. Se non vengono risospesi correttamente, rimarranno in grumi. I POS isolati servono a testare direttamente la capacità fagocitaria delle cellule RPE mutanti.In questo esempio, i POS vengono facilmente fagocitatizzati dalle cellule RPE primarie di topi wild type, mentre le cellule di topi beta cinque integrina e MFG otto knockout riducono gradualmente i POS nello stesso lasso di tempo. La quantificazione della fagocitosi POS può essere effettuata contando manualmente i POS marcati con FSE sulle immagini del microscopio, misurando l'intensità della fluorescenza, o mediante citometria a flusso dopo tripsina cellulare. Questa figura analizza il reclutamento delle proteine utilizzando l'immunofluorescenza, i saggi di colocalizzazione e il reclutamento o l'attivazione delle proteine possono essere convalidati su blocchi immunologici dopo l'immunoprecipitazione o controllando la fosforilazione dopo il suo sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della fagocitosi mediata da fosfato seina per esplorare e caratterizzare il meccanismo molecolare nelle cellule dei petali di pigmento retinico e confrontare i risultati con altre cellule fagocitiche come i macrofagi.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

In questo video descriviamo una tecnica per isolare le cellule epiteliali pigmentate dell'iride e della retina dagli occhi dei suini per ottenere le loro colture primarie per studi in vivo ed ex vivo. Queste cellule pigmentate potrebbero essere geneticamente modificate per studiare approcci rigenerativi per il trattamento dei disturbi oculari.

Isolamento di cellule IPE e RPE: una tecnica per ottenere cellule epiteliali pigmentate da occhio suino isolato

Questo video mostra la procedura per isolare le cellule epiteliali pigmentate retiniche, o RPE, e le cellule epiteliali pigmentate dell'iride, o IPE, dagli occhi bovini raccolti. Le cellule isolate possono essere coltivate per studiare il loro ruolo nel trattamento delle malattie oculari.

Isolamento delle cellule RPE e IPE dall'occhio bovino: una procedura per raccogliere e coltivare cellule epiteliali pigmentate primarie bovine

Qui viene presentato un protocollo per isolare e trasfezionare le cellule epiteliali primarie dell'iride e del pigmento retinico da vari mammiferi (topi, ratti, conigli, suini e bovini). Il metodo è ideale per studiare approcci di terapia genica oculare in vari set-up per analisi ex vivo e studi in vivo trasferibili all'uomo.

Isolamento, coltura e ingegneria genetica delle cellule epiteliali pigmentate primarie dei mammiferi per la terapia genica non virale

Questo protocollo, originariamente riportato da Fernandez-Godino et al. La procedura dura circa 3 ore.

Dissezione e coltura efficienti delle cellule epiteliali del pigmento retino del topo primario

Questo protocollo presenta due tecniche per isolare i compartimenti subcellulari dei fotorecettori murini a bastoncello per l'analisi delle proteine. Il primo metodo utilizza retina viva e carta da filtro di cellulosa per separare i segmenti esterni dell'asta, mentre il secondo impiega retina liofilizzata e nastro adesivo per rimuovere gli strati del segmento interno ed esterno dell'asta.

Due metodi di peeling per l'isolamento dei compartimenti cellulari fotorecettori nella retina del topo per l'analisi delle proteine

Questo manoscritto descrive un protocollo semplificato per l'isolamento delle cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) dagli occhi dei topi in modo graduale. Il protocollo include l'enucleazione e la dissezione degli occhi di topo, seguita dall'isolamento, dalla semina e dalla coltura delle cellule RPE.

Isolamento delle cellule primarie dell'epitelio pigmentato retinico del topo

Qui viene presentato un metodo facile da seguire per la coltura in vitro di cellule epiteliali primarie del pigmento retinico suino.

Coltura primaria di cellule epiteliali pigmentate retiniche suine

Descriviamo un metodo semplice ed efficiente per isolare le cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) dagli occhi di giovani cavie pigmentate. Questa procedura consente studi di biologia molecolare di follow-up sull'RPE isolato, comprese le analisi di espressione genica.

Isolamento delle cellule epiteliali pigmentate retiniche da occhi di porcellino d'India

Questo protocollo descrive un modello di accumulo di lipofuscina in colture epiteliali di pigmenti retinici (RPE) umane altamente differenziate e polarizzate e un test di fagocitosi del segmento esterno (OS) migliorato per rilevare il consumo totale di OS / capacità di degradazione dell'RPE. Questi metodi superano i limiti dei precedenti modelli di lipofuscina e dei classici saggi di fagocitosi del segmento esterno a inseguimento del polso.

Miglioramento dei modelli di lipofuscina e quantificazione della capacità di fagocitosi del segmento esterno in colture epiteliali di pigmenti retinici umani altamente polarizzate

Questo protocollo delinea la procedura per ottenere e coltivare cellule epiteliali pigmentate retiniche primarie (RPE) da occhi suini di provenienza locale. Queste cellule rappresentano un'alternativa di alta qualità alle cellule staminali e sono adatte per la ricerca retinica in vitro .

Isolamento di cellule epiteliali pigmentate retiniche primarie suine per la modellazione in vitro

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) agisce come una barriera cruciale tra la coroide e la retina, promuovendo la salute e la funzione dei tipi di cellule retiniche, come i fotorecettori. In questo articolo, descriviamo un protocollo semplice ed efficace per isolare e coltivare l'EPR murino adulto.

Un metodo semplificato per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali pigmentate retiniche da topi adulti

Impara la purificazione su larga scala di segmenti esterni dei fotorecettori da retina suina o bovina per saggi di fagocitosi su cellule dell'epitelio pigmentato retinico. Questo metodo consente di studiare l'attività fagocitaria ritmica.

Large-Scale Purificazione di suino o bovino fotorecettore Outer Segmenti per fagocitosi saggi su cellule retiniche dellepitelio pigmentato (Video) | JoVE Journal

Large-Scale Purificazione di suino o bovino fotorecettore Outer Segmenti per fagocitosi saggi su cellule retiniche dell'epitelio pigmentato

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