A lungo termine Time Lapse Imaging del mouse cocleari Espianti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare una coclea embrionale prelevata da un topo reporter fluorescente a intervalli di 30 minuti nell'arco di cinque giorni. Ciò si ottiene raccogliendo per la prima volta la coclea embrionale del giorno 13 da topi reporter fluorescenti. Successivamente, le coclee vengono coltivate in vitro.

Quindi le colture cocleari explan vengono poste in un microscopio incubatore. Infine, viene impostata una routine di imaging automatizzata e viene eseguita l'imaging della coclea E. In definitiva, l'imaging time lapse a lungo termine delle colture cocleari explan può essere utilizzato per mostrare i movimenti morfogenetici dell'epitelio cocleare nel suo complesso, nonché i cambiamenti nell'espressione genica reporter nel tempo e gli effetti degli agenti farmacologici ad azione lenta.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la fotografia manuale delle colture del fondo X in un corso temporale, è che questo sistema è completamente automatizzato. Consente di raccogliere più punti temporali e garantisce che la stessa regione della cocleare o dell'insieme di cellule venga visualizzata con lo stesso orientamento in ogni punto temporale, il tutto durante la crescita in un incubatore di coltura tissutale irregolare. Dopo aver integrato il mezzo eagle modificato di KO o DMEM e la soluzione salina dell'equilibrio di Hank o HBSS secondo il protocollo di testo allegato.

Sotto una cappa a flusso laminare, utilizzare cinque millilitri di DMEM non integrato per risospendere 200 microlitri di substrato della membrana basale pipetta da 150 microlitri al centro di ogni pozzetto da 10 millimetri di un piatto di coltura con fondo di vetro di 35 millimetri di diametro. Incubare per 40 minuti in un incubatore a CO2 a 35 gradi Celsius. Per preparare la postazione di lavoro e gli strumenti, accendere il banco di pulizia a flusso laminare e utilizzare etanolo al 70% per spruzzarlo e immergere pinze, cucchiai e un piatto rivestito in silicone nero.

Nella postazione di lavoro pulita, raccogliere gli embrioni della gestazione appropriata nel ghiaccio. HBSS freddo integrato con heap all'1%. Utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente, identificare gli embrioni che mostrano attività reporter esternamente o all'interno di un organo visibile e trasferirli in HBSS fresco ghiacciato con cumuli all'1% per la raccolta delle ossa temporali, utilizzando una fonte di luce fredda e una pinza fine.

Lavora rapidamente per agganciare le vertebre cervicali e sotto la mascella per raccogliere le teste. Dopo aver raccolto le teste degli embrioni secondo il protocollo di testo, aprire con cura il cranio, quindi rimuovere il ritaglio del cervello dalla parte anteriore della testa e trasferire il cranio posteriore in un piatto con ghiaccio fresco. Freddo. HBSS, seziona attentamente le ossa temporali a forma di nocciolina, facendo attenzione a mantenere intatto il sistema vestibolare.

Per sezionare la coclea, trasferire le ossa temporali in un piatto rivestito di elastomero siliconico nero in cumuli di HBSS ghiacciati. Fissare la regione vestibolare dell'osso inserendo perni ad angolo obliquo per stabilizzare l'osso temporale e creare spazio per la pinza. Quindi rimuovere con cura la cartilagine che circonda la coclea inserendo una fascetta della pinza nella cartilagine sul bordo esterno della base della coclea e praticando un foro nella cartilagine.

Agganciare orizzontalmente sulla parte superiore e in diagonale e sollevare con cautela la parte anteriore della capsula. Inserire un polo della pinza tra la cartilagine rimanente e il dotto e tagliare delicatamente la cartilagine rimanente. La superficie apicale della coclea è ora esposta.

Partendo dalla base, afferrare l'area in cui il tetto del dotto incontra l'epitelio cocleare e aprire il dotto cocleare. Staccare delicatamente il rivestimento del tetto quando necessario fino a quando non è completamente rimosso. Tagliare eventuali porzioni di membrana rimaste sul lato mediale del condotto.

Quindi pulire il dotto dal tessuto mesenchimale in eccesso e staccare il dotto dal sistema vestibolare per gli impianti di coltura. Posizionare una superficie luminale al centro di un piatto di coltura con fondo in vetro rivestito di substrato. Aspirare con cautela il liquido e lasciare agire per due minuti.

Poi a goccia. Aggiungere 150 microlitri di DMEM integrato all'X explan, facendo attenzione a non disturbarlo in modo che possa depositarsi sul substrato. Posizionare i piatti con fondo di vetro in una capsula di Petri profonda 12 centimetri di diametro con un piattino di acqua sterile per mantenere l'umidità.

Mettere le colture in un'incubatrice a 35 gradi Celsius durante la notte in modo che l'explan si attacchi al substrato e si appiattisca per eseguire l'imaging dal vivo. Dopo aver selezionato i campioni, utilizzare uno stereomicroscopio fluorescente per valutare le condizioni di ciascuna coclea espiantata e selezionare solo gli espianti in cui il dotto è intatto e attaccarli al vetro dalla base all'apice. Impostare l'incubatrice a 35 gradi Celsius con il 5% di CO2 per la coltura.

Aspirare delicatamente il DMEM integrato dalle colture e sostituirlo con almeno 500 microlitri di terreno fresco. Nei casi in cui gli explan sono attaccati in modo allentato, pipettare un anello di terreno attorno al bordo del piatto. Questo liquido extra creerà una camera umidificata in miniatura senza disturbare l'explan mentre continua ad attaccarsi alla matrice.

Il microscopio in questo esempio ha una piattaforma rotante che contiene 8 piastre per campioni da 35 millimetri sotto la cappa a flusso laminare. Sostituire i coperchi di plastica con coperchi di vetro e inserire le piastre nel portapiatti. Se è necessario cambiare il supporto durante il corso dell'esperimento.

Per evitare di disturbare l'esposizione, utilizzare coperchi per piatti incernierati che consentano l'apertura dei coperchi mentre la piastra rimane nel suo alloggiamento nel microscopio, posizionare il portacampione all'interno del microscopio dell'incubatrice, facendo attenzione a non spostare l'esplano dal fondo della piastra o a disturbare il fluido. Per impostare la routine di imaging, accendere la lampada UV e la fotocamera del microscopio e aprire il software di imaging. Per ogni campione localizzato, scegliere un piano di messa a fuoco e di esposizione dell'area di imaging, tenendo presente non solo la vista dell'esposizione al momento dell'avvio, ma anche il modo in cui il tessuto si muoverà durante il corso della corsa.

Nel canale di fluorescenza, impostare una pila Z centrata attorno al piano focale selezionato. Quindi impostare la frequenza e la durata del campionamento per l'esperimento. Questo sarà limitato dal tempo necessario per raccogliere le immagini per generare un filmato alla fine di un periodo di time lapse.

Utilizzare un software come METAMORPH per aprire i file immagine per un campione fotogramma per fotogramma. Scegli il piano focale migliore per mostrare la popolazione cellulare di interesse. Infine, converti le immagini in un file punto a VI o esportali come montaggio per generare un insieme di immagini che possono essere aperte e analizzate in un software di elaborazione delle immagini o convertite in altri formati.

Qui viene mostrato un filmato che dimostra come un explan cocleare organotipico crescerà se piastrato. Su E 13.5 è stato utilizzato un topo reporter SOX two per visualizzare la regione sensoriale pro vista in verde mentre le cellule delle regioni sensoriali non s si dividono e si muovono. La regione sensoriale non proliferativa nel verde subisce riarrangiamenti tissutali e movimenti di estensione convergenti.

Un secondo esperimento time lapse centrato sulla base centrale di un diverso explan cocleare dimostra che mentre estende i pro. La regione sensoriale si restringe quando si è per la prima volta nella coltura. Lo spessore del tessuto consente di identificare le regioni di espressione ma non le singole cellule.

Tuttavia, dopo tre giorni di coltura, il tessuto si è appiattito considerevolmente, rendendo possibile la visualizzazione delle singole cellule fluorescenti Seguendo questa procedura. Altri metodi, come la colorazione con immunofluorescenza o l'estrazione di proteine e RNA, possono essere eseguiti per valutare i cambiamenti nell'espressione genica a livello molecolare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare e coltivare la coclea e come utilizzare un microscopio incubatrice per eseguire l'imaging dal vivo sull'intero explan per un periodo di giorni.