Identificazione dei fattori chiave di regolazione auto-rinnovamento e differenziazione in cellule ematopoietiche precursori EML da Analysis RNA-sequencing

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare potenziali regolatori chiave dell'autorinnovamento e della differenziazione delle cellule EML di topo utilizzando la tecnologia di sequenziamento dell'RNA. Ciò si ottiene separando prima le cellule EML negative CD 34 positive e negative CD 34 negative in base ai marcatori di superficie. Il secondo passo consiste nell'isolare l'mRNA, convertire l'mRNA in cDNA e preparare la libreria per il sequenziamento.

Successivamente, la libreria di DNA viene sottoposta a sequenziamento ad alto rendimento. Il passaggio finale consiste nell'analizzare i risultati del sequenziamento e cercare fattori di trascrizione espressi in modo differenziale. In definitiva, la tecnologia di sequenziamento dell'RNA viene utilizzata per mostrare fattori di trascrizione espressi in modo differenziale nelle cellule EML negative al lignaggio CD 34 positivo e al lignaggio negative CD 34 negative.

Il vantaggio principale del sequenziamento dell'RNA rispetto ad altri metodi di prolene di espressione G come i microraggi, è che ha una maggiore sensibilità, accuratezza e una gamma dinamica più ampia e non si basa su informazioni di annotazione genica preesistenti. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo delle cellule staminali, come ad esempio quali sono i fattori chiave di trascrizione che regolano l'autorinnovamento e la differenziazione cellulare. Le implicazioni di questa tecnica si estendono dove la terapia delle malattie del sangue perché una migliore comprensione del regolatore chiave che controlla le cellule precursori ematopoietiche, l'autorinnovamento e la differenziazione possono portare allo sviluppo di trattamenti efficaci.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché sono necessari vari strumenti bioformativi per l'analisi del sequenziamento. I reni di criceto o le cellule BHK per la raccolta del fattore delle cellule staminali vengono coltivati in terreno dmem contenente il 10% di FBS in un pallone di 25 centimetri quadrati, a 37 gradi Celsius e il 5% di CO2. Quando le cellule hanno raggiunto l'80-90% di confluenza degli occhi di tripsina e le raccolgono mediante centrifugazione a 200 Gs per cinque minuti a temperatura ambiente, scartare la snat e risospendere la tavolozza cellulare in 10 millilitri di terreno di coltura cellulare BHK fresco.

Trasferire due millilitri della sospensione cellulare in un nuovo pallone da 75 centimetri quadrati e aggiungere 48 millilitri di coltura cellulare BHK fresca. Medio rispetto alla coltura del pallone. Le cellule BHK per due giorni.

Dopo due giorni, raccogliere il terreno di coltura e farlo passare attraverso un filtro a punto 45 micrometri. Conservare il fluido a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Le cellule eritroidi, mieloidi e linfocitiche o EML di topo utilizzate in questo protocollo vengono coltivate in sospensione in terreno basico EML contenente terreno di coltura cellulare BHK a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.

Mantenere le cellule EML a una bassa densità cellulare con una densità di picco inferiore a 600.000 cellule per millilitro. Dividere le cellule ogni due o tre giorni con un rapporto di uno a cinque passaggi alle cellule delicatamente, ma per non più di 10 generazioni per esaurire le cellule positive al lignaggio. Raccogliere le cellule EML mediante centrifugazione a 200 Gs per cinque minuti.

Lavare le celle una volta con PBS e centrifugare nuovamente dopo aver scartato il surnatante. Risospendere le cellule in PBS e contare le cellule con un emocitometro. Il numero di cellule è necessario per determinare la concentrazione di anticorpi nella fase successiva.

Isolare le cellule di lignaggio negative o di linea negativa utilizzando un cocktail di anticorpi di lignaggio e un sistema di smistamento cellulare attivato magneticamente secondo le istruzioni del produttore. Per iniziare questa procedura, centrifugare le cellule lin negative a 200 G per cinque minuti. Risospendere il pellet cellulare con PBS e contare le cellule con un emocitometro.

Lavare le celle due volte con il tampone fax. Dopo il secondo lavaggio, pellettare le celle a 200 Gs per cinque minuti. Etichettare le cinque provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri rispettivamente con i numeri 1, 2, 3, 4 e cinque.

Risospendere le cellule con un volume appropriato di tampone fact a una concentrazione di 1 milione di cellule per 100 microlitri. Quindi aliquotare 100 microlitri di sospensione cellulare in ciascuna delle cinque provette per microcentrifuga. Aggiungere un microgrammo di anticorpo anti topo CD 34 FE alla provetta uno e alla provetta due.

Mescolare le provette, incubare delicatamente tutte le provette a quattro gradi Celsius per un'ora al buio. Successivamente, aggiungere il punto 25 microgrammi di antica coniugata PE, un anticorpo e 20 microlitri di un lignaggio coniugato PC. Cocktail di anticorpi a due uno, aggiungere punto 25 microgrammi di PE coniugato antico un anticorpo al tubo tre e 20 microlitri di un lignaggio coniugato PC.

Cocktail di anticorpi al tubo quattro. Mescolare delicatamente le provette e incubare le cellule a quattro gradi Celsius per altri 30 minuti al buio. Dopo 30 minuti, aggiungere 300 microlitri di tampone fax a tutte le provette e far girare le celle a 200 Gs per cinque minuti.

Lavare le celle tre volte con 500 microlitri di tampone fax dopo il lavaggio finale. Resus sospendere ogni pellet cellulare in 500 microlitri di tampone fax isolare lin negativo SCA positivo CD 34 positivo e lin negativo SCA negativo CD 34 cellule negative in una provetta mediante selezione cellulare attivata a fluorescenza. L'RNA totale viene estratto dalle cellule lin negative CD 34 positive e lin negative CD 34 negative utilizzando il triolo e il DNA contaminato viene rimosso utilizzando la desossiribo nucleasi uno.

Seguendo il protocollo del produttore, valutare la qualità dell'RNA totale utilizzando un bioanalizzatore seguendo le istruzioni del produttore per l'estrazione dell'mRNA e le successive procedure di costruzione della libreria vengono utilizzati solo campioni di RNA con un numero di integrità dell'RNA o RIN superiore a nove. Questa figura mostra il risultato di un campione di RNA di alta qualità con un RIN pari a 9,4. Il protocollo di costruzione della libreria utilizzato qui è specifico per la piattaforma di sequenziamento dell'RNA Illumina e utilizza un kit di preparazione del campione di RNA.

Seguire le istruzioni fornite dal produttore perché in questo video vengono mostrati solo i passaggi selezionati. Inizia selezionando positivamente il poli MNA utilizzando le perle magnetiche oligo DT. Successivamente, frammentare il poli mRNA ed eseguire la trascrizione inversa utilizzando primer casuali per convertire l'mRNA in CD NA. Successivamente, il secondo filamento sintetizzato CD NA viene utilizzato per generare DNA a doppio filamento.

Successivamente, le tre sporgenze principali vengono rimosse e le cinque sporgenze principali vengono riempite dalla DNA polimerasi denato. Le tre estremità prime dei frammenti di CD NA dalla legatura l'una all'altra. Aggiungere adattatori di indicizzazione multiplex a entrambe le estremità del CD NA a doppio filamento per il sequenziamento.

Infine, eseguire la PCR per l'arricchimento del CD NA per i frammenti utilizzando uno spettrofotometro, misurare l'assorbanza due 60 sopra l'assorbanza due 80 del DNA amplificato. Per ottenere informazioni sulla concentrazione della libreria, valutare la qualità della libreria e misurare l'intervallo di dimensioni dei frammenti di DNA utilizzando un bioanalizzatore. I metodi per l'analisi dei dati di sequenziamento dell'RNA si trovano nel testo del protocollo allegato e includono l'elaborazione di file di dati per l'analisi a valle, il rilevamento di nuovi trascritti e la valutazione del livello di espressione, il rilevamento di geni espressi in modo differenziale e l'identificazione di fattori di trascrizione espressi in modo differenziale.

Le cellule EML negative del lignaggio sono state colorate con anticorpi anti CD 34 antica e cocktail di lignaggio e lin negativo, cranio positivo, CD 34 positivo e lin negativo sca. Le cellule negative CD 34 negative sono state separate utilizzando solo la selezione cellulare attivata fluorescente. Le cellule lin negative sono state controllate per l'analisi dell'espressione di SCA 1 e CD 34.

Due popolazioni di cellule EML sono state osservate quando la costruzione della libreria è stata completata. La dimensione dei frammenti di DNA nella libreria è stata controllata utilizzando un bioanalizzatore. Questi dati rappresentativi mostrano una libreria di buona qualità, ma la dimensione del frammento raggiunge un picco di circa 300 coppie di basi.

L'algoritmo D-E-S-E-Q è stato utilizzato per l'analisi dell'espressione differenziale con particolare attenzione ai fattori di trascrizione differenzialmente espressi perché i fattori di trascrizione sono cruciali per la determinazione del solfato. Sono stati trovati fattori di trascrizione che cambiano di oltre 1,5 volte tra lin negativo CD 34 positivo e lin negativo CD 34 negativo e sono mostrati in questa mappa di calore. In particolare, il livello di espressione relativa di TCF sette nelle cellule lin negative CD 34 positive è più di 100 volte superiore a quello delle cellule lin negative CD 34 negative.

Pertanto, il TCF seven è stato scelto per ulteriori analisi di immunoprecipitazione e sequenziamento della cromatina e test funzionali per confermare la sua funzione nella regolazione dell'auto-rinnovamento e della differenziazione nelle cellule EML. Una volta padroneggiata, la libreria di RNA può essere completata in pochi giorni e l'intera procedura può essere completata in circa un mese se eseguita correttamente dopo il suo sviluppo. Questa tecnologia ha aperto la strada ai ricercatori che sono disposti a esplorare l'espressione genica differenziale tra diversi tipi di cellule e tessuti, come le cellule B e le cellule B maligne.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare un alto CAR TRNA perché è la base dell'intera procedura di malattia dell'RNA. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una migliore comprensione di come identificare i regolatori chiave che controllano il rinnovamento e la differenziazione cellulare EML.