Name: Il Sistema swimmeret di gamberi: Una guida pratica per la dissezione del cavo di Nerve e extracellulari registrazioni del modello Motor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Impara la dissezione del cordone nervoso addominale del gambero per registrazioni elettrofisiologiche dei neuroni motori degli swimmeret. Questa tecnica consente di studiare la locomozione fittizia e i generatori di pattern centrali.

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Ringraziamo Jos Burgert per aiutare con alcune delle figure. Siamo grati a Ingo Selbach (e il gruppo &quot;Edelkrebsprojekt NRW&quot;) per i suoi sforzi per fornire il laboratorio con animali da esperimento. Ringraziamo Anna C. Schneider per la correzione prime versioni del manoscritto. Questa ricerca è stata sostenuta da un Emmy Noether DFG concessione SM 206 / 3-1 e una sovvenzione di avvio dell&#39;Università di Colonia per docenti di sesso femminile.

Questa procedura dissezione è in conformità con la Comunità europee Direttiva del Consiglio del 22 settembre 2010 (2010/63 / UE). 1. Preparazione <ol><li> Ottenere gamberi, Pacifastacus leniusculus (Dana), di entrambi i sessi ≥8 cm di dimensione. Assicurarsi che gli animali sono di vitale importanza e gli arti addome e addominali sono intatte. </li><li> Fare attenzione a ispezionare il carapace e che questa cuticola è dura e rigida. Pre e animali postmolt hanno un carapace morbido e non sono adatti per gli esperimenti perché durante il processo di muta cambiare molti parametri (ad esempio, diminuzione dell'attività locomotoria). </li><li> Montare tutti gli strumenti ei materiali utilizzati durante la dissezione, pinning e desheathing del cordone nervoso illustrato nella figura 2 ed elencati nei supplementi previsti. </li></ol><img alt="Allestimento al microscopio di dissezione con strumenti chirurgici per l'analisi di campioni biologici; Include una sorgente luminosa." src="/files/ftp_upload/52109/52109fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: (1) grande secchio pieno di ghiaccio; (2) salina gamberi; (3) dispenser salina; (4) microscopio dissezione; (5) piatto dissezione; (6) forbici forti; (7) forcipe (8) forbici primavera; (9) piastra Petri rivestito con chiaro Sylgard; (10) perni di fissaggio; (11) con lampade a freddo. 2. Gross Dissection <ol><li> Anestetizzare animali sul ghiaccio per il 15 - 20 min. Effettuare la prima parte della dissezione lordo a un banco di laboratorio vicino al lavandino quanto comprende una fase dissanguamento e il campione deve essere risciacquato regolarmente con gamberi salina durante la procedura. </li><li> Tenere animali lato ventrale e usare le forbici per tagliare entrambi forti artigli alle loro basi vicino al torace (Figura 3-1). Rimuovere uropod sinistra e destra (Figura 3-2). </li><li> Posizionare il lato ventrale degli animali nel piatto dissezione allineato con Sylgard nero. Elevate cefalotorace inserendo ghiaccio sotto e appuntare l'addome al telson (Figura 4A). </li><li> Riempire il dispenser salina con ~ 60 ml di soluzione salina fredda gamberi. Profumato gamberi con soluzione salina fredda attraverso l'apertura artiglio (Figura 4B). Salina eccesso sgocciolare attraverso i tagli alle uropods. Coprire gamberi con ghiaccio durante dissanguamento </li><li> Decapitarlo l'animale con un unico taglio trasversale appena posteriormente agli occhi dell'animale con le forbici forti (Figura 5A). Rimuovere tutte le gambe che camminano vicino alle articolazioni di base come indicato nella figura 5B. </li><li> Isolare l'addome con gli ultimi segmenti toracici dal resto del cefalotorace. Fare un primo taglio a livello della seconda gambe piedi (segmento toracico 3) inserendo la punta delle forbici nell'apertura della seconda gamba piedi e taglio al lato opposto. (Figura 6A-1). </li><li> Estendere questo primo taglio per entrambe le parti attraverso tegli cefalotorace (Figura 6A-2). </li><li> Capovolgere l'animale aperto per fare alcuni degli organi interni visibili. Premere il prominente ghiandola digestiva (Figura 6B-3) per la parte anteriore del campione e utilizzare pinze per rimuovere gli organi riproduttivi dalla cavità addominale. </li><li> Togliere la parte anteriore del cefalotorace (Figura 6C). Utilizzare tagli laterali per rimuovere le parti laterali del carapace, che coprono le branchie, su entrambi i lati del torace rimanente (Figura 6D-4). Rimuovere le branchie e risciacquare il campione con soluzione fisiologica fredda. </li><li> Continuare la dissezione con un taglio attraverso l'intera lunghezza della piastra sternale come indicato nella figura 6E-5. Rendere questo taglio in posizioni laterali massime tra Pleuron e swimmerets (segni rossi Figura 6 sexies). Procedere sull'altro lato con un stesso taglio. Sciacquare il campione con soluzione fisiologica fredda. </li><li> Effettuare la dissezione rimanendo sotto un dissection microscopio. Posizionare addome lato ventrale del gambero di fiume nel piatto dissezione allineato con Sylgard nero e pieno di gamberi salina in modo da coprire il campione. NOTA: Le seguenti operazioni (2,12-4,8) contengono istruzioni direzionali che si applicano a sperimentatori mano destra. Nei passi seguenti (2,12-6,8), è importante sostituire gamberi salina in intervalli regolari, ogni 20-30 minuti con soluzione salina fredda, per mantenere il sistema nervoso sano. </li><li> Fissare il campione con perni di insetti posteriormente al telson e anteriormente ai resti del carapace. Posizionare il campione in modo che i punti Telson a sinistra ed è parallela al bordo del tavolo. </li><li> Utilizzare pinze grossolani nella mano sinistra per afferrare attraverso un'apertura gamba piedi (Figura 7A) ed estrarre il campione aperto (Figura 7B freccia bianca). Identificare i grandi due dorsali filoni flessore muscolari (Figura 7B-1 e C-1) e tagliare loro ventralebase come illustrato nella Figura 7B. </li><li> Identificare l'arteria sternale (Figura 7C-2), che scende dalla dorsale (cuore) per ventrale, al segmento toracico 4 °. Questa arteria si trova proprio sopra il cordone nervoso (Figura 7C-3), prima che si proietta sotto il cordone nervoso, formando l'arteria ventrale. </li><li> Transetto l'arteria sternale. Come mostrato in Figura 7C, sollevare l'arteria prima, usando una lama di forbici, e solo tagliare quando il cordone nervoso ventrale trova è visibile. </li><li> Fissare i muscoli flessori dorsali anteriormente (a destra). Questo dovrebbe essere fatto in posizione di massima allungato con perni in modo da non bloccare la visione e il campione rimane tesa. Quando i filamenti muscolari dorsali sono fissi (Figura 8-1), il primo gangli addominali, A1 e A2, con i nervi associati N1, N2, N3 e sono visibili (Figura 8). </li><li> Utilizzare pinze nella mano sinistra per afferrare le specificheImen in una sola apertura delle gambe a piedi. Durante il seguente dissezione passaggi tirare delicatamente per mantenere il campione aperto. </li><li> Transect i nervi N3 nella posizione più distante dal cordone nervoso. (Figura 8-3). </li><li> Tagliare i muscoli flessori vicino al apodeme ventrale come mostrato nella Figura 8-4. Fare attenzione a non danneggiare il cordone nervoso o nervi N2. </li><li> Ripetere i passaggi 2.18 e 2.19 per i nervi N3 e dei muscoli flessori della restante gangli A2 addominale A5. </li><li> Nell'ultima ganglio addominale, A6, tagliare i muscoli flessori dorsali dal apodeme ventrale e il campione dovrebbe apparire come mostrato nella Figura 9. </li><li> Tagliare la piastra posteriore sternale ai nervi della A6 (Figura 9-1) e tenere la parte ventrale (Figura 9-2). Eliminare la parte dorsale con i muscoli flessori (Figura 9-3). Fissare la piastra sternale anteriormente con perni attraverso le aperture delle gambe piedi,e posteriormente a A6. </li></ol> 3. Belle Dissection <ol><li> Porre il preparato al microscopio con la parte anteriore rivolta di distanza e la parte posteriore verso il bordo dei tavoli. </li><li> Utilizzare pinze come mostrato in Figura 10A per rimuovere le parti più anteriori della sterna cephalothoracic. NOTA: I gangli del torace e nervi associati sono in parte coperti dalla muscolatura delle gambe e sterna cephalothoracic. La sterna cephalothoracic formare uno scheletro che separa le cavità situate lateralmente delle gambe piedi una dall'altra e dalla cavità mediale in cui il cordone nervoso ventrale risiede. </li><li> Tagliare i muscoli tra le rimanenti strutture Esoscheletriche come indicato in Figura 10B -1 e B2. Utilizzare pinze per afferrare e sollevare l'estremità anteriore del cordone nervoso ventrale (Figura 10C). NOTA: Il cordone nervoso sarà danneggiato nel processo in modo da evitare raccogliendo Nerve il cavo più volte. </li><li> Tagliare i nervi toracici laterale mentre si solleva il cordone nervoso (Figura 10C-3). Mantenere questi nervi a lunghezza adeguata per appuntare. Rimuovere la parte spremuto della catena di gangli, che è stato raccolto con una pinza, tagliando via tutto il anterior tessuto T4 (Figura 10C-4). </li><li> Posizionare il campione con la parte anteriore verso sinistra e concentrarsi su A1. Tagliare il N1 e N2 di nervi A1 ad una lunghezza adeguata (max. 1 cm) di spinatura fuori. </li><li> Focus su A2 e identificare i nervi N1, N2, N3 e di questo segmento (Figura 11). I nervi N1 di gangli addominali A2-A5 risiedono tra due ripiegamenti cuticolari sternale in ogni segmento (Figura 11A-1) e sono coperti da muscolatura. Fare un taglio lungo la parte posteriore dello sterno ripiegamento cuticolare. Inizia il bordo laterale dell'addome e procedere verso la linea mediana, come mostrato in Figura 11A. </li><li> Se la destinazione è ancora N1 coverosso con il tessuto come mostrato in Figura 11B (freccia rossa), tutto il taglio del fascio muscolare, ma questa volta anterior per entrambi ripiegamenti cuticolari sternali e il nervo N1 (Figura 11B-2). </li><li> Tagliare nervo N1 distale possibile (Figura 11 C-3). Nerve N1 è completamente visibile e il ramo anteriore e posteriore può essere identificato (Figura 11C). </li><li> Procedere alla N1 nervo controlaterale e la prima tagliare i muscoli lungo la parte posteriore dello sterno ripiegamento cuticolare, partendo medialmente, vicino il ganglio (Figura 11D). Se il nervo è ancora coperto da tessuto, tagliare il fascio muscolare, ma questa volta anterior per entrambi ripiegamenti cuticolari sternali e il nervo N1, simile alla figura 11B-2. Tagliare il N1 nervo distale possibile. </li><li> Tagliare il nervi N2 del ganglio ad una lunghezza adatta (circa. 0,5 centimetri) di spinatura. </li><li> Ripetere i passaggi 3,7-3,11 per i nervi di A3-A5. </li><li> Tagliare il nerves di ganglio A6 distalmente possibile (Figura 12A). Utilizzare pinze per afferrare più nervi di A6 per sollevare questo ganglio e avviare isolare la catena dei gangli dalla piastra sternale. </li><li> Mentre si solleva il cordone nervoso, tirare delicatamente nella parte anteriore, come mostrato nella Figura 12B (freccia bianca). Poiché i singoli gangli sono sollevati, rimuovere l'arteria ventrale che può essere attaccato al lato ventrale del cordone nervoso (Figura 12C). Continua questa sequenza (delicatamente) tirare taglio fino a quando il cordone nervoso è completamente isolato. </li><li> Trasferire la catena isolata dei gangli di una capsula di Petri rivestito con chiaro Sylgard e riempito con soluzione salina gamberi (Figura 12D). </li></ol> 4. Pinning cordone nervoso nella piastra di Petri NOTA: Usare piccoli perni tagliati da filo di acciaio inossidabile (vedi supplementi) per bloccare il cordone nervoso. Toccare solo il nervo che termina con le pinze e non fare squeezvia e connettivi o gangli. <ol><li> Pin la catena di gangli in linea retta, mentre si applica tratto delicato. </li><li> Disporre il cordone nervoso nella capsula di Petri con il lato dorsale verso l'alto (Figura 13, linea nera). Il lato ventrale dei gangli può essere identificato dal suo convessità; lato dorsale è piatto. Pin i nervi toracici ai lati. Continuare con i nervi di A6, si estende il cordone nervoso lungo il suo asse longitudinale. </li><li> Pin i nervi di A1 ad un angolo di 90 ° rispetto al cordone nervoso. </li><li> Procedere alla A2 e pin nervi N2 ad un angolo di 35-45 ° rispetto al cordone nervoso (Figura 1A). </li><li> Separare i nervi N1 nelle loro anteriori e posteriori rami prima pinning come mostrato nella Figura 14. Utilizzare due coppie di pinze sottili a prendere con un paio di pinze anteriore e con l'altra il ramo posteriore del nervo N1. Fare attenzione a scegliere solo alla fine più distales dei rami nervosi. Ora tirare con cautela. </li><li> Pin il ramo anteriore del nervo N1 ad un angolo di 90 ° rispetto al cordone nervoso (Figura 1A). Pin il ramo posteriore del nervo N1 tra il ramo N1 anteriore e il nervo N2. </li><li> Ripetere la procedura 4,4-4,6 per i nervi dei gangli A3-A5. Mentre fissarsi il tratto cordone nervoso in longitudinale e senso trasversale. </li></ol> 5. Desheathing gangli <ol><li> Posizionare il preparato in modo tale che le mani del sperimentatore sono sempre appoggiati su un piano stabile per evitare scuotimento. Per desheath i gangli illuminano il cordone nervoso dal basso. </li><li> Focus su qualsiasi gangli A1 addominale A5. Usare le forbici primavera pregiati per fare un piccolo taglio laterale attraverso la guaina gangli, posteriore al ganglio e tra i nervi N2 e N3 (Figura 15A freccia rossa). </li><li> Sollevare la guaina ganglio utilizzando molto fpinze ine e tagliati trasversalmente attraverso la guaina sopra connettivi, come indicato in Figura 15A-1. Fare attenzione a non comprimere o tagliare il cordone nervoso con le forbici. </li><li> Sempre tenendo e sollevando la guaina gangli con una pinza continuano a tagliare lungo i bordi laterali del ganglio (Figura 15B-2 e -3). Rimuovere la guaina. Alternativamente pin per entrambi i lati dei connettivi in ​​modo tale che è fisso, ma il cordone nervoso non venga schiacciato. </li><li> Ripetere i passaggi 5,2-5,4 per tutti addominale gangli A1 a A5. </li><li> Desheathe i gangli del torace e il ganglio A6 in modo simile. Per desheathe A6 anteriori inizio al ganglio e procedere in direzione posteriori. Pin guaina gangli della A6 alla estremità posteriore della catena di gangli. </li></ol> 6. extracellulare registrazioni da Motor neuroni <ol><li> Montare tutti gli strumenti ei materiali utilizzati per le registrazioni extracellulari indicati in Figura 16B ed elencati nei supplementi. Una panoramica del sistema di registrazione è mostrato in Figura 16A. Avviare tutte le apparecchiature elettroniche utilizzate in questo esperimento (Figura 16C), in modo che gli amplificatori possono riscaldarsi per almeno 30 minuti prima della registrazione. Accendere il computer e avviare il software di registrazione. </li><li> Posizionare la catena di gangli sul tavolo microscopio e illuminare dal basso. Inserire l'elettrodo di registrazione nel sylgard vicino al nervo bersaglio e l'elettrodo di riferimento in una posizione vicina, ma lateralmente alla gangli (Figura 17A e B). Piegare il nervo target intorno l'elettrodo di registrazione (Figura 17C). </li><li> Stretch il nervo leggermente, per assicurare il contatto tra l'elettrodo e il nervo e il pin di lato (F IGURA 17D). Fissare i cavi degli elettrodi al tavolo del microscopio con plastilina, in modo da rimanere nella posizione desiderata. </li><li> Utilizzare unsiringa piena di vaselina e un ago calibro 20 (con punta arrotondata) (Figura 17E-3) per isolare il nervo bersaglio dalla soluzione di balneazione. Prima tamponare alcuni vaselina sulla sylgard intorno l'elettrodo di registrazione. Il risultato è uno strato di vaselina copre il Sylgard in prossimità dell'elettrodo di registrazione (Figura 17E-4). Fare attenzione a non tamponare direttamente sul nervo e di evitare bolle d'aria in questo strato. </li><li> Sigillare l'elettrodo di registrazione con vaselina da tutti i lati fino al livello della superficie della soluzione salina (Figura 17F). </li><li> Ripetere questa procedura per tutti i nervi di destinazione cui attività devono essere monitorati. </li><li> Avviare la registrazione. Utilizzare una modalità di acquisizione gratuita continuo o gap e una frequenza di campionamento di 5 kHz. Impostare l'amplificatore extracellulare ai seguenti parametri; guadagnare a 1.000 (amplifica il segnale 1.000 volte, aver cura di includere questo parametro di amplificazione nelle impostazioni del software di acquisizione) unada gamma filtro passa-banda di 300 Hz (taglio basso) a 2.000 Hz (high cut). </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

<html> L&#39;anatomia di gamberi e la loro gangli addominali è stata descritta in precedenza 5, 18, ​​19, 20 e si consiglia di acquisire familiarità con essi prima della dissezione, per evitare il taglio dei nervi importanti. È fondamentale per mantenere il preparato a temperature inferiori a 23 ° C per evitare la degradazione del cordone nervoso isolato. Ciò può essere ottenuto facilmente mediante sostituzione della soluzione di balneazione ogni 20-30 min con soluzione salina gamb...

I swimmerets di gamberi hanno una funzione di controllo della postura e battere ritmicamente quando gli animali nuotano in avanti, ventilare le loro tane o femmine aerare le loro uova 5, 6. I swimmerets del gambero del segnale, Pacifastacus leniusculus, si verificano in coppie dalla seconda alla quinta segmento addominale, con un arto su ciascun lato dell'addome 7. Il sistema nervoso centrale produce propria ticchettio motore ritmica che aziona il movimento swimmeret nell'animale intatto nonché nella preparazione isolato cordone nervoso. Quando non c'è feedback sensoriale o discendente ingresso presente modello motore ritmica prodotta viene chiamato locomozione fittizia 1, 2. Nel sistema swimmeret questo schema motorio non differisce in qualsiasi parametro dall'attività delle swimmerets misurati nell'animale intatto. Il movimento di ciascun swimmeret è guidato da un microcircuito che si trova dentro e limitato a una corresponding hemiganglion 1 -. 3 In ogni microcircuito c'è un kernel generano tracciati che comprende cinque interneuroni identificati non spike. Essi possono essere funzionalmente caratterizzati come sia Inhibitor of Power Stroke (IPS) o inibitore della corsa di ritorno (IRS) 8. Questi IPS e interneuroni IRS non sono oscillatori endogeni, piuttosto la loro attività di alternanza è guidato da inibizione reciproca 9. Poiché questi interneuroni inibiscono direttamente i motoneuroni swimmeret, il movimento alternato PS-RS è generato 10. Locomotion tuttavia, non solo richiede la generazione di attività, ma anche il coordinamento dei vari microcircuiti indipendenti. Nel sistema swimmeret tale coordinamento è stabilito dal microcircuito coordinamento che assicura che gli arti sono attivi a volte corretti. Questo microcircuito è costruito da tre neuroni identificati in ogni segmento 11-15. Questo protocollo prevede the prima volta una guida passo-passo dissezione per isolare la catena di gangli (T4 al A6, Figura 1). Mostriamo come al pin isolato cordone nervoso addominale e desheathe ogni ganglio. In questo isolato preparazione del sistema nervoso, i neuroni responsabili del movimento swimmeret sono pronti per l'uso negli esperimenti elettrofisiologici e morfologici. La seconda parte di questo protocollo illustra le caratteristiche principali del modello del motore swimmeret. Ciò include una guida step-by-step per registrare extracellulare l'attività dei motoneuroni swimmeret. Gli assoni dei neuroni motori RS proiettano attraverso il ramo anteriore del nervo N1, mentre assoni dei motoneuroni PS proiettano attraverso il ramo posteriore dello stesso nervo (Figura 1) 4. Quindi la loro attività può essere registrato da questi rami con elettrodi pin differenziali. <img alt="Diagramma della struttura neurale e illustrazione etichettata per lo studio dell'anatomia, evidenziando i rami nervosi." fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig1highres.jpg" width="200" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Isolati sistema nervoso dal ganglio toracico 4 (T4) per ganglio addominale 6 (A6) e un diagramma schematico di esso T4:. Ganglio toracico 4; T5: ganglio toracico 5; A1, A2 ... A6 ganglio addominale 1, ganglio addominale 2 ... ganglio addominale 6; N1: nervo N1; N2: nervo N2; N3: nervo N3; PS: power-stroke; RS: return-stroke. Abbreviazioni direzionali: A = anteriore; P = posteriori. Questa procedura dissezione e la tecnica dimostrata elettrofisiologico sono convenienti per gli studenti universitari e studenti possono integrare corsi pratici in fisiologia. La catena di gangli isolato è stato utilizzato in una serie di esperimenti per studiare la funzione del sistema nervoso, coordinamento, o la modulazione di microcircuiti swimmeret 6 così come il controllo neuronale del comportamento adattativo in locomozione 16, 17. Il sistema gamberi swimmeret fornisce pertanto una quantità enorme di insegnamento interessanti o tPiove opportunità che iniziano tutti con la dissezione del cordone nervoso ventrale di gamberi e la registrazione extracellulare del pattern motorio fittizia.

<table><tbody><tr><td>Amplificatore extracellulare a 4 canali: MA 102&nbsp;</td><td>Amplificatore</td><td>Elektroniklabor, Zoologie, Universit&auml; t zu K&ouml; ln, Germania</td><td></td></tr><tr><td>air-table</td><td></td><td>Technical Manufacturing Corporation (TMC) un'unità di AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA</td><td>63-534</td></tr><tr><td>Axon Digidata 1440A</td><td>Digitizer</td><td>Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA</td><td>DD1440A</td></tr><tr><td>grande secchio...</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clampex & Clampfit</td><td>pClamp 10, software di registrazione e analisi</td><td>Molecular Devices Design, Union City, CA</td><td>pClamps 10</td></tr><tr><td>Sorgente di lampada fredda</td> standard <td>con guida di luce flessibile (pacchetto di fibre ottiche)&nbsp;</td><td>Microscopi Euromex olanda, Arnhem, BD</td><td>LE.5211 & LE.5235</td></tr><tr><td>computer e monitor</td><td>dotato di software</td><td></td><td></td>di registrazione</tr><tr><td>contenitore e pipetta per rifiuti liquidi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina per gamberi&nbsp;</td><td>contiene (in mM): 5,4 KCl, 2,6 MgCl2, 13,5 CaCl2 e 195 NaCl, tamponato con 10 mM di base Tris e 4,7 mM di acido maleico; aerato per 3 ore. Regolare a pH di 7,4.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dextran, Texas Red (3000MW, lisina fissabile)</td> <td>colorante fluorescente, lisina fissabile</td><td>Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germania</td><td>D3328</td></tr><tr><td>piatto di dissezione</td><td>(l x p x a) 15x7x5 cm; linnato con</td> perni di fissaggio per gabbia di Faraday in silicone <td></td><td></td>nero</tr><tr><td>pinze (biologia, Dumont #5)</td><td>Pinze: Biologia, punta 0,05 x 0,02 mm, lunghezza 11cm, INOX</td><td>Fine Science Tools (FST), Germania</td><td>11252-20</td></tr><tr><td></td> pinze (biologia, Dumont #55)Pinze: Biologia, punta 0,05 x 0,02 mm, lunghezza 11cm, INOX <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Fine Science Tools (FST), Germania</td><td>11255-20</td></tr><tr><td>pinze (elettroniche, Dumont #5)</td><td>Pinze: standard, punta 0,1 x 0,06 mm, lunghezza 11 cm, INOX</td><td>Fine Science Tools (FST), Germania</td><td>11251-20</td></tr><tr><td>elettrodo intracellulare</td><td>Capillari in vetro borosilicato (diametro esterno/interno: 1 mm/0,5 mm), con filamento</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>BF100-50-10</td></tr><tr><td>Leica S8 Apo StereoZoom</td><td>Microscopio di dissezione&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Zoom 1x - 8x</td><td>Leica, Germania</td><td>10446298</td></tr><tr><td>specchio da tavolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>per microscopio per illuminare la preparazione dal basso</td><td></td><td></td></tr><tr><td>modellazione in argilla</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Microscopio da dissezione<td>Olympus SZ61</td><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Zoom 0,67x - 4,5x</td><td>Olympus, Germania</td><td></td></tr><tr><td>Capsula di Petri</td><td>94 x 16 mm; foderato in silicone trasparente</td><td>Greiner bio-one, Germania</td><td>633180</td></tr><tr><td>forbici ad anello</td><td>ThoughCut, tagliente: affilato/smussato, dritto: 13 cm</td><td>Fine Science Tools (FST), Germania</td><td>14054-13</td></tr><tr><td>forbici a molla o in alternativa: forbici a molla Vannas</td><td>tagliente: 8 mm, diametro della punta: 0,2 mm, dritto: 10 cm o tagliente 2,5 mm, diametro della punta 0,075 mm, dritto: 8 cm</td><td>Fine Science Tools (FST), Germania</td><td>15024-10 o &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 15000-08</td></tr><tr><td>studente Vannas&nbsp; forbici a molla o alternativa:&nbsp; Forbici a molla Moria tagliente</td><td>: 5 mm, diametro della punta: 0,35 mm, diritta: 9 cm o tagliente: 5 mm, diametro della punta 0,1 mm, diritta: 8 cm</td><td>Fine Science Tools (FST), Germania</td><td>91500-09 o&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 15396-00</td></tr><tr><td>sylgard</td><td>184 Base in elastomero siliconico e agente indurente; per il sylgard nero aggiungere carbone attivo</td><td>Siringa Dow Corning, Midland, MI, USA</td><td></td></tr><tr><td>riempita di vaselina e dotata di un ago da 20 gauche con punta</td><td></td><td></td><td></td> arrotondata</tr></tbody></table>

il sistema swimmeret di gamberi: una guida pratica per la dissezione del cavo di nerve e extracellulari registrazioni del modello motor

The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Qui mostriamo la dissezione del cordone nervoso addominale gamberi. La preparazione comprende gli ultimi due gangli toracica (T4, T5) e la catena di gangli addominali (A1 al A6). Questa catena di gangli comprende la parte del sistema nervoso centrale (CNS) che guida locomozione coordinata dei pleopodi (swimmerets): il sistema swimmeret. E &#39;noto per oltre cinque decenni in gamberi ogni swimmeret è guidato da un proprio kernel generano tracciati indipendenti che genera attività alternanza ritmica 1-3. I motoneuroni che innervano la muscolatura di ogni swimmeret comprendono due anatomicamente e funzionalmente distinte popolazioni 4. Uno è responsabile per la retrazione (corsa di potenza, PS) del swimmeret. Altre unità la protrazione (corsa di ritorno, RS) del swimmeret. Neuroni motori del sistema swimmeret sono in grado di produrre spontaneamente uno schema motorio fittizia, che è identico al modello registrato in vivo </em&gt; 1. Lo scopo di questo rapporto è quello di introdurre un interessante e conveniente sistema modello per lo studio delle reti di generazione del ritmo e il coordinamento di microcircuiti indipendenti per i corsi di laboratorio pratico degli studenti. Il protocollo fornito include le istruzioni passo-passo per la dissezione del cordone nervoso addominale del gambero di fiume, pinning della catena isolato di gangli, desheathing gangli e registrando il swimmerets fittizia pattern motorio extracellulare dal sistema nervoso isolato. Inoltre, siamo in grado di monitorare l&#39;attività dei neuroni swimmeret registrati intracellulare di dendriti. Qui abbiamo anche una breve descrizione di queste tecniche e fornire alcuni esempi. Inoltre, la morfologia dei neuroni swimmeret può essere valutata utilizzando varie tecniche di colorazione. Qui forniamo esempi di intracellulare (dalla ionoforesi) tintura piena neuroni e riporti di pool di motoneuroni swimmeret. Nel nostro laboratoriousiamo questa preparazione per studiare le funzioni di base di locomozione fittizia, l&#39;effetto di feedback sensoriale sull&#39;attività del SNC, e il coordinamento tra microcircuiti a livello cellulare.

Con le registrazioni extracellulari simultanee da RS e PS, motoneuroni di uno ganglio, l'attività alternata di queste piscine motoneuroni, può essere monitorato (Figura 18), che rappresenta lo schema locomozione fittizia. <img alt="Analisi degli impulsi neuronali, diagramma con segnali marcati RS, PS; configurazione sperimentale e forme d'onda." src="/files/ftp_upload/52109/52109fig18highres.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 18"> Figura 18: S...

Qui descriviamo la dissezione del cordone nervoso addominale del gambero. Dimostriamo anche una tecnica elettrofisiologica per registrare la locomozione fittizia dai motoneuroni nuotatori.

Il Sistema swimmeret di gamberi: Una guida pratica per la dissezione del cavo di Nerve e extracellulari registrazioni del modello Motor

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è sezionare il cordone nervoso addominale dal gambero per utilizzarlo negli studi elettrofisiologici. Ciò si ottiene anestetizzando prima il gambero. Successivamente, viene eseguita una dissezione grossolana per isolare la placca ventrale del gambero.Quindi viene eseguita una dissezione fine per isolare completamente il sistema nervoso centrale dai gangli raici ai gangli addominali. Un sei. Infine, la guaina gangliare viene rimossa da tutti i gangli per facilitare gli esperimenti elettrofisiologici.In definitiva, la catena dei gangli addominali viene utilizzata per registrazioni extra o intracellulari. Studiare la coordinazione di generatori di pattern centrali o indagare la morfologia e il contesto sinaptico di neuroni identificati. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come fornire un'esperienza pratica sulla funzione della rete nervosa per essere in grado di registrare il movimento della FLA nel sistema nervoso isolato, o per caratterizzare la morfologia dei gangli addominali o quella di neuroni specifici.Anche se questo metodo può fornire informazioni sul sistema di velocità di nuoto dei gamberi. Può anche essere applicato ad altri sistemi come una rete neuronale che guida il comportamento di capovolgimento della coda nei gamberi Lavorare con il gambero Pacific Stacia Linea Guus. Dopo aver anestetizzato un animale secondo il protocollo di testo, tenere il lato ventrale rivolto verso l'alto e utilizzare forbici forti per tagliare entrambi gli artigli alla base vicino al torace.Quindi rimuovere le cialde euro sinistra e destra. Posizionare l'animale con il lato ventrale rivolto verso l'alto in un piatto di dissezione foderato con sard nero prima di utilizzare soluzione salina fredda per perfondere attraverso l'apertura dell'unghia. Quindi, usa delle forbici forti per fare un singolo taglio trasversale appena dietro gli occhi del gambero per decapitarlo.Quindi rimuovere tutte le zampe mobili vicino alle articolazioni di base per isolare l'addome insieme agli ultimi segmenti toracici dal resto del torace. Inserire la punta delle forbici nell'apertura della seconda gamba scorrevole e tagliare sul lato opposto. Dopo aver esteso il taglio su entrambi i lati attraverso il torace ed esposto alcuni degli organi interni come descritto nel protocollo di testo, rimuovere la parte anteriore del torace.Ora rimuovi gli organi interni e sciacqua l'animale con soluzione salina fredda. Continuare la dissezione con un taglio in posizione laterale massimale tra il lumon e i ratti nuotatori per tutta la lunghezza della placca sternale. Fai lo stesso taglio dall'altro lato.Posizionare l'addome del gambero con il lato ventrale rivolto verso l'alto nella capsula di dissezione. Utilizzare spilli per insetti per fissare l'esemplare posteriormente al tellson e anteriormente ai resti del carabase. Riempite il piatto con soluzione salina per gamberi in modo che copra l'esemplare.Utilizzare una pinza grossolana nella mano sinistra per afferrare attraverso l'apertura di una gamba mobile e aprire il campione. Identificare i due grandi filamenti muscolari flessori dorsali. Fissali e taglia le loro basi ventrali e l'arteria sternale.Esporre i primi gangli addominali A uno e i nervi associati N uno N due. Passiamo ora al secondo segmento addominale. Rimuovere la base dei filamenti muscolari vicino alla base ventrale.Il ganglio addominale A due è ora visibile con i nervi associati N uno, N due e N tre. Sezionare i nervi N tre nella posizione più distante dal cordone nervoso. Ripeti questi passaggi per i prossimi tre segmenti addominali con i gangli addominali.Un tre a un cinque. Quando si raggiunge il ganglio addominale, un sei. Tagliare la placca sternale posteriormente ai nervi di un sei.Mantieni la parte ventrale e fissala. Lato dorsale rivolto verso l'alto nel piatto riempito di soluzione salina al microscopio. Usa una pinza per rimuovere le parti più anteriori del cephalon toracico stern.Quindi tagliare i muscoli tra le restanti strutture esoscheletriche. Dopo aver sollevato con cautela l'estremità anteriore del cordone nervoso ventrale, tagliare lateralmente i nervi toracici. Concentrati su uno e taglia i nervi N uno e N due di uno a un massimo di un centimetro di lunghezza per bloccarli.Quindi, passa ad A due e identifica i nervi N uno, N due e N tre di questo segmento. I nervi n uno dei gangli addominali, da due a cinque. Risiedono tra due cuticolari sternali in dispiegamenti in ciascun segmento e sono ricoperti dalla muscolatura.Quindi, iniziando dal bordo laterale dell'addome, fare un taglio lungo l'avvolgimento cuticolare sternale posteriore e procedere verso la linea mediana Dopo aver scoperto N uno secondo il protocollo di testo. Se necessario, tagliare il nervo il più distalmente possibile. Procedere verso il lato controlaterale e iniziare a isolare il nervo N, uno dalla linea mediana vicino al ganglio procedendo verso il bordo laterale tagliando lungo l'avvolgimento cuticolare sternale posteriore.Ora taglia i nervi N due di questo ganglio a una lunghezza adatta per il fissaggio. Quindi ripetere i passaggi mostrati per i gangli addominali. Un due per un tre a un cinque il più distalmente possibile.Taglia i nervi del ganglio a sei. Usa il forcipe per afferrare più nervi di un sei per sollevare il ganglio e iniziare a isolare la catena dei gangli dalla placca sternale. Dopo aver isolato completamente il cordone nervoso, trasferire la catena dei gangli in una capsula di Petri rivestita con davanzale trasparente e riempita di soluzione salina utilizzando piccoli perni tagliati da filo di acciaio inossidabile mentre si applica un tocco delicatamente elastico.Appuntare la catena dei gangli in linea retta con il cordone nervoso disposto con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Conserva solo gli ultimi due gangli toracici e fissa i nervi toracici di lato. Fissa i nervi di uno con un angolo di 90 gradi rispetto al cordone nervoso.Quindi procedere a un due e bloccare i nervi N due con un angolo di 35-45 gradi rispetto al cordone nervoso. Una volta che i nervi N uno sono stati separati e bloccati secondo il protocollo di testo, fissare il ramo anteriore del nervo N uno con un angolo di 90 gradi rispetto al cordone nervoso. Quindi appuntare il ramo posteriore del nervo N uno tra il ramo anteriore N uno e il nervo N due.Poiché tutti i gangli addominali devono essere rivestiti, utilizzare delle forbici a molla fine per eseguire un piccolo taglio laterale attraverso la guaina gangliare posteriormente al ganglio e tra i nervi N due e N tre. Tagliare trasversalmente la guaina sopra il connettivo. Quindi continuare a tagliarlo lungo i bordi laterali del ganglio prima di rimuovere la guaina.Se necessario, utilizzare una pinza fine per sollevare la guaina ed eseguire registrazioni extracellulari. Dopo aver impostato gli strumenti e i reagenti elencati nel protocollo di testo, posizionare la catena di gangli sul tavolo del microscopio e illuminare dal basso. Inserire l'elettrodo di registrazione nella protezione silattica vicino al nervo bersaglio e l'elettrodo di riferimento in una posizione vicina ma laterale ai gangli.Quindi piega il nervo bersaglio attorno alla registrazione. Dopo aver allungato e fissato il nervo, utilizzare una siringa riempita di vaselina e un ago calibro 20 con punta arrotondata per isolare il nervo bersaglio dalla soluzione balneare. Ripetere l'operazione per tutti i nervi la cui attività deve essere registrata.Infine, inizia a registrare come mostrato qui, l'attività PS extracellulare dei motoneuroni PS omolaterali da due a PS cinque inizia con un lampo PS in un cinque e l'onda di eccitazione si propaga nella direzione anteriore. Inoltre, il tempo misurato dall'inizio di una raffica all'inizio della raffica successiva in ciascun segmento rimane costante ed è definito come il periodo dei periodi ritmici e della raffica. La durata può variare tra le diverse preparazioni, ma il ritardo di fase tra i segmenti rimane costante a circa un quarto del ciclo indipendentemente dalla frequenza del ritmo.Questi modelli di coordinazione possono essere visti meglio negli istogrammi di fase visti qui. Qui, utilizzando micro elettrodi affilati, le registrazioni intracellulari dai dendriti dei motoneuroni Ps.Motor mostrano oscillazioni di enfasia dei singoli neuroni con l'attività registrata extracellulare di tutti i motoneuroni PS dello stesso emiganglio. Per identificare i neuroni registrati intracellulari, le cellule possono essere riempite utilizzando micro elettrodi affilati e ionoforesi.In questa figura, la soda ventrale di due motoneuroni PS riempiti di si trova posteriormente alla base del nervo N. Il neurite primario sporge anteriormente e si ramifica all'interno della pillola neuro laterale. L'assone sporge attraverso il ramo posteriore del nervo N fino alla muscolatura.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 45 minuti o un'ora se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di cambiare la soluzione salina a intervalli regolari per mantenere sano il tessuto nervoso. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la registrazione intracellulare dei motoneuroni o degli interneuroni per rispondere a ulteriori domande come l'analisi del meccanismo cellulare di coordinazione, misurare le correnti ioniche o studiare l'effetto dei neuromodulatori sull'attività ritmica di cellule specifiche.

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