Il Sistema swimmeret di gamberi: Una guida pratica per la dissezione del cavo di Nerve e extracellulari registrazioni del modello Motor

L'obiettivo generale di questa procedura è sezionare il cordone nervoso addominale dal gambero per utilizzarlo negli studi elettrofisiologici. Ciò si ottiene anestetizzando prima il gambero. Successivamente, viene eseguita una dissezione grossolana per isolare la placca ventrale del gambero.

Quindi viene eseguita una dissezione fine per isolare completamente il sistema nervoso centrale dai gangli raici ai gangli addominali. Un sei. Infine, la guaina gangliare viene rimossa da tutti i gangli per facilitare gli esperimenti elettrofisiologici.

In definitiva, la catena dei gangli addominali viene utilizzata per registrazioni extra o intracellulari. Studiare la coordinazione di generatori di pattern centrali o indagare la morfologia e il contesto sinaptico di neuroni identificati. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come fornire un'esperienza pratica sulla funzione della rete nervosa per essere in grado di registrare il movimento della FLA nel sistema nervoso isolato, o per caratterizzare la morfologia dei gangli addominali o quella di neuroni specifici.

Anche se questo metodo può fornire informazioni sul sistema di velocità di nuoto dei gamberi. Può anche essere applicato ad altri sistemi come una rete neuronale che guida il comportamento di capovolgimento della coda nei gamberi Lavorare con il gambero Pacific Stacia Linea Guus. Dopo aver anestetizzato un animale secondo il protocollo di testo, tenere il lato ventrale rivolto verso l'alto e utilizzare forbici forti per tagliare entrambi gli artigli alla base vicino al torace.

Quindi rimuovere le cialde euro sinistra e destra. Posizionare l'animale con il lato ventrale rivolto verso l'alto in un piatto di dissezione foderato con sard nero prima di utilizzare soluzione salina fredda per perfondere attraverso l'apertura dell'unghia. Quindi, usa delle forbici forti per fare un singolo taglio trasversale appena dietro gli occhi del gambero per decapitarlo.

Quindi rimuovere tutte le zampe mobili vicino alle articolazioni di base per isolare l'addome insieme agli ultimi segmenti toracici dal resto del torace. Inserire la punta delle forbici nell'apertura della seconda gamba scorrevole e tagliare sul lato opposto. Dopo aver esteso il taglio su entrambi i lati attraverso il torace ed esposto alcuni degli organi interni come descritto nel protocollo di testo, rimuovere la parte anteriore del torace.

Ora rimuovi gli organi interni e sciacqua l'animale con soluzione salina fredda. Continuare la dissezione con un taglio in posizione laterale massimale tra il lumon e i ratti nuotatori per tutta la lunghezza della placca sternale. Fai lo stesso taglio dall'altro lato.

Posizionare l'addome del gambero con il lato ventrale rivolto verso l'alto nella capsula di dissezione. Utilizzare spilli per insetti per fissare l'esemplare posteriormente al tellson e anteriormente ai resti del carabase. Riempite il piatto con soluzione salina per gamberi in modo che copra l'esemplare.

Utilizzare una pinza grossolana nella mano sinistra per afferrare attraverso l'apertura di una gamba mobile e aprire il campione. Identificare i due grandi filamenti muscolari flessori dorsali. Fissali e taglia le loro basi ventrali e l'arteria sternale.

Esporre i primi gangli addominali A uno e i nervi associati N uno N due. Passiamo ora al secondo segmento addominale. Rimuovere la base dei filamenti muscolari vicino alla base ventrale.

Il ganglio addominale A due è ora visibile con i nervi associati N uno, N due e N tre. Sezionare i nervi N tre nella posizione più distante dal cordone nervoso. Ripeti questi passaggi per i prossimi tre segmenti addominali con i gangli addominali.

Un tre a un cinque. Quando si raggiunge il ganglio addominale, un sei. Tagliare la placca sternale posteriormente ai nervi di un sei.

Mantieni la parte ventrale e fissala. Lato dorsale rivolto verso l'alto nel piatto riempito di soluzione salina al microscopio. Usa una pinza per rimuovere le parti più anteriori del cephalon toracico stern.

Quindi tagliare i muscoli tra le restanti strutture esoscheletriche. Dopo aver sollevato con cautela l'estremità anteriore del cordone nervoso ventrale, tagliare lateralmente i nervi toracici. Concentrati su uno e taglia i nervi N uno e N due di uno a un massimo di un centimetro di lunghezza per bloccarli.

Quindi, passa ad A due e identifica i nervi N uno, N due e N tre di questo segmento. I nervi n uno dei gangli addominali, da due a cinque. Risiedono tra due cuticolari sternali in dispiegamenti in ciascun segmento e sono ricoperti dalla muscolatura.

Quindi, iniziando dal bordo laterale dell'addome, fare un taglio lungo l'avvolgimento cuticolare sternale posteriore e procedere verso la linea mediana Dopo aver scoperto N uno secondo il protocollo di testo. Se necessario, tagliare il nervo il più distalmente possibile. Procedere verso il lato controlaterale e iniziare a isolare il nervo N, uno dalla linea mediana vicino al ganglio procedendo verso il bordo laterale tagliando lungo l'avvolgimento cuticolare sternale posteriore.

Ora taglia i nervi N due di questo ganglio a una lunghezza adatta per il fissaggio. Quindi ripetere i passaggi mostrati per i gangli addominali. Un due per un tre a un cinque il più distalmente possibile.

Taglia i nervi del ganglio a sei. Usa il forcipe per afferrare più nervi di un sei per sollevare il ganglio e iniziare a isolare la catena dei gangli dalla placca sternale. Dopo aver isolato completamente il cordone nervoso, trasferire la catena dei gangli in una capsula di Petri rivestita con davanzale trasparente e riempita di soluzione salina utilizzando piccoli perni tagliati da filo di acciaio inossidabile mentre si applica un tocco delicatamente elastico.

Appuntare la catena dei gangli in linea retta con il cordone nervoso disposto con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Conserva solo gli ultimi due gangli toracici e fissa i nervi toracici di lato. Fissa i nervi di uno con un angolo di 90 gradi rispetto al cordone nervoso.

Quindi procedere a un due e bloccare i nervi N due con un angolo di 35-45 gradi rispetto al cordone nervoso. Una volta che i nervi N uno sono stati separati e bloccati secondo il protocollo di testo, fissare il ramo anteriore del nervo N uno con un angolo di 90 gradi rispetto al cordone nervoso. Quindi appuntare il ramo posteriore del nervo N uno tra il ramo anteriore N uno e il nervo N due.

Poiché tutti i gangli addominali devono essere rivestiti, utilizzare delle forbici a molla fine per eseguire un piccolo taglio laterale attraverso la guaina gangliare posteriormente al ganglio e tra i nervi N due e N tre. Tagliare trasversalmente la guaina sopra il connettivo. Quindi continuare a tagliarlo lungo i bordi laterali del ganglio prima di rimuovere la guaina.

Se necessario, utilizzare una pinza fine per sollevare la guaina ed eseguire registrazioni extracellulari. Dopo aver impostato gli strumenti e i reagenti elencati nel protocollo di testo, posizionare la catena di gangli sul tavolo del microscopio e illuminare dal basso. Inserire l'elettrodo di registrazione nella protezione silattica vicino al nervo bersaglio e l'elettrodo di riferimento in una posizione vicina ma laterale ai gangli.

Quindi piega il nervo bersaglio attorno alla registrazione. Dopo aver allungato e fissato il nervo, utilizzare una siringa riempita di vaselina e un ago calibro 20 con punta arrotondata per isolare il nervo bersaglio dalla soluzione balneare. Ripetere l'operazione per tutti i nervi la cui attività deve essere registrata.

Infine, inizia a registrare come mostrato qui, l'attività PS extracellulare dei motoneuroni PS omolaterali da due a PS cinque inizia con un lampo PS in un cinque e l'onda di eccitazione si propaga nella direzione anteriore. Inoltre, il tempo misurato dall'inizio di una raffica all'inizio della raffica successiva in ciascun segmento rimane costante ed è definito come il periodo dei periodi ritmici e della raffica. La durata può variare tra le diverse preparazioni, ma il ritardo di fase tra i segmenti rimane costante a circa un quarto del ciclo indipendentemente dalla frequenza del ritmo.

Questi modelli di coordinazione possono essere visti meglio negli istogrammi di fase visti qui. Qui, utilizzando micro elettrodi affilati, le registrazioni intracellulari dai dendriti dei motoneuroni Ps.Motor mostrano oscillazioni di enfasia dei singoli neuroni con l'attività registrata extracellulare di tutti i motoneuroni PS dello stesso emiganglio. Per identificare i neuroni registrati intracellulari, le cellule possono essere riempite utilizzando micro elettrodi affilati e ionoforesi.

In questa figura, la soda ventrale di due motoneuroni PS riempiti di si trova posteriormente alla base del nervo N. Il neurite primario sporge anteriormente e si ramifica all'interno della pillola neuro laterale. L'assone sporge attraverso il ramo posteriore del nervo N fino alla muscolatura.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 45 minuti o un'ora se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di cambiare la soluzione salina a intervalli regolari per mantenere sano il tessuto nervoso. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la registrazione intracellulare dei motoneuroni o degli interneuroni per rispondere a ulteriori domande come l'analisi del meccanismo cellulare di coordinazione, misurare le correnti ioniche o studiare l'effetto dei neuromodulatori sull'attività ritmica di cellule specifiche.