A Novel In vitro Modello per lo studio delle interazioni tra l'uomo di sangue intero e l'endotelio

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le interazioni tra sangue e cellule endoteliali utilizzando un nuovo test della camera endoteliale del sangue. Ciò si ottiene raccogliendo prima il sangue da un volontario sano mediante venipuntura a sistema aperto. Nella seconda fase, il sangue viene accuratamente stratificato su camere ematiche rivestite di eparina accoppiate a vetrini per colture cellulari endoteliali.

Successivamente, queste camere cellulari endoteliali del sangue vengono ruotate delicatamente per facilitare l'interazione tra il sangue e le cellule endoteliali. In definitiva, le interazioni cellula-cellula tra il sangue e le cellule endoteliali e la conseguente produzione di complesso trombina-antitrombina possono essere valutate rispettivamente mediante microscopia a immunofluorescenza ed Eliza. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come quelli che utilizzano modelli animali è che qui un sistema modello umano può essere utilizzato per studiare la malattia vascolare prima di iniziare l'esperimento.

Accoppiare un ago ipodermico calibro 18 a un pezzo di tubo in silicone rivestito con superficie di eparina di due millimetri di diametro interno. Le superfici in plastica sono rivestite con eparina per prevenire l'attivazione aspecifica della coagulazione. Ad esempio, in questa immagine, un coagulo è chiaramente visibile in questa camera non rivestita.

Dopo 30 minuti dal contatto con il sangue, il trattamento della camera con la superficie dell'eparina protegge il sangue dall'attivazione incontrollata, assicurando che i risultati siano dovuti alle interazioni ematiche delle cellule endoteliali. Solo dopo aver collegato il tubo, raccogliere con cura un campione di sangue da un donatore sano mediante venipuntura a sistema aperto in un tubo da 50 millilitri rivestito in superficie di eparina. Integrare il sangue raccolto con eparina non frazionata per raggiungere una concentrazione finale di 0,75 UI per millilitro e capovolgere la provetta due o tre volte per una miscelazione delicata.

Per l'analisi della concentrazione iniziale di proteine nel sangue, mescolare accuratamente un millilitro di sangue per provetta in provette da microcentrifuga contenenti 30 microlitri di K tre EDTA da 10 millimolari e posizionare le provette sul ghiaccio. Quindi utilizzare una punta di pipetta rivestita con superficie di eparina per trasferire 1,5 millilitri di sangue in ciascuna camera cellulare endoteliale del sangue rivestita con superficie di eparina, facendo attenzione a far fluire il sangue lentamente e senza creare bolle per evitare l'attivazione. Quindi, rimuovere le pareti di plastica dai vetrini di coltura delle cellule endoteliali secondo le istruzioni del produttore e lavare delicatamente le cellule endoteliali.

Con la PBS, spostiamo la maggior parte possibile del lavaggio dalle cellule senza lasciare che le colture si asciughino e posizioniamo i vetrini sopra le camere del sangue con le cellule rivolte verso il sangue. Quindi utilizzando scivoli di plastica per un supporto aggiuntivo. Per evitare la rottura dei vetrini per colture cellulari, posizionare un morsetto attorno a ciascuna camera delle cellule endoteliali del sangue per fissare i vetrini.

Ora, ruotare le camere su una ruota rotante in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius a 0,5 Gs per 30 minuti. Dopo la rotazione, smontare le camere cellulari endoteliali del sangue, lavare i vetrini di coltura cellulare in PBS e fissare le cellule in paraldeide ghiacciata all'1% per 10 minuti. Infine, per la valutazione della concentrazione di proteine ematiche attivate, mescolare un millilitro di sangue da ciascuna camera in provette da microcentrifuga contenenti 30 microlitri di K 0,34 molari tre EDTA e porre le provette sul ghiaccio per un massimo di un'ora.

Quindi, dopo aver fatto girare le cellule, conservare il plasma in nuove provette da microcentrifuga a meno 70 gradi Celsius fino a ulteriori analisi. L'attivazione dei fattori della coagulazione è più probabile che si verifichi nel sangue stagnante poiché la probabilità di un'interazione tra i fattori attivati è aumentata. Infatti, il volume di sangue senza alcun movimento da parte delle bolle d'aria è due volte e mezzo più grande.

Quando si aggiungono 1,75 millilitri di sangue alla camera rispetto a quando si utilizzano 1,5 millilitri di sangue, i valori misurati di trombina antitrombina suggeriscono un aumento della formazione di trombina antitrombina con un aumento del volume del sangue. È interessante notare che, quando si viene incubati con entrambi i volumi di sangue intero, non si notano differenze tra i due gruppi, suggerendo che le cellule endoteliali possono modulare l'attivazione della coagulazione per studiare l'effetto del TNF alfa sul reclutamento dei leucociti. In questo esperimento, i qve sono stati trattati con 20 nanogrammi per millilitro di TT NF alfa quattro ore prima del contatto con il sangue, dopodiché è stato quantificato il numero di cellule CD 16 positive.

Il reclutamento delle cellule CD16 positive è aumentato significativamente con il trattamento con TNF alfa da 100 a 256 cellule CD16 positive per millimetro quadrato e 1,5 litri di sangue, e da 172 a 378 e 1,75 millilitri di sangue. La formazione dei complessi trombina-antitrombina è stata quindi misurata nei corrispondenti campioni di plasma provenienti dal sangue incubato con cellule trattate con TNF alfa o non trattate. Come previsto, le cellule stimolate con TNF alfa hanno indotto un raddoppio approssimativo dei complessi trombina antitrombina rispetto ai controlli non trattati dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare, completare e coagulare in un modello in vitro utilizzando cellule primarie umane e sangue intero umano.