Name: A Novel In vitro Modello per lo studio delle interazioni tra luomo di sangue intero e lendotelio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Scopri un nuovo modello in vitro per studiare le interazioni tra sangue umano e cellule endoteliali. Questo metodo consente di analizzare la coagulazione e il reclutamento dei leucociti in un sistema umano.

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Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal Consiglio svedese della ricerca (90293501, A0290401, A0290402), settimo programma quadro della Comunità europea nell&#39;ambito convenzione di sovvenzione n ° 602.699 (DIREKT), la Fondazione NovoNordisk, il Gurli e Edward Brunnberg Foundation, La terapia, vleugel Fondazione e Åke Wiberg Fondazione.

NOTA: Il sangue è stato prelevato da individui sani di prelievo venoso sistema aperto in approvazione presso il Ethical Review Board a Uppsala (Permesso n 2008/264). 1. Le celle semina <ol><li> Colture primarie di cellule umane endoteliali della vena ombelicale (HUVEC) a 37 ° C in 5% di CO 2 in fiasche T75 rivestiti con 1% di gelatina in PBS pH 7.4. </li><li> Rimuovere terreno di coltura da un pallone T75 contenente HUVEC (o altro tipo di cellule endoteliali umane primarie) e lavare le cellule con 2,1 mM EDTA in PBS pH 7,4. Staccare le cellule con l&#39;aggiunta di 1 ml 0,25% tripsina-EDTA e incubazione per 2 - 3 min a 37 ° C. </li><li> Raccogliere cellule sciacquando il pallone con 9 ml di 10% FBS in PBS pH 7,4 e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml. Centrifugare le cellule a 735 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere accuratamente il pellet cellulare in mezzo di crescita delle cellule endoteliali microvascolari (CE GMMV) e contare le cellule in una camera Bürker. Seed 21.000 cells / cm 2 in 1 pozzetti diapositive colture cellulari e incubare a 37 ° C. Il HUVEC sarà confluente dopo 1 - 2 giorni di coltura. Monitorare la morfologia cellulare e la confluenza quotidiana al microscopio ottico. </li></ol> 2. Preparazione di sangue intero <ol><li> Preparare tutte le superfici artificiali che verranno a contatto con il sangue con un doppio strato di eparina immobilizzata (CHS) secondo le istruzioni del produttore. Materiali rivestiti CHS protetti dalla polvere possono essere conservati a temperatura ambiente fino a 6 mesi senza perdita di funzione. </li><li> Utilizzare venipuntura sistema aperto per prelevare il sangue da un donatore sano breve (&lt;30 min) prima di iniziare l&#39;esperimento camera endoteliale nel sangue. Coppia ago ipodermico (18 G x 50 mm) a CHS tubo in silicone rivestito (diametro interno 2 mm) prima di raccogliere accuratamente sangue in una provetta CHS rivestito 50 ml. Supplemento sangue con eparina non frazionata per raggiungere una concentrazione finale di 0,75 IU / ml. Mescolare il sangue delicatamente inverting il tubo di 2 - 3 volte. </li></ol> Modello 3. Sangue endoteliale Camera <ol><li> Realizzare camere di sangue (Figura 1A; vista dall&#39;alto) in acrilico polimetilmetacrilato (PMMA) costituito da due cilindri (altezza 8 mm di raggio 9 mm) che sono incollati a una diapositiva PMMA (25 x 75 mm). Montare i bordi dei cilindri rivolti verso l&#39;alto con O-ring di gomma per sigillare la camera di sangue contro i vetrini con cellule endoteliali coltivate (Figura 1B). Ruotare le camere di sangue collegati alla slitta coltura con cellule endoteliali successivamente in posizione verticale (Figura 1C). </li><li> Utilizzare un puntale CHS rivestito di trasferire 1,5 ml di sangue in ogni CHS rivestiti camera facendo attenzione a non attivare il sangue. </li><li> Trasferire 1 ml di sangue in provette da microcentrifuga contenente 30 ml 0.34 MK 3 EDTA per raggiungere una concentrazione finale di 10 mM K 3 EDTA per la determinazione delle concentrazioni di proteine ​​plasmatiche iniziale utilizzandoun enzima legato Test immunoenzimatico (ELISA). Mescolare accuratamente il sangue e mantenere i tubi in ghiaccio. </li><li> Rimuovere le pareti di plastica delle colture cellulari vetrini in base alle istruzioni del produttore e con attenzione lavare le cellule in PBS pH 7.4. Assicurarsi di rimuovere in seguito quanto più liquido possibile dalle diapositive. Non lasciate che le cellule asciugare. </li><li> Posizionare il vetrino sopra le camere di sangue, con celle di fronte al sangue. Fissare la diapositiva posizionando un morsetto attorno alla camera di cellule endoteliali del sangue. Utilizzare uno scivolo di plastica per un sostegno supplementare per evitare la rottura del vetrino di coltura cellulare quando si posiziona il morsetto. </li><li> Fissare la camera di cellule endoteliali del sangue su una ruota in movimento (40 cm di diametro) posto in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Ruotare ciascuna camera sulla ruota a 0,5 xg per 30 min. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, smontare la camera di cellule endoteliali del sangue. Lavare i vetrini di coltura cellulare in PBS pH 7.4 e fissare le cellule in ghiaccio freddo 1% paraformaldeide (PFA) fo 10 min. Trasferire 1 ml di sangue da ciascuna camera di provette da microcentrifuga contenente 30 ml 0.34 MK 3 EDTA per raggiungere una concentrazione finale di 10 mM K 3 EDTA e mescolare delicatamente le provette. Tenere le provette in ghiaccio. </li><li> Centrifugare le provette a 4560 xg per 10 min a 4 ° C. Trasferire il plasma sanguigno a nuove provette da microcentrifuga e conservare in -70 ° C fino a quando ulteriori analisi. </li></ol> 4. Analisi del sangue endoteliale Interazioni <ol><li> Eseguire immunofluorescenza con il mouse CD16 anti-umano seguita da capra secondario anti-topo Alexa 488 e falloidina-TexasRed. Eseguire ogni fase di colorazione per 1 ora a temperatura ambiente e lavare i vetrini in PBS pH 7,4 tra ogni passo. Controcolorare i nuclei con DAPI per 10 min a temperatura ambiente. Analizzare emocomponenti legati alle cellule endoteliali mediante microscopia a fluorescenza in combinazione con analisi di immagine utilizzando adatto software di analisi di immagini come CellProfiler. </li><li> Quantify le reazioni nel vano di sangue con trombina-antitrombina (TAT) ELISA come da istruzioni dei campioni di plasma del produttore. </li><li> L&#39;uso di adeguati strumenti statistici, ad es., Un t test per dati non appaiati, per analizzare i dati. </li></ol>

<ol><li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+Mice+and+Not+Men%3A+Differences+between+Mouse+and+Human+Immunology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology.</a> J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).</li>
<li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).</li>
<li>Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro+model+to+study+interaction+between+whole+blood+and+biomaterials.+Studies+of+platelet+and+coagulation+activation+acid+the+effect+of+aspirin%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin.</a> Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).</li>
<li>Doctor, A., Spinella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Processing+and+Storage+on+Red+Blood+Cell+Function+In%5BTitle%5D)+AND+%22Vivo.+Semin+Perinatol%22%5BJournal%5D)">Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In.</a> Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).</li>
<li>Andersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+heparin+surface+concentration+and+antithrombin+binding+capacity+as+evaluated+with+human+non-anticoagulated+blood+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro.</a> J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).</li>
<li>Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+blood+compatibility+of+materials%2C+cells%2C+and+tissues%3A+basic+concepts%2C+test+models%2C+and+practical+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+dynamics+of+the+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal dynamics of the endothelium.</a> J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).</li>
<li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).</li>
<li>Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+stimulated+with+tumor+necrosis+factor-alpha+express+varying+amounts+of+tissue+factor+resulting+in+inhomogenous+fibrin+deposition+in+a+native+blood+flow+system.+Effects+of+thrombin+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors.</a> J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).</li>
<li>Esmon, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+circuits+in+thrombosis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Molecular circuits in thrombosis and inflammation.</a> Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).</li>
<li>Rosenberg, R. D., Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular-Bed%E2%80%93Specific+Hemostasis+and+Hypercoagulable+States%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Vascular-Bed–Specific Hemostasis and Hypercoagulable States.</a> N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

<html> Molteplici interazioni tra il sangue e parete del serbatoio sono normalmente mantenute in stato di quiescenza a causa della natura non adesivo e anti-trombotica dell&#39;endotelio. 7 In condizioni patologiche che coinvolgono l&#39;infiammazione, l&#39;endotelio viene attivato con un conseguente aumento dell&#39;espressione del recettore di adesione 8 e una ridotta capacità di inibire l&#39;emostasi. 9 Attivazione dei sistemi a cascata nel sangue, a sua volta amplifica la trombogenicità dell&#39;endotelio causando ulteriore trombosi e il reclutamento dei leucociti. 10 Per ottenere una migliore comprensione di questa delicata interazione tra cellule endoteliali e sangue intero, abbiamo sviluppato un nuovo metodo in vitro in cui cellule endoteliali coltivate sono posti a contatto con sangue intero. A nostra conoscenza, la nostra messa a punto è il primo a mostrare le cellule endoteliali incubate con tutto il sangue umano con nulla o molto poco anticoagulante per periodi di tempo più lunghi. nt &quot;&gt; La sensibilità di questo sistema è abilitato per venipuntura sistema aperto in combinazione con uno strato protettivo di eparina immobilizzata su tutte le superfici poste a contatto con il sangue. L&#39;uso di un sistema aperto durante il prelievo del sangue riduce l&#39;attivazione dei sistemi a cascata durante venipuntura pur consentendo l&#39;uso di una quantità autodeterminata di anticoagulante. tubi evacuati sangue disponibili in commercio possono, tuttavia, essere usati a seconda dei punti di estremità destinate dello studio. La concentrazione finale di anticoagulante aggiunto ai tubi sistemi chiusi più disponibili in commercio possono inibire sensibili e altrimenti difficili da studiare, interazioni nel setup. 6 Una superficie eparina protettiva elimina ulteriore attivazione del sangue attraverso il contatto di superficie con superfici diverse dalle cellule endoteliali. 5 Infatti, l&#39;incubazione di sangue intero addizionato con una piccola quantità di eparina non frazionata in Camera senza la protezione di CHS provocato formazione del coagulo. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; La bolla d&#39;aria all&#39;interno della camera permette miscelazione del sangue durante l&#39;incubazione con le cellule endoteliali. Per valutare l&#39;effetto della dimensione delle bolle d&#39;aria, sono stati utilizzati due differenti volumi di sangue. In questo modello, abbiamo misurato i livelli di TAT simili indipendentemente dalle dimensioni delle bolle d&#39;aria nelle camere incubate con HUVEC. TAT era, tuttavia, è aumentata con una dimensione più piccola bolla d&#39;aria nelle camere completamente CHS trattata. Questo, in conformità precedentemente descritte le proprietà delle cellule endoteliali 11, indica un effetto regolatore sulla maggiore attivazione della coagulazione fornite dalle cellule endoteliali che manca nella camera CHS inerte. La bolla d&#39;aria nel sistema crea un flusso alla rotazione della camera. La dimensione della bolla influenzerà le forze all&#39;interno di questo sistema di rotazione. Ciò è dimostrato dai nostri risultati nella Figura 2D fosse una bolla più piccola crea valori TAT più alti rappresentano una forza ridotta sul cioè sangue, il flusso di sangueentro la camera è minore e quindi l&#39;attivazione del sistema a cascata avviene in misura maggiore. Va ricordato che in questo sistema stiamo creando un flusso rotante che sarà diversa velocità attraverso la camera con la più alta velocità lungo le pareti e il basso al centro. Questo non è ovviamente un ambiente ottimale per quanto riguarda il flusso e sforzo di taglio per le cellule endoteliali, ma ancora abbiamo un sistema che produce risultati stabili e ripetibili. Ulteriori condizioni ottimali includerebbero circolanti flusso laminare in assenza di turbolenze. Questo, tuttavia, non è possibile nel modello rappresentato qui e alla nostra conoscenza un tale sistema non è ad oggi disponibili. Anche se, ci sono diversi sistemi microfluidici disponibili in commercio che non sono combinabili con sangue intero senza o con bassi livelli di anticoagulante aggiunto al sistema così sicuro da consentire un&#39;adeguata valutazione sensibile delle interazioni tra tutti i componenti presenti nel sangue e nelle cellule endoteliali. Inoltre, c&#39;è stato un aumento di 2 volte nel reclutamento di cellule del sangue verso TNFa attivato HUVEC in combinazione con una formazione raddoppiato di TAT indipendentemente dal volume del sangue. Ciò verifica stabilità del sistema modello e mostra anche la possibilità di utilizzare un endotelio attivato in combinazione con sangue intero. Future su, la camera di cellule endoteliali di sangue può essere usato per studiare il reclutamento di cellule del sangue verso le cellule endoteliali attivate da una varietà di marcatori espressi sulle cellule in varie condizioni e fasi di attivazione. Inoltre, il modello può essere utilizzato in combinazione con agenti farmacologici per valutare gli effetti sulle condizioni infiammatorie. In sintesi, si mostra il grande vantaggio di combinare un modello da camera con cellule del sangue e vascolari umane per creare un essere umano completo sistema in vitro per eseguire importanti indagini di malattia vascolare.

Metodi per l'analisi delle interazioni sangue-vascolare nelle malattie cardiovascolari in genere comportano esperimenti di ricerca degli animali. Risultati creati in modelli animali sperimentali di ricerca possono, tuttavia, hanno poca o nessuna incidenza malattie umane. 1,2 Come tale, c'è una necessità di una buona e affidabile in vitro per studiare le interazioni cellulari tra il compartimento sangue e cellule endoteliali vascolari un sistema simile a quella umana. Abbiamo quindi stabilito un modello di camera di cellule endoteliali del sangue. Questo si basa su un modello descritto precedentemente utilizzato per studiare le interazioni tra biomateriali e sangue umano intero. 3 Contrariamente alle altre configurazioni in vitro in cui il numero di componenti purificati, di solito limitati cioè, trombociti, leucociti e cellule endoteliali sono disponibili, la presente modello incorpora tutti componenti presenti in un vaso sanguigno. La messa a punto del endoteliale sangue cmodello di camera di ell è stato progettato per consentire l'uso di sangue umano appena prelevato con poco o nessun anticoagulante aggiunto. Sangue conservato durante i periodi di tempo più lunghi acquisire nell'ambito cosiddetti lesioni di stoccaggio in cui ripartizione degli eritrociti può interferire con delicate interazioni tra il sangue e le cellule endoteliali. 4 Per evitare la formazione di grumi durante la manipolazione di sangue intero ex vivo richiede elevate dosi di anticoagulanti o che tutto il materiale a contatto con il sangue deve essere non-attivazione. Come superfici non attivanti sono rari in ambiente di laboratorio, i materiali possono in alternativa essere dotati di uno strato protettivo di eparina immobilizzata. Uno strato protettivo di eparina immobilizzata (nel seguito indicato come superficie Corline eparina (CHS)), che può essere applicato alla maggior parte dei materiali che creano una superficie di contatto in cui il sangue può avvenire senza causare l'attivazione della cascata coagulativa. 5 Quindi, fornendo le camere con CHS, il ce endoteliale sanguell modello di camera permette l'uso di concentrazioni molto basse di anticoagulante nel sangue. Evitare l'aggiunta di alte concentrazioni di anticoagulante nel modello endoteliale camera di sangue consente di studiare le interazioni sensibili all'interno di un vaso sanguigno che altrimenti potrebbero essere mascherato. 6 Il modello di camera di cellule endoteliali del sangue è composto da due camere formate allegando cilindri di plastica (altezza: 8 mm; raggio: 9 mm) a un vetrino da microscopio in plastica. I bordi rivolti verso l'alto sui cilindri sono dotati di scanalature che sono dotati di O-ring di gomma utilizzati per sigillare le camere contro la slitta coltura cellulare. Le camere sono solo parzialmente pieni di sangue come l'aria rimasta nella camera mantiene il sangue in movimento quando le camere vengono successivamente ruotati in posizione verticale (Figura 1). Per valutare la funzionalità del modello, abbiamo eseguito esperimenti con entrambi completamente rivestita CHScamera o ombelicale umano Vena cellule endoteliali (HUVEC). Due volumi di sangue separati sono stati analizzati e la formazione di trombina antitrombina (TAT) complessi (un indicatore indiretto della coagulazione) è stata misurata con enzyme linked test immunoenzimatico (ELISA). Abbiamo poi valutato l'effetto dei volumi di sangue e il fattore di necrosi tumorale (TNF) stimolato le cellule endoteliali su reclutamento dei leucociti mediante analisi di immagine. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg"> Figura 1. Configurazione del modello di camera di cellule endoteliali del sangue. (A) Top disegno schematico della camera di sangue realizzato in PMMA. (B) primarie cellule endoteliali umane sono coltivati ​​su 1-e diapositive da camera. Fresco sangue umano intero è aggiunto due camere su un vetrino da microscopio. Le camere e tutti i materiali utilizzati per la manipolazione del sangue sono trattati con un rivestimento protettivo HS. Dopo aver rimosso le pareti della cell cultura scivolo, le cellule sono posti di fronte al sangue e il sistema è bloccato chiuso. camere cellule (C) La endoteliale sangue vengono poi incubate in rotazione 37 ° C. Successivamente, le reazioni nel comparto sangue possono essere analizzati mediante ELISA e le cellule endoteliali possono essere analizzate mediante microscopia.

<table><tbody><tr><td>Cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC)</td><td>PromoCell</td><td>C-12200</td><td>Può essere utilizzato qualsiasi altro tipo di cellula endoteliale umana primaria.</td></tr><tr><td>Terreno di crescita delle cellule endoteliali MV (ECGM MV)</td><td>PromoCell</td><td>C-22120</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-2500</td><td>Preparare l'1% di gelatina in PBS, incubare 5 ml in un T75 per 15 minuti e rimuoverlo prima di coltivare le cellule.</td></tr><tr><td>Laboratorio di ricerca enzimatica</td> <td>TAT ELISA</td>.<td>TAT-EIA-C</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-umano CD16</td><td>DAKO</td><td>F7011</td><td>Diluizione 1:100</td></tr><tr><td>Capra anti-topo Alexa 488</td><td>Sonde molecolari</td><td>A11001</td><td>Diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Sonde molecolari</td><td>rosse falloidina-Texas</td><td>A22287</td><td>Diluizione 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sonde molecolari</td><td>D1306</td><td>Diluizione 10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-6758</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco Life Tecnologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>1 pozzetto vetrini per colture cellulari BD</td><td>Falcon</td><td>354101</td><td></td></tr><tr><td>Camere del sangue</td><td>NA</td><td></td><td>NA può essere prodotto in PMMA o in qualsiasi altra plastica in grado di bind CHS</td></tr><tr><td>Clamps</td><td>Office Depot</td><td>2052204</td><td></td></tr><tr><td>Corline Heparin Surface (CHS)</td><td>Corline Systems AB</td><td>945-00</td><td></td></tr><tr><td>Ago ipodermico</td><td>Terumo</td><td>NN-1850R</td><td>Dimensioni: 18 G x 5 mm</td></tr><tr><td>Eparina non frazionata (UFH)</td><td>Leo Pharma</td><td>585679</td><td></td></tr><tr><td>K3EDTA</td><td>Alfa Aesar</td><td>1709958</td><td>Preparare una soluzione madre 0,34 M in milliQ H2O</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Nikon</td><td>80i</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico</td><td>Nikon</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini</td><td>Broad Institute</td><td>CellProfiler</td><td>Disponibile gratuitamente all'indirizzo www.cellprofiler.org</td></tr></tbody></table>

a novel in vitro modello per lo studio delle interazioni tra l'uomo di sangue intero e l'endotelio

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

La maggior parte delle malattie conosciute sono accompagnati da disturbi del sistema cardiovascolare. Studi sulla complessità dei percorsi interagenti attivate durante patologie cardiovascolari sono tuttavia limitati dalla mancanza di metodi robusti e fisiologicamente rilevanti. Per modellare eventi vascolari patologici abbiamo sviluppato un saggio in vitro per studiare l&#39;interazione tra endotelio e sangue intero. Il test consiste di cellule endoteliali umane primarie, che sono posti a contatto con il sangue umano intero. Il metodo utilizza sangue nativo con nessuna o pochissima anticoagulante, permettendo studio delle delicate interazioni tra componenti cellulari e molecolari presenti in un vaso sanguigno. Abbiamo studiato la funzionalità del dosaggio confrontando attivazione della coagulazione da diversi volumi di sangue incubate con o senza cellule endoteliali umane della vena ombelicale (HUVEC). Considerando che un volume di sangue più grande contribuito allaun aumento della formazione di trombina antitrombina (TAT) complessi, presenza di HUVEC comportato ridotta attivazione della coagulazione. Inoltre, abbiamo applicato l&#39;analisi delle immagini di attaccamento dei leucociti a HUVEC stimolate con fattore di necrosi tumorale (TNF) e ha trovato la presenza di cellule CD16 + per essere significativamente più alto sul TNF stimolato cellule rispetto alle cellule non stimolate dopo il contatto con il sangue. In conclusione, il dosaggio può essere applicato per studiare le patologie vascolari, dove vengono perturbate interazioni tra l&#39;endotelio e il comparto sangue.

La necessità di CHS rivestimento Per misurare reazioni in sangue intero specifici a quelle sviluppate da cellule endoteliali, tutti i materiali utilizzati per la camera di cellule endoteliali sangue devono essere dotate di un rivestimento CHS prima dell'uso. Figura 2A (sinistra) mostra una camera non rivestito dopo 30 min di contatto del sangue con un coagulo ben visibile presente. Trattare la camera con CHS (Figura 2A, destra) invece protegge il sangue dall'attivazione incontrollata, assicurando che i risultati sono dovuti alle interazioni cellula-sangue endoteliali. L'effetto del volume di sangue alla Camera L'attivazione della coagulazione è più probabile nel sangue stagnante come la probabilità di interazione tra fattori della coagulazione attivati ​​aumenta. Nel modello camera di cellule endoteliali del sangue, il sangue viene tenuto in movimento a causa della circolazione di una bolla d'aria all'interno della camera. In order per determinare l'effetto di variazioni del volume di sangue, e quindi anche dimensioni delle bolle d'aria, una camera CHS rivestito è stato collegato ad un vetrino rivestito CHS che è stato testato con 1,5 ml o 1,75 ml di sangue intero per 30 min. Il volume di sangue senza alcun movimento dalla bolla d'aria è di 2,5 volte superiore se 1,75 ml di sangue viene aggiunto alla camera rispetto a quando 1,5 ml di sangue viene utilizzato (Figura 2B). I TAT-valori misurati suggerito un aumento TAT-formazione con un aumento del volume del sangue (Figura 2D). Quando HUVEC (Figura 2C) sono state incubate sia con 1,5 o 1,75 ml di sangue intero, nessuna differenza è stata osservata tra i due gruppi, suggerendo che le cellule endoteliali possono modulare l'attivazione della coagulazione (Figura 2D). L'effetto del TNF sulla reclutamento dei globuli e attivazione della coagulazione Al fine di studiare l'effetto di TNF sulla reclutamento dei leucociti, HUVEC erano deliziaed con 20 ng / ml TNF 4 ore prima di contatto con il sangue. Contatto sangue - sia con 1,5 ml o 1,75 ml di sangue - è stato continuato per 30 minuti dopo di che i vetrini di coltura sono state colorate per CD16 (Figura 2F), ripreso e il numero di cellule CD16 + è stato quantificato. Il reclutamento di cellule CD16 + è aumentato in modo significativo con il trattamento con TNF (Figura 2E) 100-256 CD16 + cellule / mm 2 (p &lt;0,0001) con 1,5 ml di sangue e 172-378 (P &lt;0,0001) con 1,75 ml di sangue. La formazione di complessi TAT è stata misurata nei campioni plasmatici corrispondenti del sangue incubati con cellule sia TNFa trattati o non trattati (figura 2G). Cellule TNFa stimolato indotto un raddoppio approssimativo di complessi TAT rispetto alle cellule non trattate. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600"> Ficoure 2: Funzionalità del modello di camera di cellule endoteliali del sangue. (A) Camere con o senza CHS sono stati incubati con sangue intero. Senza CHS, un coagulo si è formato dopo 30 min. Misura della trombina-antitrombina (TAT) complessi, un indicatore indiretto della coagulazione del sangue, in incubate senza CHS era&gt; 6.000 mg / ml. (B) Il volume di sangue non mantenuto in movimento dalla bolla d'aria in rotazione varierà con diversi volumi di sangue. Con l'aggiunta di 1,5 ml di sangue, questo volume sarà 0,3 ml, mentre aumenterà a 0,74 ml con l'aggiunta di 1,75 ml. (C) HUVEC ripreso con microscopia a contrasto di fase mostra tipica morfologia delle cellule endoteliali di un monostrato confluente prima valori TAT per camere completamente CHS rivestiti contatto con il sangue. (D) mostrano una leggera differenza quando vengono aggiunti diversi volumi di sangue. L'aggiunta di 1,5 ml di sangue provocato 35 ± 11 mg / ml (n = 7) in confronto a 1,75 ml, che portano a 8577; 70 mg / ml TAT (n = 8). Questa differenza non è più presente quando HUVEC sono incubati con gli stessi volumi di sangue; 66 ± 55 mcg / ml per 1,5 ml (n = 5) e 66 ± 29 mcg / ml per 1,75 ml (n = 7). (E) Quantificazione del numero di cellule CD16 + presenti su entrambi non stimolato o TNFa stimolato HUVEC dopo contatto con il sangue. Il numero di cellule CD16 + è significativamente aumentata con TNF stimolato cellule incubate sia con 1,5 ml (basale: 100 ± 40 cellule / mm; TNF: 256 ± 121 cellule / mm) o 1,75 ml (basale: 172 ± 67 cellule / mm; TNF: 378 ± 185 cellule / mm) di sangue intero (F) Immagini rappresentative della non stimolato e TNFa stimolato HUVEC colorate per falloidina (rosso), CD16 (verde) e DAPI (blu).. Barra di scala = 250 micron (G) La formazione di complessi TAT è approssimativamente raddoppiata TNFa stimolato cellule rispetto alle cellule non trattate incubate con il sangue (1,5 ml:. 2.1 ± 0,1 volte più TAT, n = 3; 1,75 ml: 1,7 ± 1,0 volte più TAT, n = 4). Tutti i valori sono presentati come media ± deviazione standard; valori di p sono stati calcolati mediante test t spaiati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

L'accessibilità di modelli affidabili per studiare le interazioni vascolari del sangue negli esseri umani è carente. Presentiamo un modello in vitro di cellule endoteliali umane primarie in coltura combinate con sangue intero umano per studiare le interazioni cellulari sia nel sangue (ELISA) che nel compartimento vascolare (microscopia).

A Novel In vitro Modello per lo studio delle interazioni tra l'uomo di sangue intero e l'endotelio

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le interazioni tra sangue e cellule endoteliali utilizzando un nuovo test della camera endoteliale del sangue. Ciò si ottiene raccogliendo prima il sangue da un volontario sano mediante venipuntura a sistema aperto. Nella seconda fase, il sangue viene accuratamente stratificato su camere ematiche rivestite di eparina accoppiate a vetrini per colture cellulari endoteliali.Successivamente, queste camere cellulari endoteliali del sangue vengono ruotate delicatamente per facilitare l'interazione tra il sangue e le cellule endoteliali. In definitiva, le interazioni cellula-cellula tra il sangue e le cellule endoteliali e la conseguente produzione di complesso trombina-antitrombina possono essere valutate rispettivamente mediante microscopia a immunofluorescenza ed Eliza. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come quelli che utilizzano modelli animali è che qui un sistema modello umano può essere utilizzato per studiare la malattia vascolare prima di iniziare l'esperimento.Accoppiare un ago ipodermico calibro 18 a un pezzo di tubo in silicone rivestito con superficie di eparina di due millimetri di diametro interno. Le superfici in plastica sono rivestite con eparina per prevenire l'attivazione aspecifica della coagulazione. Ad esempio, in questa immagine, un coagulo è chiaramente visibile in questa camera non rivestita.Dopo 30 minuti dal contatto con il sangue, il trattamento della camera con la superficie dell'eparina protegge il sangue dall'attivazione incontrollata, assicurando che i risultati siano dovuti alle interazioni ematiche delle cellule endoteliali. Solo dopo aver collegato il tubo, raccogliere con cura un campione di sangue da un donatore sano mediante venipuntura a sistema aperto in un tubo da 50 millilitri rivestito in superficie di eparina. Integrare il sangue raccolto con eparina non frazionata per raggiungere una concentrazione finale di 0,75 UI per millilitro e capovolgere la provetta due o tre volte per una miscelazione delicata.Per l'analisi della concentrazione iniziale di proteine nel sangue, mescolare accuratamente un millilitro di sangue per provetta in provette da microcentrifuga contenenti 30 microlitri di K tre EDTA da 10 millimolari e posizionare le provette sul ghiaccio. Quindi utilizzare una punta di pipetta rivestita con superficie di eparina per trasferire 1,5 millilitri di sangue in ciascuna camera cellulare endoteliale del sangue rivestita con superficie di eparina, facendo attenzione a far fluire il sangue lentamente e senza creare bolle per evitare l'attivazione. Quindi, rimuovere le pareti di plastica dai vetrini di coltura delle cellule endoteliali secondo le istruzioni del produttore e lavare delicatamente le cellule endoteliali.Con la PBS, spostiamo la maggior parte possibile del lavaggio dalle cellule senza lasciare che le colture si asciughino e posizioniamo i vetrini sopra le camere del sangue con le cellule rivolte verso il sangue. Quindi utilizzando scivoli di plastica per un supporto aggiuntivo. Per evitare la rottura dei vetrini per colture cellulari, posizionare un morsetto attorno a ciascuna camera delle cellule endoteliali del sangue per fissare i vetrini.Ora, ruotare le camere su una ruota rotante in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius a 0,5 Gs per 30 minuti. Dopo la rotazione, smontare le camere cellulari endoteliali del sangue, lavare i vetrini di coltura cellulare in PBS e fissare le cellule in paraldeide ghiacciata all'1% per 10 minuti. Infine, per la valutazione della concentrazione di proteine ematiche attivate, mescolare un millilitro di sangue da ciascuna camera in provette da microcentrifuga contenenti 30 microlitri di K 0,34 molari tre EDTA e porre le provette sul ghiaccio per un massimo di un'ora.Quindi, dopo aver fatto girare le cellule, conservare il plasma in nuove provette da microcentrifuga a meno 70 gradi Celsius fino a ulteriori analisi. L'attivazione dei fattori della coagulazione è più probabile che si verifichi nel sangue stagnante poiché la probabilità di un'interazione tra i fattori attivati è aumentata. Infatti, il volume di sangue senza alcun movimento da parte delle bolle d'aria è due volte e mezzo più grande.Quando si aggiungono 1,75 millilitri di sangue alla camera rispetto a quando si utilizzano 1,5 millilitri di sangue, i valori misurati di trombina antitrombina suggeriscono un aumento della formazione di trombina antitrombina con un aumento del volume del sangue. È interessante notare che, quando si viene incubati con entrambi i volumi di sangue intero, non si notano differenze tra i due gruppi, suggerendo che le cellule endoteliali possono modulare l'attivazione della coagulazione per studiare l'effetto del TNF alfa sul reclutamento dei leucociti. In questo esperimento, i qve sono stati trattati con 20 nanogrammi per millilitro di TT NF alfa quattro ore prima del contatto con il sangue, dopodiché è stato quantificato il numero di cellule CD 16 positive.Il reclutamento delle cellule CD16 positive è aumentato significativamente con il trattamento con TNF alfa da 100 a 256 cellule CD16 positive per millimetro quadrato e 1,5 litri di sangue, e da 172 a 378 e 1,75 millilitri di sangue. La formazione dei complessi trombina-antitrombina è stata quindi misurata nei corrispondenti campioni di plasma provenienti dal sangue incubato con cellule trattate con TNF alfa o non trattate. Come previsto, le cellule stimolate con TNF alfa hanno indotto un raddoppio approssimativo dei complessi trombina antitrombina rispetto ai controlli non trattati dopo il suo sviluppo.Questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare, completare e coagulare in un modello in vitro utilizzando cellule primarie umane e sangue intero umano.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

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Microfluidica Endothelialized per lo studio delle interazioni microvascolari nelle patologie ematologiche

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Test di emocompatibilità degli impianti che si contattono con il sangue in un modello di flusso a ciclo continuo che imita il flusso sanguigno umano

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Modello di malattia microfluidico in vitro per studiare le interazioni sangue-endoteliali intere e le dinamiche del coagulo di sangue in tempo reale

Presentato qui è un protocollo per un modello standardizzato di loop emodinamico in vitro. Questo modello consente di testare l'emocompatibilità di tubi perfusione o stent vascolari per essere conforme allo standard ISO (International Organization for Standardization) 10993-4.

Un modello di loop emodinamico in vitro per indagare l'emocitocompatibilità e l'attivazione delle cellule ospiti dei dispositivi medici vascolari

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In vitro Modello di vaso umano fetale su chip per studiare la meccanobiologia dello sviluppo

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