Name: Basato sulla fluorescenza Monitoraggio dei PAD4 attività tramite un substrato Analog Pro-fluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Impara a misurare l'attività di PAD4 con un saggio fluorimetrico ad alto rendimento utilizzando un substrato analogo pro-fluorescente. Questo metodo offre maggiore sensibilità rispetto ai saggi tradizionali basati sull'ammoniaca.

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Questo lavoro è stato supportato dal pacchetto Start-up della Lehigh University. Ringraziamo il Dr. Walter Fast per aver fornito il plasmide GST-PAD4 per l'espressione proteica.

1. PAD4 Trasformazione, Espressione e purificazione <ol><li> Per PAD4 trasformazione, trasformare il plasmide contenente pGEX PAD4 GST fusione in chimicamente competente E. Coli (BL21 (DE3)), le cellule per l&#39;espressione di proteine ​​utilizzando la seguente procedura. Preparare chimicamente competente (cloruro di calcio) E. Coli (BL21 (DE3)), le cellule secondo protocolli standard. <ol><li> Scongelare 50 ml di preparato in precedenza BL21 chimicamente competente (DE3) celle su ghiaccio e mescolare con 1 ml di plasmide pGEX contenente gene PAD4 in una provetta da 5 ml. Incubare la miscela in ghiaccio per 10 min, agitando delicatamente ogni 2 min. </li><li> Heat Shock cellule collocando la miscela in un bagno d&#39;acqua a 42 ° per 40 sec. Porre immediatamente la miscela di cellule-plasmide indietro su ghiaccio per 2 minuti per permettere alle cellule di recuperare. Aggiungere 1 ml di brodo LB sterile al composto e mettere in ghiaccio per 1 min. </li><li> Incubare il calore cellule scioccato a 37 ° C, agitazione a 250 rpm per 1hr. Pipettare 75 ml di cellule trasformate su una piastra di agar ampicillina resistenti e incubare a 37 ° C per 15 h. Piastra Conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> PAD4 Expression. <ol><li> Raccogliere 1 colonia di (DE3) cellule BL21 dalla piastra di agar ampicillina e posto in 5 ml di LB contenente ampicillina 1x. Posto in incubatrice e agitare O / N a 37 ° C. </li><li> Trasferire i 5 ml di LB (avviamento) in 1 L di sterile LB contenente ampicillina triidrato 1x (MW 403,45 g / mol). Posizionare la crescita in un incubatore agitazione 37 ° C. Monitorare l&#39;OD 600 della crescita. Quando la crescita raggiunge un diametro esterno 600 di 0,3, muovere la crescita in 16 ° C agitazione incubatore. </li><li> Dopo aver raggiunto un OD 600 di 0,6, induce le cellule con isopropylthiagalactoside 0,3 mM (IPTG, MW 238,30 g / mol). Consentono alle cellule siano scossi per 15 ore a 16 ° C. </li><li> Celle di raccolta per centrifugazione a 4000 xg per 20 minuti a 0 ° C. Eliminare il surnatante e conservare pellet a -80 ° C. </li></ol></li><li> PAD4 Purificazione <ol><li> Risospendere il pellet contenente il PAD4 espresso in BL21 (DE3) cellule in tampone 50 mM NaCl (MW 58.44 g / mol), 300 mM NaH 2 PO 4 (PM 119.98 g / mol), imidazolo 10 mM (MW 68,077 g / mol), 0,1 mM fluoruro phenylmethylsulfonyl (PMSF, MW 174,94 g / mol) e 1 mM ditiotreitolo (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8,0. </li><li> Lisare le cellule tramite sonicazione per 15 min a 4 ° C. Dopo sonicazione, centrifugare il lisato cellulare a 20.000 xg per 20 min a 0 ° C. Eliminare il surnatante e riporlo. Batch il surnatante con il glutatione (GSH) agarosio per 30 minuti a RT. </li><li> Scolare il surnatante dal GST perline / colonna per gravità. Lavare perline con 4 x 25 ml di 1x PBS (tampone fosfato, pH = 8.0) a temperatura ambiente. </li><li> Eluire PAD4 con 2 x 10 ml di tampone di eluizione, Tris 50 mM (idrossimetil) aminometano (Tris Base, MW 121,14 g / mol), 10 mM glutatione (GSH, MW 307,32 g / mol), pH = 8,0. </li><li> Concentrato PAD4 con 100k MW cut-oprovette da centrifuga ff e centrifugare a 4000 xg per 20 minuti a 4 ° C. Aliquota di proteine ​​in 200 volumi in microlitri 1,0 ml provette da microcentrifuga e conservare a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparare soluzioni madre di buffer <ol><li> Pesare il cloruro di sodio (NaCl, MW 58.44 g / mol) e preparare una soluzione 2 M. Mescolare fino a quando la soluzione chiara. </li><li> Pesare Tris (idrossimetil) aminometano (Tris Base, MW 121,14 g / mol) e preparare una soluzione 2 M, pH = 8,0. Mescolare fino a quando la soluzione chiara. </li><li> Pesare diidrato cloruro di calcio (CaCl 2 2H 2 O, MW 147.01 g / mol) e preparare una soluzione 500 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara. </li><li> Pesare Tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP, MW 250,19 g / mol) e preparare una soluzione 200 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C. </li><li> Pesare ditiotreitolo (DTT, MW 154,25 g / mol) e preparare una soluzione 1 M. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C. </li><li> Preparareuna soluzione allo 0,5% di Triton X-100. </li><li> Pesare etilendiamminotetraacetico (EDTA, MW 292,24 g / mol) e preparare una soluzione 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara. </li><li> Pesare Z- Arg- Arg- 7- amido- 4- metilcumarina cloridrato (ZRcoum, MW 621,69 g / mol) e preparare una soluzione 10 mM in dimetilsolfossido (DMSO). </li></ol> 3. PAD4 test a 37 ° C <ol><li> Da 10 ZRcoum mM magazzino, preparare una soluzione 125 mM di ZRcoum in acqua. Questa soluzione 125 mM ZRcoum sarà Soluzione A. </li><li> Preparare un buffer di 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, 6,25 mM DTT, e 5 mM PAD4 (pH = 8,0). Questo sarà soluzione B. </li><li> Preparare un buffer di 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2 e 6,25 mM DTT (pH = 8,0). Questo sarà soluzione C. </li><li> Pesare tripsina, cristallino (da pancreas bovino) e preparare 10 mg / ml in EDTA 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20° C. Questo sarà soluzione D. </li><li> Ottenere una piastra a 96 pozzetti e designare un numero di pozzi per i controlli (non PAD4) e pozzi di prova (+ PAD4). </li><li> Pipettare 160 ml di soluzione B in pozzi di prova e pipetta 160 ml di soluzione di C nei pozzetti di controllo. Incubare per 15 minuti a 37 ° C. </li><li> Pipettare 40 ml di soluzione A in tutti i pozzetti e incubare a 37 ° C per 45 min. </li><li> Pipettare 10 ml di dH 2 O a metà dei pozzetti di controllo e la metà dei pozzi di prova. Per l&#39;altra metà dei pozzetti di controllo e comandi di test, pipetta 10 ml di soluzione di D. Incubare per 10 min a 37 ° C. </li><li> Ottenere una fluorescenza lettura su un lettore multimodale con lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 345 nm e una lunghezza d&#39;onda di emissione di 465 nm. </li></ol> 4. PAD4 test a temperatura ambiente <ol><li> Da 10 ZRcoum mM magazzino, preparare una soluzione di 50 mM di ZRcoum in acqua. Questa soluzione ZRcoum 50 micron sarà Soluzione A. </li><li> Preparare un buffer di Na 100 mMCl, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, 2 TCEP mM, 0,02% Triton X-100, e 8 mM PAD4 (pH = 8,0). Questo sarà soluzione B. </li><li> Preparare un buffer di NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, 2 TCEP mM e 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Questo sarà soluzione C. </li><li> Pesare tripsina, cristallino (da pancreas bovino) e preparare 10 mg / ml in EDTA 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C. Questo sarà soluzione D. </li><li> Ottenere una piastra da 384 pozzetti e designare pozzetti per i controlli (non PAD4) e pozzi di prova (+ PAD4). </li><li> Pipettare 25 ml di soluzione B in pozzi di prova e pipetta 25 ml di soluzione di C nei pozzetti di controllo. Consentire buffer con / senza PAD4 ad incubare in pozzetti per 20 minuti a RT. </li><li> Pipettare 25 ml di soluzione C in tutti i pozzetti e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Pipettare 10 ml di dH 2 O a metà dei pozzetti di controllo e la metà dei pozzi di prova. Per l&#39;altra metà dei pozzetti di controllo e comandi di test, pipette 10 ml della soluzione D. Incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Ottenere una fluorescenza lettura su un lettore multimodale con lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 345 nm e una lunghezza d&#39;onda di emissione di 465 nm. </li></ol> 5. PAD4 Andamento temporale saggi a 37 ° C e RT <ol><li> Da 10 ZRcoum mM magazzino, preparare una soluzione 125 mM di ZRcoum in acqua. Questa soluzione 125 mM ZRcoum sarà Soluzione A. </li><li> Preparare un buffer di 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, 6,25 mM DTT, e 5 mM PAD4 (pH = 8,0). Questo sarà soluzione B. </li><li> Pesare tripsina, cristallino (da pancreas bovino) e preparare 10 mg / ml in EDTA 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C. Questo sarà soluzione C. </li><li> Ottenere 2 piastre a 96 pozzetti e pipetta 160 ml di soluzione di B in # quantità di pozzi (# di pozzi dipenderà da quanti punti di tempo). </li><li> Incubare una piastra a 96 pozzetti a 37 ° C. Incubare l&#39;altra piastra da 96 pozzetti a temperatura ambiente. </li><li> Semeette 40 ml di soluzione A in tutti i pozzetti in entrambe le piastre a 96 pozzetti e subito Pipettare 10 ml di Soluzione C nelle t = 0 min pozzi. Continuare ad aggiungere 10 ml di soluzione C in punti temporali specifici prima di aver spento tutti i pozzetti. </li><li> Ottenere una fluorescenza lettura su un lettore multimodale con lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 345 nm e una lunghezza d&#39;onda di emissione di 465 nm. </li></ol> 6. PAD4 Inibizione test a temperatura ambiente <ol><li> Da 10 ZRcoum mM magazzino, preparare una soluzione 83 mM di ZRcoum in acqua. Questa soluzione ZRcoum 83 mM sarà Soluzione A. </li><li> Pesare Cl-amidina (MW 424,8 g / mol) e preparare una soluzione madre a 100 micron. Questo sarà soluzione B. </li><li> Preparare un buffer di NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, 2 TCEP mM, 0,02% Triton X-100, e 8 mM PAD4 (pH = 8,0). Questo sarà soluzione C. </li><li> Preparare un buffer di NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, 2 TCEP mM e 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Thè sarà Soluzione D. </li><li> Pesare tripsina, cristallino (da pancreas bovino) e preparare 10 mg / ml in EDTA 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C. Questo sarà Soluzione E. </li><li> Ottenere una piastra da 384 pozzetti e designare pozzi per i controlli (non PAD4), pozzi di prova (+ PAD4), e pozzi di inibizione (PAD4 + Cl-ammidinici). </li><li> Pipettare 25 ml di soluzione C in pozzi di prova e pipetta 25 ml di soluzione di D nei pozzetti di controllo. Consentire buffer con / senza PAD4 ad incubare in pozzetti per 20 minuti a RT. </li><li> Pipettare 10 ml di soluzione B nei pozzetti di inibizione e incubare per 20 minuti a Rte. </li><li> Pipettare 15 ml di soluzione A in tutti i pozzetti e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Pipettare 10 ml di soluzione E a tutti i pozzetti. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. </li><li> Ottenere una fluorescenza lettura su un lettore multimodale con lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 345 nm e una lunghezza d&#39;onda di emissione di 465 nm. </li></ol> 7. greggio lisato Assaya RT <ol><li> Dopo la raccolta delle cellule dal PAD4 1 L di crescita, risospendere le cellule in 10 ml di 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF, MW 174,94 g / mol) e 1 mM ditiotreitolo (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8.0. </li><li> Lisare le cellule tramite sonicazione per 15 min a 4 ° C. Centrifugare il lisato cellulare a 20.000 xg per 20 min a 0 ° C. Concentrare il surnatante limpido per la metà del volume mediante centrifugazione a 4000 rpm a 4 ° C con 100k MW provette di cut-off. </li><li> Da 10 ZRcoum mM magazzino, preparare una soluzione 250 mM di ZRcoum in acqua. Questa soluzione 250 mM ZRcoum sarà Soluzione A. </li><li> Preparare un buffer di NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, e 2 TCEP mM (pH = 8,0). Questo sarà soluzione B. </li><li> Pesare tripsina, cristallino (da pancreas bovino) e preparare 10 mg / ml in EDTA 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C. Questo sarà soluzione C. </li><li> Ottenere una piastra da 384 pozzetti nero e designmangiato pozzetti per i controlli (senza lisato cellulare) e le fonti di prova (+ lisato cellulare). </li><li> Pipettare 100 ml di soluzione B in tutti i pozzetti e le pipette 60 ml di lisato cellulare nei pozzetti di prova. Incubare per 20 minuti a RT. </li><li> Pipettare 40 ml di soluzione A in tutti i pozzetti e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Pipettare 10 ml di soluzione C a tutti i pozzetti. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. </li><li> Ottenere una fluorescenza lettura sul lettore multimodale con lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 345 nm e una lunghezza d&#39;onda di emissione di 465 nm. </li></ol>

<ol><li>Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+protein+language+using+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interpreting the protein language using proteomics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).</li>
<li>Sims, R. J. 3rd, Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+a+code+embedded+in+proteins+that+is+based+on+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).</li>
<li>Pandey, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+to+study+genes+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proteomics to study genes and genomes.</a> Nature. 405, 837-846 (2000).</li>
<li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+language+of+chromatin+regulation+during+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The complex language of chromatin regulation during transcription.</a> Nature. 447, 407-412 (2007).</li>
<li>Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binary+switches+and+modification+cassettes+in+histone+biology+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond.</a> Nature. 425, 475-479 (2003).</li>
<li>Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+chromatin-binding+modules+interpret+histone+modifications%3A+lessons+from+professional+pocket+pickers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).</li>
<li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reading+protein+modifications+with+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).</li>
<li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403, 41-45 (2000).</li>
<li>Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD%2C+a+growing+family+of+citrullinating+enzymes%3A+genes%2C+features+and+involvement+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease.</a> Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).</li>
<li>Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrullination%3A+a+posttranslational+modification+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Citrullination: a posttranslational modification in health and disease.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).</li>
<li>Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+localization+of+peptidylarginine+deiminase+V+and+histone+deimination+in+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).</li>
<li>Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deimination+of+histone+H2A+and+H4+at+arginine+3+in+HL-60+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes.</a> Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).</li>
<li>Kearney, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+characterization+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+a+transcriptional+corepressor+implicated+in+the+onset+and+progression+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis.</a> Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).</li>
<li>Christophorou, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrullination+regulates+pluripotency+and+histone+H1+binding+to+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin.</a> Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).</li>
<li>Wang, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidylarginine+deiminases+in+citrullination%2C+gene+regulation%2C+health+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).</li>
<li>Trouw, L. A., Mahler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closing+the+serological+gap%3A+promising+novel+biomarkers+for+the+early+diagnosis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun.+Rev%22%5BJournal%5D)">Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis.</a> Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).</li>
<li>Chang, X., Fang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PADI4+and+tumourigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">PADI4 and tumourigenesis.</a> Cancer Cell Int. 10, 7(2010).</li>
<li>Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+peptidylarginine+deiminase+type+4+in+ovarian+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors.</a> Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).</li>
<li>Chang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+pathogenic+role+of+PADI4+in+oesophageal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer.</a> Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+PADI4+cooperates+with+Elk-1+to+activate+c-Fos+expression+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells.</a> PLoS Genet. 7, (2011).</li>
<li>Tanikawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+histone+modification+and+chromatin+structure+by+the+p53-PADI4+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway.</a> Nat. Commun. 3, 676(2012).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+microRNA-16+in+colon+cancer+cells+by+protein+arginine+deiminase+inhibition+causes+a+p53-dependent+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+One%22%5BJournal%5D)">The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest.</a> PLos One. 8, (2013).</li>
<li>Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+deiminase+4+%28PAD4%29%3A+Current+understanding+and+future+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Drug+Discov.+Devel%22%5BJournal%5D)">Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential.</a> Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+p53+target+gene+expression+by+peptidylarginine+deiminase+4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4.</a> Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+peptidylarginine+deiminase+%28PAD%29+inhibitors+regulate+the+autophagy+flux+and+the+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity.</a> J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).</li>
<li>Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+deiminase+4%3A+a+target+for+an+epigenetic+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).</li>
<li>Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluoroacetamidine-based+inactivator+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+design%2C+synthesis%2C+and+in+vitro+and+in+vivo+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).</li>
<li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+and+kinetic+studies+of+PADs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity and kinetic studies of PADs.</a> Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).</li>
<li>Knipp, M., Vasak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+96-well+microtiter+plate+assay+for+the+determination+of+enzymatically+formed+citrulline%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline.</a> Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).</li>
<li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluopol-ABPP+HTS+assay+to+identify+PAD+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors.</a> Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).</li>
<li>Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+citrulline%3A+development+of+a+phenylglyoxal-based+probe+to+visualize+protein+citrullination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).</li>
<li>Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+protein+arginine+deiminase+activity+by+using+fluorescence+quenching%3A+multicolor+visualization+of+citrullination%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).</li>
<li>Jones, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+screening+of+a+haloacetamidine+containing+library+to+identify+PAD4+selective+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors.</a> ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).</li>
<li>Dreyton, C. J., et al. Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).</li>
<li>Shimoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deimination+stabilizes+histone+H2A%2FH2B+dimers+as+revealed+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+functional+and+structural+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo articolo, è stato sviluppato con successo un test basato sulla fluorescenza che monitora l'attività di PAD4. Il test ha dimostrato di essere incredibilmente robusto in una serie di condizioni ad alto rendimento ed è anche compatibile con i lisati a cellule intere37.
L'affinità tra le proteine istoniche e i filamenti di DNA che le circondano si allenta a causa della neutralizzazione della carica positiva sulla catena laterale dell'arginina dopo citrullinazione. Si è ipotizz...

Un gran numero di proteine ​​di mammifero sono fortemente modificato dall&#39;azione di enzimi seguito della biosintesi delle proteine ​​del ribosoma. Queste modificazioni post-traduzionali (PTM) possono aumentare notevolmente la diversità funzionale del proteoma modificando le dimensioni, la carica, la struttura, e lo stato di oligomerizzazione (tra le altre caratteristiche) di proteine ​​1-3. Di conseguenza, il cambiamento della struttura di proteine ​​può portare a conseguenze fisiologiche, quali la degradazione delle proteine, differenziazione cellulare, segnalazione, la modulazione dell&#39;espressione genica, e le interazioni proteina-proteina. Mentre queste modificazioni sono prevalenti in una grande percentuale di tutte le proteine ​​umane, il terminale termina il istoni subiscono un numero insolitamente elevato di modificazioni covalenti 4. Istoni sono una famiglia di proteine ​​strutturali che facilitano la condensazione del DNA genomico. Covalenti modificazioni delle code istoniche non strutturati sono effettuate e regolate da una series di enzimi in grado di catalizzare la modifica covalente di residui (scrittori), invertire le stesse modifiche (gomme), e distinguere tra i cambiamenti che sono impresse sulle code degli istoni (lettori) 5-7. In realtà, la maggior parte dei PTM conosciute si possono osservare in questo breve segmento del istoni compresi metilazione, fosforilazione, acetilazione, sumoilazione, ubiquitinazione e citrullination 8. Citrullination comporta la conversione del peptidil-arginina al t RNA non codificato peptidil-citrullina (Figura 1A). Le proteine, responsabili di questa catena di neutralizzazione lato, sono membri del PAD (p eptide un rginine eiminase d) famiglia di proteine, che sono tutti enzimi calcio-dipendenti. 9,10. Fino ad oggi, cinque membri della famiglia PAD sono state descritte (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, e PAD6). Ogni membro di questa famiglia sembra indirizzare proteine ​​cellulari distinti e anche visualizza unique profili distribuzione tissutale. PAD4 è l&#39;unico membro di questa famiglia di proteine ​​note per essere localizzato all&#39;interno del nucleo tramite una sequenza di localizzazione nucleare 11. Pertanto, è stato dimostrato per deiminate un numero di bersagli nucleari, comprese le catene laterali di arginina sulle code N-terminali degli istoni H2A residuo di arginina (3 H2R3), H3 (H3R2, H3R17 e H3R26) e H4 (H4R3) 12, 13. Mentre ciascuna delle isoenzimi PAD hanno funzioni fisiologiche specifiche e critiche, PAD4 ha ricevuto molta più attenzione a causa del suo ruolo in una serie di processi umani in cellule di entrambi i malati e sani. Recentemente, PAD4 ha dimostrato di essere un membro della pluripotenza trascrizionale di rete 14. Entrambi i livelli di espressione PAD4 e l&#39;attività hanno dimostrato di essere elevata durante la riprogrammazione e la terra statali stati pluripotenti nei topi. Controllando la regolazione dei geni di cellule staminali, PAD4 può mantenere un ruolo centrale nella riprogrammazione cellulare efficienza. PAD4 è stato anche coinvolto nelformazione di trappole extracellulari dei neutrofili, che dopo il legame di agenti patogeni consentire loro liquidazione sistema. La hypercitrullination di proteine ​​istoniche da PAD4 induce decondensazione della cromatina, che serve come materiale di base per l&#39;incapsulamento di batteri patogeni da parte della trappola extracellulare, in modo da scongiurare infezioni batteriche 15,16. Inoltre, PAD4 è stata trovata a svolgere un ruolo attivo in una serie di malattie umane. È stato precedentemente dimostrato che l&#39;espressione aberrante di PAD4 è associato con l&#39;insorgenza e la gravità di artrite reumatoide, morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, sclerosi multipla e 17. Infatti, la presenza di anticorpi anti-proteina citrullinati è uno dei biomarcatori diagnostici e prognostici più affidabili e definitive di artrite reumatoide 18. Analogamente, l&#39;attività PAD4 disregolazione stato recentemente osservato in un certo numero di tumori umani inclusi dell&#39;ovaio, della mammella, del polmone, und tumori esofagei 19-22. Il legame tra PAD4 e il cancro ha dimostrato di essere mediata attraverso l&#39;oncogene ELK1 o tramite il tumore soppressore p53 proteina 22,23 e lavoro precedente ha suggerito che PAD4 potrebbe essere un anti-cancro nuovo bersaglio terapeutico 17,24,25. Come una prova di principio studio, l&#39;esaurimento delle PAD4 via shRNA nella linea cellulare del cancro del colon-retto HCT116 si è rivelato essere sufficiente per indurre l&#39;apoptosi e arresto del ciclo cellulare 26. Un inibitore irreversibile PAD4 recentemente sviluppato ha portato ad una riduzione del settanta per cento della massa tumorale nei topi 27. Piuttosto notevole, l&#39;inibizione PAD4 sembrava operare come una terapia mirata che ha provocato l&#39;uccisione selettiva delle cellule cancerose risparmiando cellule non trasformate. L&#39;uso di piccole molecole per disattivare la funzione di PAD4 può rivelarsi una potente strategia nuova per colpire le cellule tumorali o di aumentare chemioterapici cancro esistenti 28. Purtroppo, un potenda inibitore reversibile PAD4 deve ancora essere scoperto. Un certo numero di inibitori covalenti sono stati sviluppati utilizzando il / maniglia imidine fluoro cloro che imita il substrato arginina 27,29,30 e hanno dimostrato di essere strumenti pratici per comprendere il ruolo di PAD4 in entrambe le cellule statali sani e malati. Tuttavia, queste molecole inibiscono tutte le pastiglie attivi con potenza simile. Pertanto, la necessità di un saggio superficiale che segnala l&#39;attività di PAD4 è cruciale. Fino ad oggi, PAD4 saggi sono stati descritti che collegano il rilascio di ammoniaca dalla reazione a una lettura colorimetrica 31, utilizzare un analogo substrato chloroamidine fluorescente per fluorescenza polarizzata test 32, si basano sulla reazione acida assistita tra gliossale e citrullina 33, e coppia l&#39;attività PAD4 ad una fluorescenza dequenching passo 34. Di questi, solo il modificatore strategia haloacetamidine covalente ha dimostrato di essere compatibile con scre elevato throughputpiattaforme zare 32,35,36. Descriviamo un test basato sulla fluorescenza facile che misura in modo affidabile l&#39;attività di PAD4. Il test, che mostra un forte rapporto segnale-rumore, velocità di analisi, e la robustezza della misura, ha il potenziale per scoprire un inibitore PAD4 veramente potente e selettivo.

<table><tbody><tr><td>LB Brodo, Miller (LURIA-BERTANI)</td><td>Amresco</td><td>J106-2KG<</td><td>a href="http://www.amresco-inc.com/">http://www.amresco-inc.com</a></td></tr><tr><td>Ampicillina Triidrato (Bianco sporco in polvere), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP902-25&nbsp;</td><td><a href="http://www.fishersci.com/">http://www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Isopropiltiagalattonsi (IPTG)</td><td>Life Technogolies</td><td>15529-019</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com</a></td></tr><tr><td>Tutti i sali tampone&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Può acquistare da Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; and so on.</td></tr><tr><td>Protino Glutatione (GSH) agarosio</td><td>Machery-Nagel</td><td>745500.10</td><td>Negozio a 4 &deg; C; http://www.mn-net.com/</td></tr> <tr><td>Cloroammidina&nbsp;</td><td>Cayman Chemical&nbsp;</td><td>10599</td><td>Conservare a -20 gradi C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Corning/Nunclon Piastre MicroWell (96 e 384)</td><td></td><td></td><td>Acquisto da Corning; Software per</td></tr> lettore <tr>di <td></td><td></td> micropiastre Sigma-Aldrich<td>Tecan Tecan Infinite 200 / Tecan i-control</td><td><a href="http://www.tecan.com/">www.tecan.com</a></td></tr><tr><td>Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/">http://www.perkinelmer.com</a></td></tr></tbody></table>

basato sulla fluorescenza monitoraggio dei pad4 attività tramite un substrato analog pro-fluorescenza

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Le modifiche post-traduzionali possono portare a stati funzionali proteici alterati aumentando le variazioni covalenti sulle catene laterali di molti substrati proteici. Le code istoniche rappresentano uno dei tratti più pesantemente modificati all'interno di tutte le proteine umane. È stato dimostrato che la peptidil-arginina deiminasi 4 (PAD4) converte i residui di arginina nel residuo di citrullina non geneticamente codificato. Pochi saggi descritti fino ad oggi sono stati operativamente facili con una sensibilità soddisfacente. Pertanto, la mancanza di dosaggi adeguati ha probabilmente contribuito all'assenza di potenti inibitori non covalenti di PAD4. In questo articolo viene descritto un nuovo test basato sulla fluorescenza che consente il monitoraggio dell'attività di PAD4. Un analogo del substrato pro-fluorescente è stato progettato per collegare l'attività enzimatica di PAD4 alla liberazione della fluorescenza dopo l'aggiunta della proteasi tripsina. È stato dimostrato che il test è compatibile con le condizioni di screening ad alto rendimento e ha un forte rapporto segnale/rumore. Inoltre, il saggio può essere eseguito anche con lisati cellulari grezzi contenenti PAD4 sovraespresso.

Inizialmente, è stato dimostrato che ZRcoum può riferire sull'attività di PAD4 in un formato di piastra da 96 pozzetti. Wells sono stati incubati con il substrato ZRcoum e in presenza / assenza di PAD4. Dopo un periodo di incubazione di 45 min a 37 ° C, la fluorescenza è stata misurata con un 340/40 - 475/15 nm filtro (Figura 2A). Come previsto, i livelli di fluorescenza sono rimasti bassi come fluoroforo entro ZRcoum (o il citrullinato ZRcoum)<...

PAD4 è un enzima responsabile della conversione della peptidil-arginina in peptidil-citrullina. La disregolazione di PAD4 è stata implicata in numerose malattie umane. Viene descritto un saggio PAD4 basato sulla fluorescenza facile e compatibile ad alto rendimento.

Basato sulla fluorescenza Monitoraggio dei PAD4 attività tramite un substrato Analog Pro-fluorescenza

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di ottenere informazioni quantitative sul livello di attività del pad quattro in un test facile da riprodurre utilizzando la fluorescenza. Ciò si ottiene mediante incubazione del pad quattro con l'analogo del substrato di progettazione ZR Co.La proteina viene incubata a temperatura ambiente o a 37 gradi Celsius per consentire la conversione del derivato dell'arginina nel prodotto citralina, che si traduce in una modifica covalente del substrato. Successivamente la tripsina viene aggiunta alla soluzione per generare la differenza del segnale fluorescente.I risultati mostrano che l'aggiunta del pad attivo quattro a una soluzione contenente il substrato fluorescente prof. Porta ad un cambiamento covalente basato sulla sua ridotta suscettibilità alla tripsina e quindi ai segnali fluorescenti più bassi noles. Il vantaggio principale della nostra tecnica rispetto alle tecniche esistenti, come quella che esamina il rilascio del sottoprodotto volatile dell'ammoniaca, è che monitoriamo la modifica del substrato utilizzando la fluorescenza.A dimostrare questa tecnica saranno Mary Saki e Jonathan Fiera per il mio laboratorio To work with pad four first transform pgx plasmid containing pad 4G ST fusion in cellule E coli chimicamente competenti per l'espressione della proteina pad four tutte le cellule su ghiaccio. In secondo luogo, mescolare le terze cellule con un microlitro del plasmide PGX contenente il gene pad quattro in una provetta di coltura da cinque millilitri. Incubare la miscela con ghiaccio per 10 minuti e agitarla delicatamente ogni due minuti.Quindi ciascuna scuote le celle a 42 gradi Celsius per 40 secondi. Subito dopo, rimettere la miscela di plasmidi cellulari sul ghiaccio per due minuti in modo che le cellule possano riprendersi. Ora aggiungi un millilitro di LB sterile e mantieni le cellule fresche per un altro minuto.Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius per un'ora. Metterli agitati a 250 giri/min dopo l'incubazione, pipettare 75 microlitri di cellule trasformate su una piastra di agar resistente all'ampicillina e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 15 ore. Conservare questa piastra a quattro gradi Celsius.Trasferire una colonia di cellule trasformate a cinque millilitri di LB contenente ampicillina. Metti la provetta in un'incubatrice e agita per una notte a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo.Trasferire i cinque millilitri di coltura starter in un litro di STO L LB contenente una x ampicillina tri. Monitora l'OD 600 delle cellule mentre crescono a 37 gradi Celsius. Quando la loro assorbanza raggiunge 0,3.Trasferire il pallone in una stanza a 16 gradi Celsius e continuare ad agitare. Continua a monitorare il diametro esterno della crescita. Quando il diametro esterno della coltura raggiunge 0,6.Indurre le cellule con 0,3 millimolari di THAG THAG millimolare. Lasciare agitare le cellule per 15 ore a 16 gradi Celsius. È fondamentale assicurarsi che la temperatura di crescita sia di 16 gradi Celsius prima di iniziare l'induzione con IPTG.Il giorno seguente offre le celle per centrifugazione a 4.000 G per 20 minuti a zero gradi Celsius o senza l'agente SUP e conserva il pellet di celle a meno 80 gradi Celsius per raccogliere il pad. Quattro proteine riprospendono il pellet della cellula trasformabile in un tampone contenente fenolo EOL, fluoruro di metile suen e dihi tre etolo. Successivamente si trovano le cellule che utilizzano la sonicazione per 15 minuti a quattro gradi Celsius, dopo la centrifugazione della sonicazione, i lisati a 20.000 volte G per 20 minuti e a zero gradi Celsius.Raccogliere i supinati e incubarli con perle di glutatione aeros per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Drenare il supinato dalle perle GST per gravità dopo la raccolta del flusso. Lavare le perle quattro volte con 25 millilitri di PBS a quattro gradi Celsius.Quindi eluire la proteina del tampone quattro dalle perle utilizzando 10 millilitri di tampone eluciano concentrato tampone concentrato nel tampone eluciano utilizzando provette da centrifuga con taglio del peso molecolare 100 K. Infine, Eloqua il pad purificato quattro proteine in volumi da 200 microlitri per la conservazione a meno 80 gradi Celsius. Per questa procedura, preparare la soluzione di lavoro 83 micromolari della soluzione marcata con ZR co A.Preparare anche le soluzioni B, D e la soluzione di quattro soluzioni del tampone C.In preparare la soluzione E, assicurarsi di mescolare fino a quando la TRIPSINA non si dissolve.Procurati una piastra da 384 pozzetti e designa il blocco note, i quattro pozzetti di controllo, i pozzetti di prova e i pozzetti di inibizione per il tampone quattro più la cloroamadina. Quindi aggiungere 25 microlitri di soluzione C a ciascun pozzetto di prova e 25 microlitri di D a ciascun controllo. Incubare bene la piastra per 20 minuti a temperatura ambiente.Dopo 20 minuti, aggiungere 10 microlitri di soluzione B ai pozzetti di inibizione e attendere altri 20 minuti. Quindi, aggiungi 15 microlitri di soluzione A a tutti i pozzetti. Quindi attendi 45 minuti.Dopo 45 minuti, aggiungere 10 microlitri di soluzione E a tutti i pozzetti e attendere altri 10 minuti prima di effettuare le misure di fluorescenza. Infine, utilizzare un lettore multimodale per raccogliere i dati sulle emissioni. Zar CO è stato incubato con e senza pad quattro per 45 minuti senza pad quattro, l'aggiunta di tripsina libera, i livelli di Fluor e fluorescenza aumentano e la presenza di pad quattro zar è modificata e la tripsina non libera il Fluor diminuendo così la fluorescenza.Il test è stato testato in piastre a pozzetti ad alta densità a temperatura ambiente per consentire procedure di screening ad alta produttività a temperatura ambiente. I segnali sono rimasti praticamente invariati rispetto a quelli ottenuti a 37 gradi Celsius. La reazione procedeva più lentamente a temperatura ambiente.È stato completato in 45 minuti. La stabilità del PED four nel tampone di reazione è stata quindi testata per uno screening ad alta produttività per un periodo di 15 ore. Non è stata rilevata alcuna perdita di attività enzimatica.L'inibizione del PLA quattro con cloro AMADINA mostra le tendenze previste in queste condizioni di prova a temperatura ambiente. Per sfidare la robustezza del test PAD four zku, è stato utilizzato per testare un lisato cellulare grezzo di cellule di e coli che esprimono GST pad 4. Quando è stato testato nelle stesse condizioni del tampone GST purificato, è stata osservata la fluorescenza quattro come previsto.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esprimere il pad attivo quattro e monitorarne l'attività utilizzando questo test basato sulla fluorescenza facile e affidabile utilizzando un substrato di fluorescenza prof.

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