Name: In Analisi Vitro di Myd88 mediata Cellular Immune Response to West Nile virus mutante Strain Infezione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Scopri due saggi di citometria a flusso per misurare le risposte immunitarie cellulari al virus West Nile. Questi metodi analizzano la capacità di presentazione antigenica delle cellule dendritiche e l'attivazione dei linfociti T.

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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NIH a T.W. (R01AI072060 e R01AI099123). G. Xie è stato supportato da una borsa di studio pre-dottorato del Sealy Center for Vaccine Development. Ringraziamo il Dr. Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) e il Dr. Shizuo Akira (Osaka University, Giappone) per aver fornito i topi MyD88–/– e il Dr. Y Cong (UTMB, Galveston) per aver fornito i topi transgenici OTII.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dalla cura e l&#39;uso Comitato animali presso l&#39;Università del Texas Medical Branch. 1. Isolamento delle DC da topi non infetti e WNV infettate <ol><li> Per età e per sesso partita 6-10 settimane di età, wild-type C57BL / 6 (B6) e MyD88 - / - mice. Inoculare per via intraperitoneale (ip) con 500 unità formanti placca (PFU) di WNV NS4B- P38G mutante. Al giorno 3 dopo l&#39;infezione, eutanasia B6 e MyD88 - / - mice con CO 2. Utilizzare i topi non infetti di entrambi i gruppi come controlli. Utilizzare tre topi da ciascun gruppo. </li><li> Pelliccia bagnato sul lato sinistro del mouse sacrificato con etanolo al 70% e tagliato via il pelo lungo il lato sinistro del mouse, circa a metà strada tra le gambe anteriori e posteriori. Tagliare aprire la cavità del corpo. Rimuovere la milza utilizzando le pinze. Posizionare la milza in una capsula di Petri con RPMI. </li><li> Isolare DC milza utilizzando sfere magnetiche anti-CD11c secondole istruzioni del produttore. </li></ol> 2. Purificazione e etichettatura delle cellule T di OTII topi transgenici <ol><li> Harvest una milza da un ingenuo del mouse OTII come descritto al punto 1.2 di cui sopra e omogeneizzare la milza tra le estremità smerigliato di due slitte. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 ml, aggiungere mezzo RPMI fino a 14 ml. Sia la sospensione riposare per 5 min e 13 ml di trasferimento ad una nuova provetta conica da 15 ml. </li><li> Isolare le cellule CD4 + T spleniche utilizzando un kit di isolamento di cellule CD4 + T secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Trasferire le cellule in una provetta da 50 ml, lavare due volte con PBS. Risospendere le cellule in PBS con albumina sierica bovina 0,5% (BSA) a 1 x 10 6 cellule per ml, e aggiungere 0,5 mmol / ml di CFSE. Incubare a 37 ° C per 10 minuti, al riparo dalla luce. </li><li> Aggiungere 5 ml terreno completo a freddo (RPMI-1640 con siero fetale bovino 10% di calore-inattivato, 1/100 volantibiotici / antimicotici, 1/100 vol L-glutammina e 1 / 1.000 vol di 1.000 x 2-mercaptoetanolo). </li><li> Incubare in ghiaccio per 5 min. Lavare le cellule una volta con PBS, fix 0.2 x 10 6 etichettati cellule CD4 + T in 2% PFA e acquisire su un citofluorimetro. Utilizzare questo esempio per determinare il livello basale di CFSE. Re-sospende il resto delle cellule etichettate in terreno completo. </li></ol> 3. Co-cultura OTII T cellule con DC di topi infettati da WNV <ol><li> Cultura 2 x 10 5 purificati cellule CD4 + T di topi OTII solo o con DC purificate di wild-type o MyD88 - / - mice (2 x 10 4) in un piatto ben 24, con o senza residui OVA 323-339 (1 g / ml) in 1 ml di mezzo completo per pozzetto. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C per 5 giorni. Celle di raccolta, lavare due volte in tampone FACS (PBS con 1% FBS) e fissare in 0,25 ml 2% PFA. Vortex immediatamente. </li></ol> 4. Citometria a flusso Analisi di In Vitro &lt;/ Em&gt; T cellulare adescamento <ol><li> Per l&#39;acquisizione, fare doppio clic sull&#39;icona del software di citometria a flusso. Per una trama densità lineare FSC-A vs linear SSC-A, selezionare i canali da 0 a 200.000 in FSC-A e 0 a 200.000 su SSC-A. Quindi creare un cancello su cellule vive (P2; vedi Figura 1A). </li><li> Per analizzare l&#39;intensità di fluorescenza di CFSE, aprire l&#39;istogramma del canale FL1 e acquisire 20.000 eventi sulla popolazione gated. Impostare un marcatore su campioni di cellule in coltura OTII sola (Figura 1A). </li><li> Acquisire i campioni per le cellule OTII co-coltura con wild-type DC (Figura 1B) o MyD88 - / - DC (Figura 1C) in modo simile. </li></ol> 5. Isolamento e stimolazione di splenociti per citochine saggi <ol><li> Infettare B6 e MyD88 - / - mice con WNV NS4B-P38G mutante utilizzando la stessa procedura descritta in step 1.1. Al giorno 30 dopo l&#39;infezione, ri-sfida superstite topi con 2.000 PFU del wild-type WNV ceppo ip A giorni 8 e 21 di infezione WNV post-primaria o al giorno 4 dopo l&#39;infezione secondaria, eutanasia topi con CO 2 per la raccolta di milza . NOTA: Abbiamo usato 2-3 topi per gruppo, per ogni punto di tempo. </li><li> Fare una sospensione singola cella di splenociti come sopra descritto al punto 1.2 e 2.2 passo. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e li ri-sospendere in 10 ml di media completo. </li><li> Diluire le cellule con mezzo completo a 2,5 x 10 6 cellule / ml. Aggiungere 1 ml di splenociti in un tubo micro-centrifuga 1.5 ml. </li><li> Per simulare cellule CD8 + T, diluire NS4B ed E peptidi specifici WNV (SSVWNATTA e IALTFLAV) a 1 mg / ml in DMSO. Per la stimolazione di cellule CD4 + T, diluire NS3 ed E peptidi specifici WNV (RRWCFDGPRTNTILE e PVGRLVTVNPFVSVA) a 1 mg / ml in DMSO. Aggiungere 10 ml di peptidi alle cellule followed da 1 ml di Brefeldina A soluzione. Utilizzare le cellule senza trattamento peptidi come controlli. Mescolare le cellule. </li><li> Punzone due fori con un ago da 18 G nel tappo della provetta. Incubare le cellule a 37 ° C per 5 ore. </li></ol> 6. intracellulare di citochine colorazione <ol><li> Trasferire le cellule in un nuovo tubo micro-centrifuga. Spin celle per 5 minuti a 300-400 xg e versare il surnatante. Aggiungere 1 ml FACS tampone, rotazione 5 min a 300-400 xg e risospendere cellule pipettando con 120 microlitri FACS buffer. </li><li> Aggiungere 2 ml Fc bloccante e incubare cellule a temperatura ambiente per 10 min. Aggiungere 1 ml FACS buffer per ogni provetta. Spin 5 min a 300-400 x g. </li><li> Risospendere le cellule in 300 ml FACS tampone e dividerli in tre provette (circa 0,8 x 10 6 cellule per provetta). Come mostrato nella Tabella 1, la riserva di primo tubo di ciascuna condizione di coltura per ratto IgG-PE colorazione. Per il secondo tubo, aggiungere 3 ml di anti-CD4 APC per CD4 peptidi-trattati cellule, 3 μl di anti-CD8 FITC alle cellule CD8 peptidi-trattati o entrambi gli anticorpi alle cellule senza trattamento peptidi. Utilizzare il terzo tubo di risarcimento colorazione. Per ogni condizione cultura, utilizzare tre provette di cellule colorate con APC-coniugato CD4, CD8 FITC coniugato o in PE etichettati anticorpi CD3 soli (3 ml per provetta) come controlli di compensazione per FL1, FL2 e canali FL4. </li><li> Cellule Vortex brevemente. Lasciare in ghiaccio per 20 minuti e proteggere dalla luce. Aggiungere 1.4 ml di tampone FACS. Spin 5 min a 300-400 xg e versare il surnatante. </li><li> Agitare per disturbare pellet (o brevemente vortex). Risospendere pellet cellulare in 250 ml di fissaggio / permeabilizzazione solutionby pipettaggio. Incubare a temperatura ambiente per 20 min e proteggere dalla luce. </li><li> Aggiungere 1,2 ml di tampone FACS. Spin 5 min a 300-400 XG e risospendere le cellule in 300 microlitri di buffer FACS. NOTA: A questo punto, le cellule possono essere trasferiti ad un laboratorio BL2 per ulteriore trasformazione o conservata in frigorifero e protetto dalla luce per up per tre giorni. </li><li> Aggiungere 500 microlitri FACS buffer. Spin 5 min a 300-400 XG e risospendere le cellule in 500 l di 1x tampone di permeabilizzazione / lavaggio. Spin 5 min a 300-400 x g. </li><li> Risospendere le cellule in 100 microlitri 1x Perm / Wash, aggiungere 3,5 microlitri anti-IFNγ-PE al tubo precedentemente aggiunto con anticorpi per CD4 e / marcatori cellulari o CD8 T in fase 6.3 e 3.5 ml topo IgG-PE nel tubo riservata per il controllo IgG per 25 min in ghiaccio e proteggere dalla luce. Lavare le cellule aggiungendo 1,4 ml di 1x tampone di permeabilizzazione / lavaggio. Spin 5 min a 300-400 x g. Ripetere la fase di lavaggio con l&#39;aggiunta di 1,4 ml di 1x tampone di permeabilizzazione / lavaggio. </li><li> Spin 5 min a 300-400 xg e decantare il surnatante. Lavare le cellule aggiungendo 1,4 ml di tampone FACS e risospendere in 400 microlitri di tampone FACS per acquisizione finale. </li></ol> 7. Citometria a flusso Analisi delle citochine intracellulari colorazione <ol><li> Utilizzare le stesse impostazioni di acquisizione come al punto 4.1. Create un cancello su cellule vive (P2; Figura 2A). Regolare le tensioni con i tubi di compensazione per ogni gruppo. </li><li> Aperti due nuovi dot plot, una per visualizzare i dati raccolti per FL1 vs. FL2 (CD8 vs. IFN-γ), e l&#39;altra è per visualizzare i dati raccolti per FL4 vs. FL2 (CD4 vs. IFN-γ). Acquisire 50.000 eventi per la popolazione gated di ogni campione. </li></ol>

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<li>Welte, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+an+attenuated+West+Nile+virus+NS4B-P38G+mutant+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain.</a> Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).</li>
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<li>Plebanski, M., Katsara, M., Sheng, K. C., Xiang, S. D., Apostolopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+measure+T-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Methods to measure T-cell responses.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 595-600 (2010).</li>
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<li>Kraus, A. A., Priemer, C., Heider, H., Kruger, D. H., Ulrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Hantaan+virus-containing+samples+for+subsequent+investigations+outside+biosafety+level+3+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Hantaan virus-containing samples for subsequent investigations outside biosafety level 3 facilities.</a> Intervirology. 48, 255-261 (2005).</li>
<li>Saxena, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hamster-derived+west+nile+virus+isolate+induces+persistent+renal+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl.+Trop.+Dis%22%5BJournal%5D)">A hamster-derived west nile virus isolate induces persistent renal infection in mice.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 7, 2275(2013).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

WNV è un patogeno BL3. A causa delle norme di sicurezza, test immunologici con i campioni WNV-infetti sono spesso limitati dalla disponibilità di attrezzature in BL3 strutture o più lungo e noioso per eseguire. In un recente studio, abbiamo utilizzato due metodi basati citometria a flusso per studiare cellule risposte immunitarie mediate durante l&#39;infezione WNV 5. In entrambi i test, le cellule infettate da WNV sono stati trattati con 1-2% direttamente o con una soluzione di fissaggio / permeabilizzazione...

Virus West Nile (WNV), una neurotropo, plus-rilevati flavivirus, è una minaccia per la salute pubblica emergente. Attualmente, vaccini sono stati approvati per uso umano 1. Un ceppo WNV attenuato, che ha una sostituzione P38G nel non strutturale (NS) di proteine ​​4B, è noto per indurre non letalità nei topi ma citochine superiore innate e le risposte delle cellule T nei topi wild-type di WNV NY99 ceppo 2. I topi immunizzati con il mutante NS4B-P38G stati tutti protetti da una sfida secondario con letale wild-type WNV. Questo suggerisce che il mutante NS4B-P38G ha caratteristiche adatte per un vaccino candidato ideale. I meccanismi con cui il mutante NS4B-P38G induce protezione ad alta immunità adattativa non sono chiaramente ancora capito. Toll-like receptors (TLR), che riconoscono pattern molecolari associati ai patogeni, svolgono un ruolo fondamentale nell&#39;avvio di immunità innata alle infezioni virali. Il percorso di segnalazione nucleo TLR utilizza mieloide risposta differenziazione primaria geNE 88 (MyD88) come scheda primaria 3,4. In un recente studio, la segnalazione MyD88 ha dimostrato di giocare un ruolo importante nello sviluppo delle cellule mediata durante WNV NS4B- P38G infezione nei topi mutanti 5. Le cellule dendritiche (DC) sono una delle più importanti cellule presentanti l&#39;antigene espositrici la capacità unica di avviare le risposte delle cellule T primarie durante l&#39;infezione virale 6,7. Cellule T CD4 + e CD8 + entrambi contribuiscono all&#39;immunità protettiva di lunga durata e sono importanti per la sopravvivenza di accoglienza a seguito di tipo selvaggio WNV infezione 8,9. Due saggi immunologici sono stati usati in questo studio per valutare le funzioni di queste cellule nei topi mutanti infettati NS4B-P38G. In primo luogo, un dosaggio priming di cellule T in vitro è stato utilizzato per confrontare la capacità presentanti l&#39;antigene di DC di wild-type WNV-infetti e MyD88 - / - mice. Per aumentare la sensibilità del test, ingenuo CD4 &lt;sup&gt; + cellule T sono stati isolati da OTII topi transgenici che esprimono uno specifico Vα2 / Vβ5 TCR per l&#39;ovoalbumina pollo (OVA) peptide 323 - 339. DC di WNV topi infetti sono stati purificati, e co-coltura con carboxyfluorescein succinimidil Pasqua (CFSE ) -labeled cellule CD4 + T in presenza di OVA peptide. Dopo 5 giorni di co-coltura, le cellule sono state raccolte e fissate con paraformaldeide (PFA) e analizzati mediante citometria a flusso. Saggi proliferativa, sono state tradizionalmente effettuata mediante incorporazione di 5-bromo-2&#39;-deossiuridina (BrdU) o triziata deoxyriboside timina (3 HTdr) 10. Tuttavia, questi test sono o radioattivi e / o che necessitano di apparecchiature speciali a livello di biosicurezza (BL) 3 strutture, dove vengono condotti studi WNV. L&#39;analisi citofluorimetrica della proliferazione dei linfociti dimezzando seriale dell&#39;intensità di fluorescenza del colorante vitale CFSE è diventato più comunemente usato in saggi immunologici, come il colorante è più stabilee uniformemente incorporati in cellule, rilevata facilmente mediante citometria di flusso, ed è non radioattivo 11. Il test ha anche la capacità di valutare il numero di divisioni cellulari. Uno dei principali vantaggi di questo test in studi WNV è che la fissazione delle cellule infettate con 1-2% PFA possa inattivare WNV 12, che consentirà l&#39;acquisizione dei campioni con un citometro a flusso in un laboratorio BL2. Successivamente, una procedura modificata intracellulare di citochine colorazione (ICS) è stato utilizzato per studiare il ruolo di MyD88 segnalazione nella regolazione del WNV specifiche risposte delle cellule T in NS4B-P38G topi mutanti-infettati. In questo saggio, splenociti isolati da topi infetti sono stati trattati in vitro con WNV peptidi specifici. Brefeldina A inserito mantenere le citochine all&#39;interno della cellula. Dopo 5 ore di incubazione, le cellule sono state raccolte, lavate e colorate per sottogruppi di cellule T. Le cellule sono state poi fissati in PFA, permeabilizzate e colorate per interferone (IFN) -γ e analizzate mediante citometria a flusso.Come con altri flusso-citometria saggio basato, una volta che le cellule vengono trattate con fissazione e tampone di permeabilizzazione contenente PFA, campioni infetti possono essere trasferiti ad un laboratorio BL2 per l&#39;ulteriore elaborazione e analisi. In diversi studi pubblicati, abbiamo usato ICS per misurare le funzioni effettrici delle cellule T in WNV-infetti topi 13,14. Anche se è ben consolidata, uno svantaggio principale di questo saggio è che la procedura è molto lunga e potrebbe essere più tempo quando eseguita all&#39;interno di strutture BL3. Qui, un metodo basato ICS-tube micro-centrifuga ha dimostrato di essere più fattibile, facile procedere e richiede meno tempo quando eseguita all&#39;interno di un laboratorio BL3.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875</td><td>riscaldamento a 37 gradi C</td></tr><tr><td>perline magnetiche anti-CD11c</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td>seguire il produttore' s istruzioni perline</td></tr><tr><td>magnetiche anti-CD4</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-248</td><td>seguire il produttore' s istruzioni CFSE</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Residuo OVA 323-339</td><td>Genscript Corporation</td><td>RP10610</td><td></td></tr><tr><td>Peptidi</td><td>Proimmune</td><td>PC0AD-D</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A soluzione</td><td>BD Bioscience</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Blocco Fc del topo</td><td>e-Bioscience</td><td>14-0161-85</td><td></td></tr><tr><td>CD4</td> <td>coniugato APCe-Bioscience</td><td>17-0041-81</td><td></td></tr><tr><td>CD8 coniugato FITC</td><td>e-Bioscience</td><td>11-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di fissazione/permeabilizzazione</td><td>BD-Bioscience</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di permeabilizzazione/lavaggio</td><td>BD-Bioscience</td><td>554723</td><td></td></tr><tr><td>anti-IFN&gamma;-PE</td><td>e-Bioscience</td><td>12-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso Accuri</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in analisi vitro di myd88 mediata cellular immune response to west nile virus mutante strain infezione

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Un virus attenuato West Nile (WNV), una non strutturale (NS) 4B-P38G mutante, indotta citochine superiore innata e le risposte delle cellule T rispetto al wild-type WNV nei topi. Recentemente, mieloide fattore di differenziazione 88 (MyD88) Segnalazione ha dimostrato di essere importante per priming di cellule T iniziale e lo sviluppo delle cellule di memoria T durante l&#39;infezione WNV mutante NS4B-P38G. In questo studio, due flusso metodi basati citometria - una in vitro delle cellule T saggio di adescamento e una citochina colorazione intracellulare (ICS) - sono stati utilizzati per valutare le cellule dendritiche (DC) e funzioni delle cellule T. Nella cella T adescamento test, la proliferazione cellulare è stato analizzato mediante citometria a flusso dopo co-coltura di cellule dendritiche da entrambi i gruppi di topi con estere carboxyfluorescein succinimidil (CFSE) - etichettato cellule CD4 + T di OTII topi transgenici. Questo approccio ha fornito una determinazione accurata della percentuale di cellule proliferanti CD4 + T con migliorata significativamente sensibilità globale rispetto alla tradizioneal saggi con reagenti radioattivi. Un sistema provetta è stato utilizzato in entrambe le procedure di coltura cellulare e citochine colorazione del protocollo ICS. Rispetto al tradizionale sistema basato piastra di coltura tissutale, questa procedura modificata era più facile per eseguire a livello di biosicurezza (BL) 3 strutture. Inoltre, le cellule infette WNV- sono state trattate con paraformaldeide in entrambi i test, che ha consentito un&#39;ulteriore analisi fuori strutture BL3. Nel complesso, questi in vitro test immunologici possono essere utilizzati per valutare in modo efficace risposta immunitaria cellulo-mediata durante l&#39;infezione da WNV.

Nel saggio T cellule adescamento, le cellule CD4 + T CFSE etichettati sono state coltivate con DC purificate dalla wild-type-mutante infetto NS4B-P38G e MyD88 - / - mice in presenza o assenza di peptidi OVA. Cellule T etichettati coltivate solo con o senza OVA per 5 giorni sono stati usati come controlli negativi. Come mostrato nella Figura 1A, le cellule T sono state gated totale per l'analisi di fluorescenza sul canale FL1. Il marcatore è stato istituito sulla base delle appena e...

Due metodi basati sulla citometria a flusso, un test di priming delle cellule T in vitro e la colorazione intracellulare delle citochine, sono stati utilizzati per misurare la capacità di presentazione dell'antigene delle cellule dendritiche e le risposte delle cellule T antigene-specifiche a un'infezione mutante del virus del Nilo occidentale nei topi.

In Analisi Vitro di Myd88 mediata Cellular Immune Response to West Nile virus mutante Strain Infezione

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

L'obiettivo generale di questo studio è quello di introdurre due saggi immunologici basati sulla citometria a flusso per misurare la risposta immunitaria cellulo-mediata all'infezione da virus del Nilo occidentale nelle cellule dendritiche del test di priming delle cellule T in vitro, o dcs purificate da topi infetti dal virus West Nll. Una co-coltura con cellule T marcate con CFSE naive ha purificato da OT due topi transgenici in presenza di peptide ovulico. La risposta alla proliferazione delle cellule T viene quindi analizzata mediante citometria a flusso in un laboratorio di livello due di biosicurezza nel saggio di colorazione delle citochine intracellulari modificate Cititi PLE da topi infetti da virus del Nilo occidentale, A stimolato ex vivo con peptidi specifici del Nilo occidentale in una provetta da microcentrifuga e quindi il sostegno cellulare per la produzione di citochine intracellulari e analizzato nella provetta mediante citometria a flusso nel laboratorio di livello due di biosicurezza.In definitiva, questi metodi possono essere utilizzati per esaminare il ruolo di specifiche vie di segnalazione nell'attivazione delle cellule T negli animali infetti da virus del Nilo occidentale e riducono significativamente il tempo di prestazione all'interno di strutture di livello tre di biosicurezza. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'immunità cellulare del virus dell'N occidentale, può essere applicato anche ad altri agenti patogeni di livello tre di biosicurezza per il test di priming delle cellule T in vitro. Inizia isolando le cellule dendritiche spleniche da topi selvatici di tipo C 57 nero sei A, il mio D otto otto knockout inoculati con il virus del Nilo occidentale e controlla gli animali non infetti con perline magnetiche anti CD 11 C secondo le istruzioni del produttore.Quindi, per isolare le cellule T, omogeneizzare la milza sezionata da un topo OT two con le estremità smerigliate di due vetrini, trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri, quindi aggiungere un mezzo RPMI fino a un volume finale di 40 millilitri. Lasciare riposare le cellule per cinque minuti e poi trasferire 30 millilitri di sup nascente in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Successivamente, utilizzare un kit di isolamento delle cellule T CD quattro positive secondo le istruzioni del produttore per ordinare le quattro cellule T CD positive e quindi trasferire le cellule raccolte in una provetta conica da 50 millilitri seguita da due lavaggi in PBS Dopo il secondo lavaggio, incubare le cellule in PBS con lo 0,5% di albumina sierica bovina a un centesimo di sei cellule per millilitro e 0,5 micromolari per millilitro di CFSE a 37 gradi Celsius protetto Dalla luce dopo 10 minuti, incubare le cellule in cinque millilitri di terreno freddo e completo su ghiaccio per cinque minuti.Quindi, dopo un altro lavaggio con PBS, fissare 0,2 volte 10 alle sei cellule T positive CD marcate con CFSE in PFA al 2% e determinare il livello basale di espressione di CFSE della cellula T mediante citometria a flusso. Risospendere il resto delle cellule marcate con CFSE, incomplete, medie, e quindi colture due volte 10 alle cinque cellule T positive purificate o quattro CD da sole o con due volte 10 alle quattro wild type purificate o my D otto otto dcs knockout in una piastra a 24 pozzetti con o senza un microgrammo per millilitro sul residuo 3 23 3 39 in un millilitro di terreno completo per pozzetto a 37 gradi Celsius dopo cinque giorni, raccogliere le cellule e lavarle due volte in fact buffer e fissare i pellet in 0,25 millilitri di PFA al 2% e immediatamente vorticare i campioni per l'acquisizione dei dati di citometria a flusso. Fare doppio clic sul software di citometria a flusso e selezionare i canali da zero a 200, 000 sulla dispersione diretta e da zero a 200, 000 sulla dispersione laterale per generare un grafico della densità.Quindi creare un cancello sui pozzetti vivi per analizzare l'intensità fluorescente della CFSE. Apri l'istogramma per il canale FL one e acquisisci 20.000 eventi sulla popolazione recintata. Quindi impostare un marcatore sui campioni per le due cellule OT coltivate da sole.Acquisire dati per la co-coltura OT a due cellule con wild type o my D otto otto knockout dcs in modo simile per il saggio di colorazione intracellulare delle citochine. Dopo aver generato una sospensione di una singola cellula dalla milza raccolta dal virus del Nilo occidentale, i topi infetti nei punti temporali appropriati contano le cellule e poi le diluiscono con terreno completo fino a una concentrazione di 2,5 volte il centesimo delle sei cellule per millilitro. Successivamente, Eloqua un millilitro di citi in una provetta micro centri da 1,5 millilitri.E poi, per stimolare le otto cellule T positive del CD, aggiungere 10 microlitri di peptidi specifici occidentali appena diluiti seguiti da un microlitro di feld. In una soluzione, mescolare accuratamente le sospensioni cellulari e quindi praticare due fori nel tappo della provetta con un ago calibro 18 e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per cinque ore. Dopo aver trasferito le cellule in una nuova provetta per microcentrifuga e averle centrifugate dopo un lavaggio di un millilitro di tampone fax, sospendere nuovamente il secondo pellet in 120 microlitri di tampone fax.Quindi bloccare i siti di legame aspecifici con il blocco FC e marcare le provette con gli anticorpi sperimentali e di controllo appropriati come indicato nella tabella. Successivamente, incubare le cellule nel tampone di fissazione e permeazione e quindi trasferire le cellule a un livello di biosicurezza in laboratorio per la marcatura con anticorpi di controllo o anti interferone gamma secondo la tabella. Per misurare la produzione intracellulare di citochine, impostare un grafico di dispersione forward by side come appena dimostrato, quindi eseguire il gate delle cellule vive utilizzando i tubi di compensazione per regolare le tensioni secondo necessità.Crea un dot plot per visualizzare i dati raccolti per le otto cellule positive all'interferone gamma per il CD, seguito da un altro per le quattro cellule positive all'interferone gamma per il CD e acquisisci 50.000 eventi per la popolazione gated di ciascun campione. In questo esperimento, le cellule C totali sono state controllate per determinare il tasso di proliferazione delle cellule T basali. In assenza di co-cultura con dcs.Quando le cellule T sono state co-coltivate con DC isolate da animali infetti da virus West Nile, le cellule T CFSE positive hanno mostrato una proliferazione dell'87% di cellule T marcate con CFSE Co-colture con MDD da i miei topi D otto otto knockout in presenza di oltre ha mostrato un tasso di proliferazione del 74,5%, suggerendo che il deficit nella via di segnalazione my D eight eight porta a una ridotta capacità di presentazione dell'antigene da parte delle DC durante un West null mutante infezione da virus. Le percentuali di cellule T splenic CD quattro positive all'interferone gamma positivo e CD otto positive all'interferone gamma positive isolate da topi wild-type infettati dal virus del Nilo occidentale in questa cifra rappresentativa erano rispettivamente dello 0,4% e dell'1,7%. Mentre le percentuali di cellule T spleniche doppie positive isolate dal virus del Nilo occidentale hanno infettato i miei topi D otto otto knockout erano solo dello 0,2% e dello 0,6%. Analisi simili sono state eseguite con citi isolati da topi non infetti senza differenze osservate nella percentuale di cellule T doppie positive tra i due gruppi.Inoltre, le singole popolazioni positive delle cellule T CD quattro positive e CD otto positive dei topi wild-type infetti erano il 21% e il 13,3% del totale dei citi SP gated, mentre sono stati determinati essere solo il 15,9% e l'11,2% dei miei D otto otto cititi SP knockout rispetto ai gruppi infetti, sia le risposte delle cellule T CD quattro positive che CD otto positive erano ridotte nei miei topi D otto otto knockout rispetto al gruppo wild type all'ottavo giorno dopo l'infezione da virus della lumaca occidentale mutante. In sintesi, la mia segnalazione D otto otto è coinvolta nell'attivazione iniziale delle cellule T di entrambe le popolazioni e contribuisce alle risposte positive delle cellule T CD quattro in una fase successiva dell'infezione. La citometria influenzale in vitro tcell primase che utilizza due cellule T OT marcate con CFSE fornisce una determinazione più accurata della percentuale di cellule T CD4 positive proliferanti con una sensibilità complessiva significativamente migliorata rispetto agli attuali protocolli standard.Il tubo per micro campo, ICS Math third, non richiede strumenti speciali, il che offre sia una scelta più economica che più flessibile per i ricercatori.

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