Ad alta risoluzione microscopia elettronica del Helicobacter pylori Cag secrezione di tipo IV Sistema Pili Prodotto in diverse condizioni di Ferro Disponibilità

La procedura visualizza l'iperproduzione del sistema di secrezione CAG di tipo quattro pii, che si verifica in condizioni di limitazione del ferro prima coltura h pylori in condizioni di limitazione del ferro. Il secondo passo consiste nella co-coltura di h pylori con cellule epiteliali gastriche. Successivamente, elaborare i campioni di co-coltura per la microscopia elettronica a scansione.

In definitiva, la microscopia elettronica a scansione ad alta risoluzione è utilizzata per mostrare un aumento della produzione di occhio pi del sistema di secrezione CAG di tipo quattro in condizioni di limitazione del ferro. La tecnica in questo manoscritto è importante per le malattie correlate all'h pylori come il cancro gastrico perché il sistema di secrezione CAG di tipo quattro è associato ad un aumento del rischio di esiti negativi della malattia. Pertanto, una migliore comprensione della regolazione di questa importante superficie batterica.

Organelle potrebbe rivelare nuovi bersagli chemioterapici E il vantaggio della microscopia elettronica a scansione ad alta risoluzione rispetto ai metodi esistenti come la microscopia fluorescente è che la pillola di secrezione individuale di tipo quattro I può essere visualizzata. Gli individui che non conoscono questo metodo di microscopia elettronica hanno problemi con la procedura, in particolare la chimica umida in quanto richiede un tempismo attento e una mano delicata sul sangue. Le placche di agar crescono.

H Pylori PMs, il batterio S one e il suo mutante isogenico CAG e, che manca di un sistema di secrezione di tipo quattro funzionante. Inoculare colture e brodo di Ella modificato integrato con colesterolo per crescere durante la notte. Successivamente, seminare una GS di cellule epiteliali gastriche umane su vetrini di copertura trattati con polilisina in piastre a 12 pozzetti per condizioni variabili di disponibilità di ferro.

Diluire l'h pylori a una densità ottica di 600 di 0,3 nel solo brodo bru modificato. Terreni contenenti 100 micromolari di cloruro di ferro, 200 micromolari del merlo chelante del ferro sintetico o 200 micro del mestolo più 200 micro molari di coltura di cloruro di ferro. I campioni per quattro ore centrifugano i batteri a 1000 Gs e Resus sospende i pellet in un volume uguale di brodo bru fresco modificato integrato con colesterolo.

Misurare la densità batterica. Successivamente, infettare le cellule epiteliali con l'h pylori con una molteplicità di infezione di 20 a uno. Eseguire diluizioni seriali e placcare le cellule batteriche su piastre di agar sanguigno.

Per valutare la vitalità delle cellule batteriche, posizionare le colture di co colture nell'incubatore per colture cellulari per quattro ore. Decantare il surnatante dalle colture h pylori I e un GS co. Lavare delicatamente le cellule aderenti tre volte con tampone di sodio 0,05 molare.

Quindi fissare i campioni per due o quattro ore a temperatura ambiente. Successivamente, lavare i campioni tre volte con 0,05 molari di sodio ca coate buffer. Per una fissazione secondaria, aggiungere tetrossido di osmio allo 0,1% in tampone di sodio ca coate molare da 0,05 molari in due fasi di fissazione sequenziali di 10 minuti.

Quindi, dopo tre lavaggi, disidratare i campioni con maggiori concentrazioni di etanolo. Posizionare i campioni in una macchina essiccatrice per punti critici, quindi riempire la camera con anidride carbonica liquida. L'etanolo viene spurgato dalla camera e la camera viene riempita nuovamente con anidride carbonica liquida.

Il campione viene quindi portato al punto critico di 31,1 gradi Celsius e 1073 PSI ora monta i vetrini coprioggetto su tronchetti di campioni SEM in alluminio e dipingi una sottile linea di argento colloidale sul bordo del campione per la messa a terra. Durante l'imaging SEM, utilizzando una macchina per rivestimento sputter, rivestire i campioni con cinque nanometri di palladio d'oro per aumentare il segnale dell'elettrone secondario del campione e l'effetto bordo. Esaminare i campioni con un'immagine al microscopio elettronico a scansione con pistola a emissione di campo in modalità ad alto vuoto a una distanza di lavoro compresa tra cinque e 10 millimetri.

Impostare la tensione di accelerazione a cinque kilovolt. Quindi impostare la dimensione dello spot da due a 2,5. Ora inclinare il campione tra 15 e 25 gradi per ottenere una visione migliore dell'interfaccia patogeno ospite per una visione ad alto ingrandimento.

Dare priorità all'imaging dei batteri che aderiscono ai bordi delle cellule epiteliali per i batteri PI che riscaldano la vita arricchiti nelle interazioni tra patogeni e ospiti. Aprire i file della micrografia nel software J dell'immagine. Identificare i pi li quando si formano strutture tra la cellula batterica e la cellula ospite con larghezza uniforme da 10 a 13 nanometri e lunghezza da 60 a 150 nanometri.

Calibrare lo strumento di misurazione tracciando una linea con lo strumento linea retta e quindi facendo clic sulla scheda Analizza dal menu a discesa. Selezionare imposta scala e inserire il valore della barra di ingrandimento a distanza nota e impostare l'unità di lunghezza al nanometro. Quindi fare clic su OK.

Ora usa uno strumento in linea retta per disegnare la lunghezza o la larghezza dei piloti, quindi premi il controllo M per misurare ogni pilota e registrare i valori misurati in un programma per fogli di calcolo. Utilizzare i parametri di lunghezza e larghezza stabiliti in precedenza per ignorare le caratteristiche che non si adattano al profilo del sistema di secrezione CAG di tipo quattro. Quindi quantificare il numero di PI I in base a valori che rientrano nell'intervallo analizzato statisticamente una quantificazione del PI LI utilizzando un test T di studente a due code.

In questo esperimento, l'h pylori è stato coltivato in condizioni di depauperazione di ferro utilizzando il chelante sintetico dip parital a concentrazioni che non inibiscono significativamente la crescita. I batteri hanno prodotto numerosi PII del sistema di secrezione CAG di tipo quattro durante la co-coltura con cellule gastriche umane. Al contrario, quando è presente una fonte esogena di ferro nutriente, la formazione del sistema di secrezione CAG di tipo quattro PII viene repressa.

La quantificazione del PII all'interfaccia patogeno ospite rivela che in condizioni di restrizione del ferro, l'h pylori mostra un aumento doppio del sistema di secrezione CAG di tipo quattro PI occhio, la percentuale di cellule pileate aumenta dell'11% rispetto alle cellule cresciute nel solo terreno. È interessante notare che, sebbene l'attività del sistema di secrezione CAG di tipo quattro, misurata dalla secrezione dell'IL otto ospite, sia aumentata in condizioni di restrizione del ferro e repressa in condizioni di eccessiva disponibilità di ferro, le dimensioni del PI LI rimangono coerenti tra tutte le condizioni di disponibilità di ferro. Coerentemente con il coinvolgimento del sistema di secrezione CAG di tipo quattro, la disponibilità di ferro non modifica la biogenesi di PI LI sulla superficie di un mutante CAG e dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica SEM ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del sistema di secrezione CAG di tipo quattro per esplorare la localizzazione delle proteine. Per quanto riguarda i cuscini del sistema di secrezione CAG di tipo quattro. Recentemente è stato scoperto che la proteina effettrice CAG a si localizza sulla punta della pillola di secrezione di tipo quattro.