Name: Ottimizzato Ex-ovo Coltura di Chick embrioni a stadi avanzati di sviluppo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Impara la tecnica di coltura ex ovo ottimizzata per embrioni di pollo, permettendo l'osservazione dello sviluppo embrionale dallo stadio 19 allo stadio 40 di Hamburger e Hamilton. Questo metodo è ideale per laboratori di biologia dello sviluppo.

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Vorremmo ringraziare Paul Poirier, il produttore di media, a Mount Saint Vincent Università per il suo lavoro in ripresa e modifica la parte video di questo manoscritto. Riconosciamo Scienze Naturali e di Ingegneria Research Council del Canada per il finanziamento.

Nota: Tutte le forniture sono elencati nella tabella 1. 1. Memorizzare il pollo embrioni <ol><li> Incubare uova di gallina del ceppo Gallus gallus orizzontalmente a 37 ° C con circa il 40% di umidità e girare le uova una o due volte al giorno. Passando uova è importante per evitare l&#39;embrione di aderire al guscio d&#39;uovo. </li><li> Non per non trasformare l&#39;uovo in 24 ore prima di impostare la cultura, altrimenti l&#39;embrione sarà situato ventrale alla massa tuorlo e verrà danneggiato aprendo l&#39;uovo al punto 3. Inoltre, tenere le uova a 4 o C ° per non più di una settimana prima di incubazione di sviluppo &quot;halt&quot;, ma questo non è l&#39;ideale. </li></ol> 2. Staging pollo Embrioni <ol><li> Fase gli embrioni di pollo con l&#39;Hamburger e Hamilton 12 tabella di gestione temporanea. Il palcoscenico ideale per l&#39;impostazione della coltura ex ovo è HH fase 19-20 (circa 3 giorni di incubazione) becausa questo è poco dopo la testa gira a 53 HPF. Nota: HH fase 19-20 è caratterizzata dalle seguenti caratteristiche morfologiche: somiti sono estese nella maggior parte della coda, ma alla fine della coda rimane non segmentato, la gemma coda è arricciata, allantoide è piccolo e ha limitato vascolare, le gambe gemme sono più grandi delle ali gemme e gli occhi sono pigmentato o hanno una tonalità grigiastra. </li></ol> 3. Rimuovere l&#39;embrione da Shell <ol><li> Prima di rimuovere l&#39;embrione dal guscio, spruzzare il guscio con il 70% di etanolo e lasciare asciugare. Non girare l&#39;uovo rapidamente per non danneggiare l&#39;embrione. </li><li> Facendo attenzione a non alterare l&#39;orientamento dell&#39;uovo, crepa accuratamente l&#39;uovo sul lato inferiore (cioè, il lato che era ventrale durante l&#39;incubazione) e rilasciare l&#39;embrione in un sterile pesano barca (88 x 88 x 23 mm). Pulire pesare barche con il 70% di etanolo. Controllare l&#39;embrione di garantire che il sacco vitellino non sia danneggiato. Se il tuorlo hcome rotto, scartare l&#39;embrione, in quanto non sopravviverà. </li><li> Osservare l&#39;embrione per assicurarsi che sia praticabile; il cuore batte, vasi appare normale, e evidenti anomalie sono presenti. Assicurarsi che i bordi della barca pesare siano asciutte. </li><li> Utilizzando una pipetta, goccia 40 ml di penicillina / streptomicina (5.000 unità penicillina, 5 mg di streptomicina per ml) sulla parte superiore del dell&#39;albumina per aiutare a prevenire l&#39;infezione. </li></ol> 4. Preparare la Camera Umidità <ol><li> Inserire una piccola pila di Kim-salviette e / o un tampone assorbente in cotone sul fondo di un contenitore di plastica sterile (12 x 12 x 6 cm) strofinando con etanolo al 70%. </li><li> Aggiungi sterili, acqua distillata per inumidire i Kim-salviette e / o cotone (circa 150 ml di acqua). </li></ol> 5. Assemblaggio della Ex Ovo Cultura <ol><li> Posizionare la barca pesare contenente l&#39;embrione sopra dell&#39;imbottitura umida. Quindi, posto a metà di una sterile petri-piatto quadrato (9.5 x 9.5 cm) sulla parte superiore del tsi pesano barca per formare un coperchio allentato. </li><li> Coprire il contenitore di plastica con il suo coperchio. Premere giù due angoli del coperchio, assicurando una tenuta parziale che consente ancora una buona circolazione dell&#39;aria all&#39;interno della camera. </li><li> Posizionare con cura l&#39;installazione in 37 o C incubatore fino stadio desiderato. </li><li> Posizionare i contenitori di acqua in incubatrice per aiutare a controllare l&#39;umidità, se un incubatore umidità controllata non è disponibile. Sterilizzare tutta l&#39;acqua nelle camere di umidità e nell&#39;incubatrice e riempire come necessario durante il periodo di incubazione. 40% umidità è ideale. </li></ol>

<ol><li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).</li>
<li>Gennaro, L. D., Packard, D. S., Stach, R. W., Wagner, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+of+chicken+embryos+in+simplified+shell-less+cultures+under+ordinary+conditions+of+incubation%5BTitle%5D)+AND+%22Growth%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation of chicken embryos in simplified shell-less cultures under ordinary conditions of incubation.</a> Growth. 44, 343-354 (1980).</li>
<li>Tufan, C. A., Akdogan, I., Adiguzel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shell-less+culture+of+the+chick+embryo+as+a+model+system+in+the+study+of+developmental+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology.</a> Neuroanat. 3, 8-11 (2004).</li>
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<li>Datar, S., Bhonde, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shell-less+Chick+Embryo+Culture+as+an+Alternative+in+vitro+Model+to+Investigate+Glucose-Induced+Malformation+in+Mammalian+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Diabet+Stud%22%5BJournal%5D)">Shell-less Chick Embryo Culture as an Alternative in vitro Model to Investigate Glucose-Induced Malformation in Mammalian Embryos.</a> Rev Diabet Stud. 2 (4), 221-227 (2005).</li>
<li>Chick embryos in shell-less culture. Tested studies for laboratory teaching. Fisher, C. J. 5th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE), , (1983).</li>
<li>Dunn, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+shell-less+culture+of+the+72-hour+avian+embryo%29%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Technique for shell-less culture of the 72-hour avian embryo).</a> Poultry Science. 53, 409-412 (1974).</li>
<li>Yalcin, H., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex-ovo+chicken+embryo+culture+system+suitable+for+imaging+and+microsurgery+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li>
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<li>Spurlin, J., Lwigale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+to+increase+accessibility+to+late-stage+chick+embryos+for+in+ovo+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations.</a> Dev. Dyn. 242 (2), 148-154 (2012).</li>
<li>Dorrell, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+ovo+model+for+directly+visualizing+chicken+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22American+Biology+Teacher%22%5BJournal%5D)">Ex ovo model for directly visualizing chicken embryo development.</a> American Biology Teacher. 74 (9), (2012).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morph%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morph. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Drossopoulou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+anteroposterior+patterning+of+the+vertebrate+limb+based+on+sequential+long-and+short-range+Shh+signaling+and+Bmp+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A model for anteroposterior patterning of the vertebrate limb based on sequential long-and short-range Shh signaling and Bmp signaling.</a> Development. , 127-1337 (2000).</li>
<li>Sys, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+ovo+CAM-assay+as+a+xenograft+model+for+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma.</a> J. Vis. Exp. (77), e50522(2013).</li>
<li>Franz-Odendaal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+understanding+the+development+of+scleral+ossicles+in+chicken%2C+Gallus+gallus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Towards understanding the development of scleral ossicles in chicken, Gallus gallus.</a> Dev. Dyn. 237, 3240-3251 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti per quanto riguarda le informazioni presentate in questo manoscritto.

Ex ovo coltura e di finestre entrambi hanno vantaggi e le sfide. Qui mettiamo a confronto i vantaggi e le sfide del bicchiere di polistirolo ex ovo metodo e il metodo a finestre al nostro ex ottimizzato ovo metodo illustrato qui. Il nostro metodo permette la manipolazione e semplice osservazione del embrione di pollo in fase avanzata di sviluppo e dei nostri filtri alla ex ovo tradizionale metodo 1, 2, 3 rendono inoltre molto facile da usare in classi di laurea lab...

L'ex coltura ovo ha svolto un ruolo importante nello studio dello sviluppo del pollo1, 2. Questo metodo di coltura è stato utilizzato per studiare le malattie neurologiche, lo sviluppo degli arti, lo sviluppo craniofacciale e come modello per studiare le malformazioni associate al diabete 3, 4, 5.
Ci sono molte varianti alla tecnica ex ovo. L'approccio più comune consiste nell'utilizzare una tazza di polistirolo6,7,8 o una ciotola di vetro5. In questi metodi, la tazza o la ciotola viene rivestita con un involucro di plastica per cullare l'embrione, viene posizionato un coperchio sulla tazza e l'embrione viene quindi posto in un'incubatrice con un'umidità appropriata6. Questa configurazione, tuttavia, può essere tecnicamente impegnativa. La prima sfida è l'involucro di plastica che viene utilizzato per cullare l'embrione. Questo involucro è difficile da lavorare e spesso non aderisce molto bene alla tazza. Per risolvere questo problema, un elastico viene posizionato attorno alla tazza per tenere l'involucro in posizione. Nonostante ciò, l'involucro può ancora scivolare, il che è fatale per l'embrione. L'involucro di plastica ha il potenziale per strapparsi o essere perforato da pinze o aghi che possono essere utilizzati durante le manipolazioni e le osservazioni degli embrioni. Infine, questa configurazione non è molto stabile e gli studenti possono facilmente rovesciare le tazze. L'altezza delle coppette rende anche molto difficile posizionare l'embrione sotto uno stereomicroscopio, che ha un obiettivo limitato all'altezza del palco. Queste sfide rendono difficile per gli studenti universitari lavorare con embrioni di pollo vivi nei laboratori didattici, come i corsi avanzati di biologia dello sviluppo. 
Le sfide di cui sopra nel metodo ex ovo hanno fatto sì che i ricercatori si rivolgano al metodo della finestra 9,10 per osservare lo sviluppo embrionale dei pulcini. In questa tecnica, viene praticato un foro o "finestra" nel guscio d'uovo sovrastante l'embrione. Il foro può essere risigillato con nastro adesivo o cera9 per consentire un ulteriore sviluppo embrionale. Sebbene il metodo della finestra abbia alcuni vantaggi, come la capacità di visualizzare lo sviluppo embrionale e una facile manutenzione, questo metodo presenta anche diverse limitazioni. Il primo è che la finestra deve essere abbastanza ampia per poter visualizzare l'intero embrione (soprattutto nelle fasi avanzate). In secondo luogo, le grandi finestre sono difficili da sigillare; Una sigillatura impropria porterà a problemi di sterilità e sopravvivenza. L'uso della cera fusa come sigillante aggiunge un altro passaggio scomodo e disordinato al protocollo. Pertanto, sebbene il metodo del windowing possa essere ideale per gli embrioni di pollo in fase giovane (HH 11 – HH 27), la visualizzazione dell'intero embrione in fase avanzata non è facile. 
Qui, descriviamo una tecnica di coltura ex ovo migliorata e semplice11 che evita la necessità di attrezzature ad alta tecnologia, è facile da maneggiare sotto uno stereomicroscopio, dà all'embrione un supporto sufficiente per eseguire manipolazioni microscopiche e consente ai ricercatori di visualizzare la crescita dell'embrione nella sua interezza fino alle fasi successive dello sviluppo (fino a HH 40-41). Grazie a questi progressi nella tecnica ex ovo, gli individui ottengono l'accesso a una comprensione più completa dello sviluppo embrionale. Ad esempio, la crescita nelle fasi successive consente agli individui di osservare i processi di sviluppo che non si verificano fino a questo momento, come l'ossificazione, lo sviluppo delle piume e lo sviluppo avanzato degli arti e degli occhi. L'intero embrione e le membrane extraembrionali e il sistema vascolare sono chiaramente visibili. Possono essere eseguite anche ricerche più avanzate, come le manipolazioni embrionali (ad esempio, l'impianto di perline imbevute di inibitori o l'inserimento di barriere tra gli strati di tessuto), e i ricercatori sono quindi in grado di osservare l'effetto delle manipolazioni negli embrioni in fase successiva.

<table><tbody><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td>Fare piccole aliquote per evitare eventi di congelamento/scongelamento</td></tr><tr>Piastra <td></td><td></td><td>di Petri quadrata</td><td>9,5 cm x 9,5 cm</td></tr><tr><td>Pesa Barca</td><td>Fischer Scientific</td><td>8732113</td><td>88 x 88 x 23 mm</td></tr><tr><td>Contenitore con chiusura lampo</td><td>Chiusura lampo</td><td>N/A</td><td>12 cm x 12 cm x 6 cm</td></tr></tbody></table>

ottimizzato ex-ovo coltura di chick embrioni a stadi avanzati di sviluppo

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

La ricerca in anatomia, embriologia e biologia dello sviluppo si è in gran parte basata sull'uso di organismi modello. Per studiare lo sviluppo in embrioni vivi, vengono spesso utilizzati organismi modello, come il pollo. Il pollo è un eccellente organismo modello grazie al suo basso costo e alla manutenzione minima, tuttavia presenta sfide osservative perché è racchiuso in un guscio d'uovo opaco. Per vedere correttamente l'embrione mentre si sviluppa, il guscio deve essere finestrato o rimosso. Sia la tecnica di windowing che quella ex ovo sono state sviluppate per assistere i ricercatori nello studio dello sviluppo embrionale. Tuttavia, ciascuno dei metodi presenta limitazioni e sfide. Qui presentiamo una tecnica di coltura ex ovo semplice e ottimizzata per embrioni di pollo che consente di osservare lo sviluppo embrionale dallo stadio HH 19 fino agli stadi avanzati di sviluppo (HH 40), quando molti organi si sono sviluppati. Questa tecnica è facile da adottare sia nelle classi universitarie che nei laboratori di ricerca più avanzati in cui vengono condotte manipolazioni embrionali.

Questo ex ovo metodo consente l'osservazione di embrioni dalle prime fasi di sviluppo (HH 19/20) in fase avanzata di sviluppo (HH 40-41) (Figura 1A e 1B). Impostazione della cultura a HH 19-20 aumenta sopravvivenza degli embrioni nella cultura. Prima della testa di svolta (prima 53 HPF) di sopravvivenza è molto bassa nella cultura e dopo la tappa 21, l'embrione tende ad attaccare di più per la shell alla rimozione così si ottengono un numero inferiore di embrioni intatti. In ge...

Visualizzare e accedere all'embrione di pollo durante lo sviluppo può essere impegnativo. Abbiamo sviluppato un metodo ex ovo che è semplice, economico e può essere facilmente utilizzato in classe o in un ambiente di ricerca. Questo metodo consente l'accesso all'embrione nelle fasi avanzate dello sviluppo embrionale (HH 40).

Ottimizzato Ex-ovo Coltura di Chick embrioni a stadi avanzati di sviluppo

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di presentare una tecnica di coltura X ovo ottimizzata per embrioni di pollo, che consenta l'osservazione dello sviluppo embrionale dall'hamburger e dallo stadio 19 di Hamilton fino agli stadi avanzati di sviluppo fino allo stadio 40. Questo metodo è utile per gli studenti in un laboratorio di biologia dello sviluppo, così come per i ricercatori che desiderano utilizzare l'embrione di pollo come organismo modello per impostare questo metodo di coltura X ovo. Per prima cosa, le uova vengono preparate.Le uova sono state incubate a 37 gradi Celsius con il 40% di umidità per circa tre giorni e mezzo, che è approssimativamente correlato all'hamburger e allo stadio 19 di Hamilton. Le uova vengono preparate spruzzandole con etanolo al 70% in modo che quando il guscio viene rotto, l'embrione non venga contaminato. Dopo che le uova sono state spruzzate, vengono lasciate asciugare momentaneamente.Mentre la camera di umidità è preparata, la camera di umidità è costituita da un contenitore Ziploc. Il primo passo nella costruzione della camera di umidità è aggiungere uno strato di uno o due centimetri di imbottitura assorbente. In questo caso, Kim pulisce, anche se è possibile utilizzare anche strati di imbottitura in cotone.Questo strato di imbottitura assorbente si inserisce nella base del contenitore Ziploc mostrato qui. Una volta posizionato lo strato assorbente, circa 150 millilitri di acqua distillata vengono versati nella base del contenitore. La maggior parte di quest'acqua dovrebbe essere assorbita dall'imbottitura.La camera di umidità è ora completa e può essere posizionata lateralmente. Una piccola barca sterile viene utilizzata per cullare l'embrione quando viene rimosso dal guscio. La barca misura 8,8 centimetri quadrati a causa dell'orientamento delle uova nell'incubatrice, l'embrione si trova sulla superficie superiore dell'uovo e quindi il guscio dovrebbe essere rotto sul lato opposto.Il guscio viene poi delicatamente spezzato e l'uovo viene posto molto vicino alla barca. Con un movimento fluido, l'uovo viene separato, rilasciando delicatamente l'embrione nel modo in cui Boat. L'embrione viene quindi ispezionato per assicurarsi che il giogo sia ancora intatto e che l'embrione sia vitale, come mostrato qui con un battito cardiaco visibile e senza anomalie evidenti.Successivamente, aggiungiamo un antibiotico all'embrione per aiutare a combattere l'infezione. Penicillina streptomicina a una concentrazione di 5.000 unità di penicillina e cinque milligrammi di streptomicina per mil è assegnata per ridurre al minimo la frequenza del gelo e del disgelo. Avvenimenti. 40 microlitri vengono prelevati dall'aliquota e aggiunti all'albumina circostante utilizzando una pipetta.Ora l'embrione è pronto per essere posizionato con cura nella camera di umidità. Una volta nella camera di umidità, all'embrione viene dato un coperchio per aiutare a prevenire la contaminazione. Un coperchio quadrato di Petri di nove centimetri e mezzo quadrati è posto sopra la barca di passaggio.È importante assicurarsi che non ci sia umidità sul bordo della barca di andata in modo che non si formi una guarnizione tra la capsula di Petri e la barca di navigazione, che limiterebbe l'ossigeno all'embrione. Quindi, per completare la camera di umidità, viene posizionato un coperchio sul contenitore Ziploc. Tuttavia, solo due angoli del coperchio vengono premuti in posizione, lasciando gli altri angoli aperti e consentendo al flusso d'aria di raggiungere l'embrione.Una volta completata la camera di umidità, viene posta in un'incubatrice a 37 gradi in modo che l'embrione possa continuare a svilupparsi dopo quattro giorni e mezzo. La camera di umidità può essere rimossa dall'incubatrice e l'embrione può essere osservato approssimativamente allo stadio 34. A questo punto, gli studenti possono facilmente osservare l'embrione, compresi i vasi sanguigni, il grande occhio e le gemme degli arti.L'embrione può essere ulteriormente osservato al microscopio da dissezione e possono essere eseguite ricerche più avanzate come le manipolazioni embrionali. Dopo aver osservato l'embrione in questa fase, può essere riportato in un'incubatrice a 37 gradi e continuerebbe a svilupparsi almeno fino allo stadio 40, ovvero 14 giorni di incubazione. In conclusione, questo metodo mostra l'ottimizzazione della coltura di embrioni di pollo al di fuori del guscio dell'uovo.Offre agli studenti l'opportunità di osservare lo sviluppo di embrioni di pollo in un ambiente di laboratorio affollato e, inoltre, fornisce ai ricercatori l'accesso agli embrioni se stanno facendo manipolazioni.

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