Valutare interazioni leucociti-endotelio in condizioni di flusso in un Ex Vivo Assay Autoperfused Microflow Camera
30 dicembre 2014
Qui, presentiamo un protocollo che permette al ricercatore di valutare dinamiche reclutamento di leucociti ex vivo collegando una camera rivestita con molecole di adesione endoteliali derivate al sistema circolatorio di un topo. Questo metodo offre notevoli vantaggi, in quanto permette di valutazione leucociti in condizioni biologiche relative.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare un circuito chiuso arterovenoso ex vivo per valutare le interazioni dei leucociti con le molecole di adesione endoteliale in condizioni di flusso fisiologico. Ciò si ottiene rivestendo prima una sottile camera di vetro con la molecola di adesione endoteliale di interesse. Nella seconda fase, i tubi in polietilene e silicone vengono collegati alla camera e quindi chirurgicamente al topo.
Successivamente, il sangue dall'arteria carotide può fluire attraverso il tubo. E le successive interazioni dei leucociti nativi con la camera di vetro rivestita vengono registrate in tempo reale. In definitiva, gli effetti di vari trattamenti sullo spostamento e sulla velocità di rotolamento dei leucociti quando interagiscono con le molecole di adesione immobilizzate possono essere calcolati nel tempo.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alla tecnica esistente, come l'analisi pro citometria, è che con questa tecnica, l'interazione dei leucociti con le molecole endoteliali viene valutata in condizioni di flusso fisiologico. Il giorno prima dell'esperimento collegare un centimetro di tubo in polietilene PE 10 a un pezzo di tubo di silicone di sei centimetri, seguito da cinque centimetri di tubo in polietilene. Per preparare la configurazione del tubo per il lato giugulare dell'animale per il lato carotideo, collegare il tubo come appena dimostrato con l'aggiunta di un TTU all'interno del tubo in silicone da sei centimetri, a circa 1,5 centimetri di distanza dal tubo in polietilene da un centimetro.
Quindi, collegare un'estremità di un pezzo di tubo di silicone di 10 centimetri al trasduttore di pressione e inserire l'estremità a T del tubo a T del lato carotideo nell'altra estremità. Assicurarsi che i siti di connessione siano ben saldi e privi di perdite. Quindi utilizzare una siringa da un millilitro collegata a un ago da 25 gauge per infondere in ciascuna camera a microflusso la proteina di rivestimento superficiale endoteliale appena preparata e conservare le camere rivestite in una provetta da 15 millilitri a quattro gradi Celsius durante la notte del giorno successivo.
Per collegare il tubo giugulare e carotideo alla camera del microflusso, collegare un tubo in silicone di un centimetro a ciascun lato della camera, quindi sigillare le connessioni con un piccolo pezzo rettangolare di param teso con il tubo che incontra la camera. Utilizzare una siringa per riempire la camera e il tubo con albumina sierica bovina allo 0,1%. E poi, dopo aver verificato la presenza di perdite, incubare nella camera per 45 minuti.
A temperatura ambiente verso la fine dell'incubazione, stabilizzare la camera di microflusso su una tacca alla piastra di Petri con una piccola goccia di silicone ad ogni tacca. Quindi collegare i tubi giugulare e carotideo a ciascun lato della camera. Quindi, mentre il silicone si asciuga, collegare una siringa di bloccaggio da 60 mil riempita di eparina al trasduttore di pressione e far scorrere eparina di grado USP 100 attraverso il tubo e la camera fino a quando non ci sono bolle d'aria.
Prima di collegare il mouse alla camera a microflusso, accendere il computer, il microscopio e il dispositivo di registrazione della pressione appropriato. Una volta configurato il software, proteggi un mouse di 10-12 settimane. In posizione ventrale, praticare un'incisione nella zona del collo con le forbici e poi sezionare la ghiandola tiroidea per esporre la trachea e i vasi.
Pulire l'arteria carotide fino a quando non è completamente esposta. Facendo attenzione a non danneggiare il nervo vago. Quindi passare la curva di un pezzo di sutura piegato sotto l'arteria carotide e tagliare la sutura in corrispondenza della curva.
Quindi ci sono due pezzi di sutura sotto l'arteria. Avvolgere ogni sutura in nodi senza stringere, quindi posizionare le suture per la vena giugulare sinistra allo stesso modo. Quando le suture giugulari sono in posizione, iniettare un millilitro di eparina nell'ip del topo.
Dopo l'iniezione, stringere la sutura superiore sull'arteria carotide e posizionare una pinza vascolare il più in basso possibile sulla sezione esposta dell'arteria. Usa una pinza per tenere l'arteria per la sutura superiore e poi usa micro forbici sottili per praticare una piccola incisione di circa un ottavo della circonferenza dell'arteria vicino alla sutura superiore. Ora inserire il tubo dell'arteria carotide utilizzando un supporto per tubo attraverso l'incisione praticata nell'arteria e passarlo verso il basso attraverso la sutura inferiore.
Quindi legare la sutura inferiore seguita da quella superiore. Quindi l'arteria viene sigillata attorno al tubo, facendo diversi nodi per garantire una tenuta ermetica. Dopo aver ripetuto la stessa procedura per il tubo giugulare, meno la pinza del vaso, aprire temporaneamente la pinza del vaso sul tubo dell'arteria carotide per testare il flusso.
Se non ci sono perdite, avvicinare il mouse al microscopio e collegare il tubo della vena carotide e giugulare al tubo della camera di microflusso per registrare la velocità di rotolamento dei leucociti attraverso la camera di microflusso. Rilasciare completamente la carotide clamp per riempire la camera. Lasciare che il sangue circoli per tre-cinque minuti in modo che le condizioni di flusso si stabilizzino.
Nel frattempo, regolare il tavolino del microscopio in modo che la camera sia a livello dell'obiettivo del microscopio e il suo bordo sia parallelo alla finestra di registrazione video sullo schermo. Quindi, costruire una capsula di Petri con acqua a temperatura ambiente, quindi abbassare l'obiettivo di immersione in acqua 10 x nella capsula in modo che le cellule che scorrono attraverso la camera siano visibili, regolando l'intensità della luce in modo appropriato per simulare una pressione di flusso fisiologica media, regolare il morsetto sul tubo in modo che il trasduttore legga 30 millimetri costanti di mercurio. Quindi premere start per avviare la registrazione sia del traffico leucocitario che della pressione con il primo lasso di tempo vicino all'estremità giugulare della camera e muovendosi contro il flusso verso l'estremità carotide fino al completamento.
Al termine della registrazione, chiudere la valvola nel sito di ingresso per interrompere il flusso sanguigno e sostituire la camera con una nuova camera rivestita con una molecola di adesione diversa, se lo si desidera. Durante ogni registrazione, all'interno della camera sono evidenti solo leucociti interagenti. Ad esempio, in ciascuna di queste immagini, le punte di freccia bianche indicano i singoli leucociti che sono stati catturati dalla molecola di adesione di interesse e che rotolano lungo la camera tra le altre cellule a flusso libero.
All'interno del flusso sanguigno, un artefatto comune al di fuori della camera può essere visto con le grandi sfere scure in tutte le immagini, il che può aiutare lo spettatore ad apprezzare il movimento dei leucociti in relazione a un punto fisso. Il grafico illustra un grafico finale dei dati. Il primo trattamento sperimentale è stato osservato per diminuire la velocità di rotolamento evidente come uno spostamento a sinistra, e il secondo trattamento sperimentale è stato osservato per aumentare la velocità che appare come uno spostamento a destra, entrambi rispetto alla velocità di rotolamento di controllo in combinazione con questa procedura.
Altri metodi come l'etichettatura del leucocita e vivo x Viva possono essere utilizzati per rispondere ulteriormente ad altre domande come il contributo di alcuni sottotipi di progressione della malattia leucocitaria.
Panoramica
In questo articolo viene presentato un protocollo per valutare le dinamiche del reclutamento dei leucociti ex vivo, utilizzando una camera a microflusso collegata al sistema circolatorio di un topo. Il metodo consente l'osservazione in tempo reale delle interazioni tra leucociti e molecole di adesione endoteliale in condizioni fisiologiche di flusso.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Immunologia
- Biologia vascolare
Sfondo
- Il reclutamento dei leucociti è fondamentale per le risposte immunitarie.
- La comprensione delle interazioni tra leucociti e endotelio può orientare le strategie terapeutiche.
- Le tecniche esistenti potrebbero non riprodurre con precisione le condizioni fisiologiche.
- Questo protocollo mira a superare tali limitazioni.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per la valutazione in tempo reale della dinamica dei leucociti.
- Valutare gli effetti dei trattamenti sul comportamento dei leucociti.
- Migliorare la comprensione delle interazioni dei leucociti in condizioni di flusso.
Metodi Utilizzati
- Rivestire una camera di vetro con molecole di adesione endoteliale.
- Collegare la camera al sistema circolatorio del topo.
- Infondere sangue e registrare le interazioni dei leucociti.
- Analizzare la velocità di rotolamento e lo spostamento dei leucociti.
Risultati principali
- È stata ottenuta la visualizzazione in tempo reale delle interazioni dei leucociti.
- Sono state quantificate la velocità di rotolamento e lo spostamento dei leucociti.
- Il metodo ha dimostrato vantaggi rispetto alle tecniche tradizionali.
- Le condizioni fisiologiche di flusso sono state mantenute con successo.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per lo studio della dinamica dei leucociti.
- Può essere applicato a diversi trattamenti che influenzano il comportamento dei leucociti.
- La tecnica migliora la nostra comprensione delle risposte immunitarie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Lo studio delle interazioni tra leucociti ed endotelio in condizioni fisiologiche di flusso è fondamentale per ridurre i rischi associati ai bersagli delle malattie infiammatorie e per validare ipotesi meccanicistiche nella fase iniziale della scoperta. Questo saggio ex vivo con camera di microflusso ad autoflusso consente la quantificazione in tempo reale della velocità di rotolamento dei leucociti, fornendo una maggiore affidabilità predittiva nella validazione dei bersagli e supportando decisioni di avanzamento o interruzione nei programmi preclinici. Preservando la funzionalità nativa dei leucociti ed evitando artefatti legati alla manipolazione ex vivo, il metodo migliora la continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche mediante la valutazione dell'espressione funzionale delle molecole di adesione dei leucociti sotto stress di taglio fisiologico.
- Valore operativo: Consente la riduzione del rischio biologico attraverso la misurazione diretta della velocità di rotolamento dei leucociti come lettura funzionale dell'attività delle molecole di adesione.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio progettuale quantificando l'interazione con il bersaglio e gli effetti meccanicistici di composti immunomodulatori in un sistema rilevante per la malattia.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive, stabilendo profili di interazione dei leucociti di base in condizioni di flusso controllato.
- Valore operativo: Fornisce output quantitativi standardizzati e riproducibili (velocità di rotolamento, spostamento) che consentono una valutazione affidabile dei composti in diverse campagne sperimentali.
- Scalabilità: Permette il riutilizzo della piattaforma per testare diverse molecole di adesione o candidati terapeutici in un ambiente fisiologico costante.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la rilevanza per la patologia utilizzando leucociti periferici nativi da topi anestetizzati, preservando stati cellulari simili a quelli in vivo.
- Valore operativo: Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica misurando parametri funzionali direttamente confrontabili con gli esiti della microscopia intravitale.
- Controllo del rischio: Orienta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio identificando composti che modificano le interazioni tra leucociti e endotelio in condizioni di flusso, prima di studi in vivo costosi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto attivo, consentendo una riduzione del rischio meccanicistica prima dello screening fenotipico o degli studi di efficacia preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi quantificando la dinamica dell'adesione dei leucociti sotto flusso fisiologico, riducendo l'ambiguità meccanicistica.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso rivestimento standardizzato della camera e stabilizzazione del flusso, assicurando misurazioni riproducibili delle interazioni leucocitarie.
- Analisi: Produce letture quantitative (velocità di rotolamento, spostamento) mediante analisi con ImageJ, consentendo un confronto oggettivo degli effetti dei trattamenti in diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica utilizzando popolazioni di leucociti native, mantenendo la rilevanza fisiologica per l'estrapolazione a modelli di infiammazione in vivo.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità riutilizzabile per lo screening di più bersagli o composti, riducendo lo sviluppo ridondante di modelli e migliorando l'efficienza del flusso di lavoro.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi misurando il comportamento funzionale dei leucociti sotto stress di taglio, riducendo i falsi positivi derivanti da saggi statici.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso condizioni di flusso controllate (30 mmHg) e imaging in tempo reale, minimizzando la variabilità tra esperimenti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo informazioni meccanicistiche precoci, riducendo i rischi biologici in fase avanzata nei programmi per malattie infiammatorie.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione basata sul rischio quantificando gli effetti della modulazione dell'obiettivo, sostenendo decisioni di avanzamento guidate dai dati nei percorsi di immunomodulazione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in microchirurgia, microscopia intravitale e regolazione della pressione emodinamica per mantenere circuiti arterovenosi stabili ex vivo.
- È dipendente da strumentazione specializzata, inclusi un trasduttore di pressione, un regolatore di flusso Harvard Apparatus e un obiettivo a immersione in acqua per la visualizzazione dei leucociti.
- Necessita di una standardizzazione intersquadra dei protocolli di rivestimento delle camere, della preparazione dei tubi e delle procedure di eparinizzazione per garantire un flusso fisiologico costante.
- Comporta considerazioni di adattamento durante il test di diverse molecole di adesione endoteliale o sottotipi di leucociti, richiedendo la validazione dell'efficienza e specificità del rivestimento.
- I limiti pratici includono la complessità tecnica della cannullazione chirurgica dei vasi e la necessità di modelli murini mantenuti sotto anestesia, che potrebbero limitare la produttività.
