Name: Fluorescenza base tecnica Primer Extension determinare trascrizionali punti di partenza e siti di taglio di RNasi In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Scopri un metodo di primer extension fluorescente per mappare i punti di inizio trascrizionale e i siti di taglio dell'RNA in vivo nei batteri. Questa tecnica utilizza un sequenziatore automatico per un'analisi ad alta risoluzione.

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Ringraziamo Anne Wochele per la sua assistenza in laboratorio e Vera Augsburger per l'aiuto con il sequenziatore automatico di gel. Ringraziamo la Deutsche Forschungsgemeinschaft per il finanziamento con le sovvenzioni BE4038/2 e BE4038/5 nell'ambito dei "programmi prioritari" SPP1316 e SPP1617.

<ol><li>Simpson, C. G., Brown, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+extension+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Primer extension assay.</a> Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).</li>
<li>Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescently+labeled+oligonucleotide+extension%3A+a+rapid+and+quantitative+protocol+for+primer+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Fluorescently labeled oligonucleotide extension: a rapid and quantitative protocol for primer extension.</a> Biotechniques. 35, 90-94 (2003).</li>
<li>Schuster, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mazEF+Toxin-Antitoxin+Homologue+from+Staphylococcus+equorum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mazEF Toxin-Antitoxin Homologue from Staphylococcus equorum.</a> J. Bacteriol. 195, 115-125 (2013).</li>
<li>Nolle, N., Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+paralogous+yefM-yoeB+loci+from+Staphylococcus+equorum+encode+functional+toxin-antitoxin+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Two paralogous yefM-yoeB loci from Staphylococcus equorum encode functional toxin-antitoxin systems.</a> Microbiology. 159, 1575-1585 (2013).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Park, J. H., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea.</a> Annu. Rev. Genet. 45, 61-79 (2011).</li>
<li>Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+are+ubiquitous+and+versatile+modulators+of+prokaryotic+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and versatile modulators of prokaryotic cell fate.</a> FEMS Microbiol. Lett. 340, 73-85 (2013).</li>
<li>Goeders, N., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+as+multilevel+interaction+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems as multilevel interaction systems.</a> Toxins. 6, 304-324 (2014).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+interferases%2C+sequence-specific+endoribonucleases+from+the+toxin-antitoxin+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+molecular+biology+and+translational+science%22%5BJournal%5D)">mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems.</a> Progress in molecular biology and translational science. 85, 467-500 (2009).</li>
<li>Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+MazF-bs+%28EndoA%29+is+a+UACAU-specific+mRNA+interferase%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase.</a> FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Staphylococcus+aureus+MazF+specifically+cleaves+a+pentad+sequence%2C+UACAU%2C+which+is+unusually+abundant+in+the+mRNA+for+pathogenic+adhesive+factor+SraP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP.</a> J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA+interferases%2C+MazF-mt3+and+MazF-mt7+from+Mycobacterium+tuberculosis+target+unique+pentad+sequences+in+single-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA.</a> Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).</li>
<li>Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+MazFSa%2C+an+endoribonuclease+from+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus.</a> J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).</li>
<li>Marmur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+the+isolation+of+deoxyribonucleic+acid+from+micro-organisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms.</a> J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).</li>
<li>Emory, S. A., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ompA+5%27+untranslated+RNA+segment+functions+in+Escherichia+coli+as+a+growth-rate-regulated+mRNA+stabilizer+whose+activity+is+unrelated+to+translational+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The ompA 5' untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency.</a> J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).</li>
<li>Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+promoters+for+the+ompA+gene+which+encodes+a+major+outer+membrane+protein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli.</a> Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).</li>
<li>Schleifer, K. H., Kilpper-Bälz, R., Devriese, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+arlettae+sp.+nov.%2C+S.+equorum+sp.+nov.+and+S.+kloosii+sp.+nov.%3A+Three+New+Coagulase-Negative%2C+Novobiocin-Resistant+Species+from+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Syst.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals.</a> Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 Forthcoming.</li>
<li>Yu, H., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+HIV-1+and+avian+myeloblastosis+virus+reverse+transcriptase+fidelity+on+RNA+and+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates.</a> J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).</li>
<li>Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+the+use+of+radioactivity+by+fluorescence+for+biochemical+studies+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA.</a> RNA. 13, 2042-2050 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare che possa presentare un conflitto di interessi.

Primer extension fluorescente è un metodo semplice e rapido per determinare l&#39;estremità 5 &#39;di RNA, sia per TSP- o l&#39;identificazione di trasformazione secondaria dell&#39;RNA. Grazie all&#39;uso di primer fluorescenti, le reazioni possono essere impostati e gestiti senza misure di sicurezza supplementari (a differenza in caso di primer marcati radioattivamente). Poiché i campioni vengono rilevati mediante fluorescenza, possono essere esposte mentre l&#39;elettroforesi è in corso che consente l&#39;analisi rap...

Estensione Primer 1 è un metodo molecolare per determinare l'estremità 5 'di molecole di RNA specifici fino ad una risoluzione di una base. Il vantaggio di altri metodi come 5'-RACE (amplificazione rapida delle estremità del cDNA) è il tempo di ritorno veloce e la capacità di analizzare facilmente una miscela di diverse lunghezze di molecole di RNA. Questo metodo funziona sottoponendo molecole di RNA per invertire le reazioni di trascrizione utilizzando primer fluorescenti specifiche, generando frammenti di cDNA di alcune lunghezze. Queste molecole di cDNA vengono eseguiti insieme reazioni di sequenziamento tradizionali Sanger 2 su gel di poliacrilammide denaturante e possono essere rilevate da loro fluorescenza a causa dell'uso di primer fluorescente. Le lunghezze dei frammenti di cDNA vengono quindi valutati rispetto alla scala sequenziamento, consentendo la mappatura delle estremità 5 'RNA. Tradizionalmente, le reazioni di estensione dei primer sono utilizzati in combinazionecon isotopi radioattivi per rilevare molecole di cDNA su film X-ray. A causa di rischi per la salute, problemi di smaltimento e maneggevolezza, protocolli più recenti utilizzano fluorescenza per la rilevazione del primer extension con sequenziatori automatici, benché la loro sensibilità è leggermente inferiore. Utilizzando primer fluorescente, la procedura di radio-marcatura ricorrenti può essere omesso, come primer fluorescenti sono stabili per un lungo periodo di tempo (più di un anno nelle nostre mani). Il metodo che descriviamo qui utilizza un sequenziatore automatizzato gel, ma con lievi modifiche, sequenziatori capillari può essere utilizzato anche per la separazione cDNA e rilevamento 3. Il parallelismo tra analisi del gel permette di rilevare anche una piccola quantità di RNA scissione o trasformazione. Un altro vantaggio è l'alta risoluzione di questo metodo, come scissione o la trasformazione anche di una sola base del terminale può essere rilevato. Per quanto riguarda la rilevazione di RNA scissione o trasformazione, typically due diversi tipi di estensioni di primer si distinguono. In un caso, il trattamento enzimatico è fatto in vitro utilizzando RNA purificato e l'enzima purificato, mentre nell'altro caso, la lavorazione avviene in vivo e l'RNA risultante viene purificato. In entrambi i casi l'RNA viene sottoposto ad un primer extension effettuata in vitro, tuttavia, a seconda della fonte di RNA, il metodo o è chiamato un primer extension vivo o in vitro. Nel protocollo presentiamo, ci concentriamo esclusivamente sulla vivo primer extension in, a causa della facilità d'uso (non proteine ​​purificate necessario) e la possibilità di determinare punti di partenza trascrizionali e trasformazione in una sola volta. Tuttavia, in vitro estensioni di primer sono in linea di principio configurare allo stesso modo e questo protocollo può servire come punto di partenza. Il metodo qui illustrato può essere applicato a molte specie batteriche purché siano suscettibili di altapurezza e alto rendimento preparazione di acidi nucleici. La ricerca nel nostro laboratorio si concentra sulla portata normativa di tossina-antitossina (TA) Sistemi di 4,5, un campo in cui è ampiamente utilizzato il metodo primer extension. TA-sistemi sono piccoli elementi genetici presenti nei genomi procariotici che consistono di una proteina tossica stabile e endogenamente attiva e una proteina o RNA antitossina lo più instabile che contrasta la tossicità 6,7. Attività di tossina è a volte esercitata da inibizione della replicazione, sintesi della parete cellulare o altri meccanismi, ma il più delle volte per attività RNasi 8,9. Tipicamente, RNasi specificità è determinata effettuando diverse prove, una delle quali è il metodo di primer extension. Reazioni primer extension sono adatti per questa applicazione, come miscela di frammenti di lunghezza clivati ​​e completi possono essere analizzati simultaneamente per determinare la loro 5 'estremità. Utilizzando un mix di in vitro e in vivo estensioni di primer, laspecifica RNasi clivaggio tossina, ad esempio, specificità di sequenza può essere determinata 10-13. <img alt="Estensione del primer, isolamento dell'RNA, sintesi del cDNA, sequenziamento con metodo Sanger, diagramma dell'elettroforesi su gel." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Panoramica della procedura di primer extension. Le colture batteriche sono incubate e trattati in base alle esigenze sperimentali. L'RNA totale viene estratto dalle cellule, trattate con DNasi I per rimuovere tracce di DNA e sottoposti ad una reazione di trascrizione inversa utilizzando bersaglio specifici primer di DNA fluorescenti rendimento cDNA. Il DNA genomico o plasmidi vengono estratti e successivamente utilizzati per fluorescenti reazioni di sequenziamento Sanger per il confronto dimensioni con i frammenti di cDNA. Prodotti primer extension vengono eseguiti insieme a prodotti di sequenziamento Sanger su un gel denaturante di poliacrilammide di urea e analizzati con un laser automatico e microscopio. La base sequenziamento che si allinea con la band cDNA è il lav base 5 'del cDNA (freccia blu). Maggiori informazioni in Fekete, et al. 3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" target="_blank">Fate clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> Una panoramica di tutta la procedura di primer extension può essere trovato in Figura 1. In breve, le cellule batteriche vengono coltivate, raccolte, il pellet cellulare lisato e l'RNA estratto. RNA purificato viene quindi trattato con DNasi I per rimuovere tracce di molecole di DNA che potrebbero agire come modelli per la trascrittasi inversa. Primer fluorescenti specifici sono aggiunti al RNA, ibridato alla regione di interesse e successivamente trascrizione inversa, con conseguente DNA a singolo filamento complementare (cDNA). Una scaletta sequenziamento è stato creato da sequenziamento Sanger tradizionale impiegando primer fluorescenti e separati su un gel di poliacrilammide denaturante a fianco del primer frammenti di estensione di cDNA. La risultantegel viene analizzato confrontando le bande fluorescenti, che permette l'identificazione delle estremità 5 'di interesse. Punti di partenza di trascrizione e siti di lavorazione sono poi valutato individualmente in sequenza comparazioni.

<table><tbody><tr><td>La trascrittasi inversa AMV (20-25 U/&micro; l)</td><td>NEB / Roche</td><td>NEB: M0277-T / Roche: 10109118001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (senza RNasi)</td><td>Ambion (tecnologie per la vita)</td><td>Strumento AM2222</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep-24&nbsp;</td><td>MPBio</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>Primer marcati in fluorescenza</td><td>Biomeri</td><td>n/a</td><td>5' DY-681 modifica di " ordinario" Oligonucleotidi del DNA. Coloranti compatibili come il LICOR IRDye 700/800 sono disponibili anche da altri fornitori come IDTdna.</td></tr><tr><td>Sequenziatore Li-Cor 4200 con software di raccolta dati ImagIR</td> Prodotto <td>Li-Cor</td><td></td><td>fuori produzione</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Ambion (life technologies)</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Mini kit di preparazione dei plasmidi</td><td>QIAGEN</td><td>12125</td><td></td></tr><tr><td>RapidGel-XL-40% Concentrate</td><td>USB</td><td>US75863</td><td></td></tr><tr><td>TAMPONE DI STOCCAGGIO RNA</td><td>Ambion (life technologies)</td><td>AM7000</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Aqua-P/C/I</td><td>Carl Roth</td><td>X985.3</td><td>Alternativa: " Acido-Fenolo: Cloroformio, pH 4,5 (con IAA, 125:24:1)" da Ambion (AM9720)</td></tr><tr><td>SUPERase&bull; In RNase Inhibitor</td><td>Ambion (life technologies)</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>Kit di sequenziamento del ciclo del primer marcato in fluorescenza con 7-deaza-dGTP</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2538</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol reagente</td><td>life technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Perle di zirconia/silice 0,1 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079101z</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescenza base tecnica primer extension determinare trascrizionali punti di partenza e siti di taglio di rnasi in vivo

Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

Fluorescenza estensione primer a base (FPE) è un metodo molecolare per determinare i punti di partenza di trascrizione o siti di trasformazione di molecole di RNA. Ciò è ottenuto mediante trascrizione inversa di RNA di interesse utilizzando specifici primer fluorescente e successiva analisi dei frammenti di cDNA risultante dalla elettroforesi su gel denaturante di poliacrilammide. Contemporaneamente, un tradizionale reazione di sequenziamento Sanger viene eseguito sul gel per mappare le estremità dei frammenti di cDNA alle loro basi corrispondenti esatti. In contrasto con 5&#39;-RACE (Rapid Amplification di cDNA Ends), in cui il prodotto deve essere clonato e sequenziato più candidati, la maggior parte dei frammenti di cDNA generato dall&#39;estensione del primer può essere simultaneamente rilevata in una corsa di gel. Inoltre, l&#39;intera procedura (da trascrizione inversa di analisi finale dei risultati) può essere completato in un giorno lavorativo. Usando primer fluorescente, l&#39;uso di isotopi radioattivi pericolosi reagenti etichettatopossono essere evitati e tempi di lavorazione sono ridotti come i prodotti possono essere rilevati durante la procedura di elettroforesi. Nella seguente protocollo, si descrive un metodo di estensione in vivo di primer fluorescente per rilevare in modo affidabile e rapido l&#39;estremità 5 &#39;di RNA dedurre trascrizionale punti di partenza e siti di lavorazione RNA (ad esempio, dai componenti di sistema tossina-antitossina) a S. aureus, E. coli e altri batteri.

Come illustrato nella figura 6, una reazione di primer extension può essere utilizzato per determinare i punti di partenza trascrizionali di trascritti di interesse e può aiutare a dedurre regioni promotrici (tipicamente identificati da -10 e -35 elementi). Il più alto (più lunga) frammento di cDNA rappresenta il 'estremità del mRNA 5 e quindi può essere facilmente mappato rispetto alla scala sequenziamento. <img alt="inizio della trascrizione di ompA, scissione dell'mRNA; el...

Descriviamo qui un metodo di estensione del primer basato sulla fluorescenza per determinare i punti di partenza trascrizionali dai trascritti batterici e dall'elaborazione dell'RNA in vivo utilizzando un sequenziatore automatico su gel.

Fluorescenza base tecnica Primer Extension determinare trascrizionali punti di partenza e siti di taglio di RNasi In Vivo

Fluorescence based primer extension (FPE) is a molecular method to determine transcriptional starting points or processing sites of RNA molecules. This is ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare i punti di partenza trascrizionali e i siti di scissione degli RNA in vivo dai batteri utilizzando una reazione di estensione del primer fluorescente. Ciò si ottiene coltivando prima batteri come l'e coli o la S aria e isolando le molecole di RNA. Successivamente, l'RNA viene trascritto inversamente utilizzando specifici primer fluorescenti e trascrittasi inversa ottenendo frammenti di CD NA.Quindi il DNA o i plasmidi vengono isolati dalle cellule batteriche e viene creata una scala di sequenziamento Sanger fluorescente dal modello di DNA utilizzando un kit di sequenziamento. Infine, i frammenti di CDNA e le scale di sequenziamento vengono separati e rilevati simultaneamente su un gel di poliacrilammide utilizzando un sequenziatore di gel automatizzato e confrontati tra loro. In definitiva, l'estensione del primer fluorescente viene utilizzata per mappare le cinque estremità primarie delle molecole di RNA fino a una risoluzione di una base.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come la razza o l'estensione primaria basata sulla radioattività, è la rapida identificazione delle cinque estremità delle molecole di RNA, poiché la rilevazione avviene contemporaneamente durante l'elettroforesi. La sensibilità è simile alle estensioni primarie basate sull'attività rossa, ma consente al personale di laboratorio di utilizzare questo metodo senza la necessità di una formazione sulla sicurezza dalle radiazioni con attività di tasso. Abbiamo utilizzato con successo questa tecnica di estensione primaria fluorescente per studiare i componenti degli RNA dei sistemi di antitossine tossiche.Gli stafilococchi che dimostreranno la procedura saranno Christopher Schuster, uno studente laureato del mio laboratorio. Dopo aver preparato un'alta resa di RNA e aver progettato i primer secondo il protocollo di testo, eseguire la reazione di estensione del primer preriscaldando prima il termociclatore a 95 gradi Celsius. Per ogni campione di RNA, mescolare i seguenti composti in una provetta per PCR, denaturare i campioni per un minuto a 95 gradi Celsius.Quindi posizionare le provette sul ghiaccio per cinque minuti per ibridare i primer e l'RNA. Quindi, imposta la macchina PCR a 47 gradi Celsius. Quindi preparare il master mix di trascrizione inversa come descritto qui.Aggiungere quattro microlitri, una miscela master di trascrizione inversa a ciascun campione di RNA ibridato e incubare le provette per un'ora a 47 gradi Celsius. Per fermare la reazione, riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per due minuti. Quindi aggiungere sei microlitri di colorante ammide e conservare per una notte o fino a due settimane al buio a meno 20 gradi Celsius.Dopo aver preparato il DNA genomico o i plasmidi, secondo il protocollo di testo, assemblare la reazione di sequenziamento Sanger mescolando 12 microlitri di circa 10-15 microgrammi di DNA genomico o da 100 a 500 nanogrammi di DNA plasmidico con un microlitro di primer marcato in fluorescenza e un microlitro di pipetta DMSO. Un microlitro di ciascuna miscela di sequenziamento in provette PCR separate e pre-marcate. Quindi aggiungere tre microlitri della miscela di primer D-N-A-D-M-S-O in ogni tubo.Impostare la macchina PCR sul seguente programma ed eseguirla dopo aver posizionato i campioni nella macchina. Dopo la corsa, aggiungere sei microlitri di colorante di caricamento ai campioni e poi sul ghiaccio. In caso di utilizzo immediato o a meno 20 gradi Celsius a lungo termine utilizzando piastre da 25 centimetri pulite e prive di polvere, posizionare distanziatori da 0,25 millimetri sulla lastra di vetro posteriore e abbassare la lastra di vetro dentata sulla parte superiore con l'estremità dentellata delle lastre di vetro e i piloti di ingresso della rotaia entrambi rivolti verso l'alto.Fissare le guide in gel su entrambi i lati delle lastre di vetro e serrare leggermente le manopole per lanciare il gel. Combinare i composti qui elencati in un becher con una barra di agitazione e posizionarli su una piastra di agitazione magnetica. Subito dopo aver aggiunto un PS e in gruppo, utilizzare una siringa da 50 millilitri per prelevare la soluzione di acrilammide e posizionare un filtro da 0,45 nanometri sulla punta.Posizionare le piastre a sandwich con un angolo compreso tra 10 e 20 gradi ed erogare lentamente la soluzione di gel tra le piastre di vetro, spostando continuamente la punta della siringa da un lato all'altro. Interrompere l'erogazione della soluzione in gel una volta che incontra l'estremità inferiore delle lastre di vetro. Usando un gancio per bolle, rimuovere eventuali bolle che potrebbero essersi formate.Quindi far scorrere il distanziatore tascabile in gel tra le lastre di vetro all'estremità dentellata, immergendolo nella soluzione di gel e fissandolo fissando la piastra di fusione, fissare leggermente le viti della guida superiore e lasciare che il gel si solidifichi per una o due ore. Prima di rimuovere la piastra di colata e il distanziatore tascabile, utilizzare acqua distillata deionizzata per pulire la tasca dal sale e dai residui di gel per far scorrere il gel. Far scorrere il supporto del serbatoio tampone nelle guide in gel sulle piastre di vetro anteriori e serrare le manopole.Posizionare il gel nel serbatoio inferiore del gel imager automatizzato contro la piastra riscaldante e fissarlo facendo scorrere il pilota di ingresso della guida nelle staffe dell'apparato. Utilizzare un tampone XTBE per riempire le camere tampone in gel superiore e inferiore. Quindi chiudere la camera tampone inferiore e utilizzare il cavo di alimentazione per collegare la camera tampone superiore all'alimentazione.Se è presente del sale nella tasca del gel, utilizzare il tampone per pipettare ripetutamente nella tasca per pulirla. Quindi utilizzare il coperchio superiore del tampone per chiudere la camera superiore del serbatoio di accumulo. Dopo aver acceso l'imager e il computer e aver avviato il software di raccolta dati IR dell'immagine di base in base al protocollo di testo, utilizzare le impostazioni elencate qui per configurare il controllo dello scanner.Quindi, pre-eseguire il gel vuoto per 20 minuti selezionando voltage on e premendo invio. Nel frattempo, utilizzando una macchina per PCR, riscaldare la scala di sequenziamento e i prodotti di estensione del primer a 90 gradi Celsius per due minuti Prima di raffreddare con ghiaccio, interrompere l'elettroforesi, aprire il sequenziatore di gel automatizzato e rimuovere il coperchio superiore del serbatoio tampone. Quindi inserire il pettine a denti di squalo tra le lastre di vetro e con i denti di squalo.Forare leggermente la pipetta di gel da uno a due microlitri di prodotti di estensione del primer o reazioni di scala di sequenziamento in ciascuna tasca di gel. Per eventuali tasche vuote. Utilizzare il colorante di caricamento per riempirli per evitare un comportamento di funzionamento incoerente, chiudere il serbatoio tampone e lo sportello del sequenziatore di gel.Quindi avviare l'elettroforesi selezionando la tensione attiva per il laser, selezionare lo stato di scansione attivato e premere invio. Una volta che la regione di interesse ha superato il laser, interrompere l'elettroforesi come mostrato qui. Una reazione di estensione del primer può essere utilizzata per determinare i punti di partenza trascrizionali o TSP dei trascritti di interesse e può aiutare a dedurre le regioni promotrici.In questo esempio, il TSP dell'mRNA di MPE è stato identificato come G coerente con i dati pubblicati in precedenza. Si è dedotto che gli elementi del promotore meno 35 e meno 10 sono T-T-G-T-A-A e T-A-G-A-C-T, e questi motivi differiscono solo per le basi di ciascuna delle loro sequenze consenso utilizzando l'estensione del primer per identificare i prodotti di scissione dell'mRNA. La mappatura dell'RNA della scissione vicino al co START da parte dell'RNA Ybi SEC due è mostrata qui quando l'RNA non è presente o inattivo, nessun prodotto di estensione del primer si forma vicino al co on iniziale a causa dell'attività degli RNA.Tuttavia, due bande forti appaiono appena a valle del rivestimento iniziale in questa figura mostra un esperimento di estensione del primer fallito a causa dell'eccesso di RNA nella reazione di trascrizione inversa che impedisce l'identificazione delle singole bande. Ciò dimostra che la quantità totale di RNA stampo deve essere adattata all'abbondanza dell'RNA di interesse. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come chiarire i punti di partenza trascrizionali e i siti di scissione degli RNA in vivo utilizzando primer fluorescenti e un sequenziatore di gel automatizzato con un po' di pratica.Questo metodo è facile e veloce da eseguire. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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Descriviamo metodi photobleaching tra cui Recovery fluorescenza Dopo photobleaching (FRAP) e Perdita Fluorescence In photobleaching (FLIP) per monitorare la dinamica delle proteine ​​della cromatina in staminali embrionali (ES) cellule. Cromatina proteine ​​dinamica, che è considerato uno dei mezzi per studiare la plasticità cromatina, è aumentata in cellule pluripotenti.

Fotodecolorazione saggi (FRAP e FLIP) per misurare la dinamica delle proteine ​​della cromatina in Living cellule staminali embrionali

Abbiamo recentemente riportato un nuovo approccio per generare sonde DNAzyme fluorogenici che possono essere applicati per impostare un semplice, "mix-e-leggere" test di fluorescenza per la rilevazione batterica. Queste sonde di DNA specifiche catalizzare il clivaggio di un cromoforo-modificato DNA-RNA chimerico substrato in presenza della miscela grezza extracellulare (CEM) prodotta da un batterio specifico, così traducendo rilevamento batterica nella generazione del segnale di fluorescenza.

Rilevazione di batteri utilizzando DNAzimi fluorogenici

Le esonucleasi svolgono un ruolo fondamentale nel garantire la stabilità del genoma. La perdita della funzione dell'esonucleasi WRN provoca un invecchiamento precoce. Lo studio dei substrati e di altri requisiti della nucleasi in vitro può aiutare a chiarire il suo ruolo in vivo. Qui dimostriamo un saggio rapido e riproducibile basato sulla fluorescenza per misurare la sua attività nucleasica.

Un saggio di esonucleasi basato sulla fluorescenza per caratterizzare DmWRNexo, ortologo dell'esonucleasi WRN progeroide umana, e la sua applicazione ad altre nucleasi

Ratiometric beacon bimolecolari (RBMBs) possono essere utilizzati per immagini singole trascritti di RNA ingegnerizzati in cellule viventi. Qui, descriviamo la preparazione e purificazione di RBMBs, consegna delle RBMBs in cellule di microporation e l'imaging fluorescente di trascritti di RNA singoli in tempo reale.

In tempo reale Imaging del singolo Engineered RNA trascritti in cellule viventi Utilizzando Ratiometric bimolecolari Beacons

In questo lavoro forniamo un flusso di lavoro sperimentale su come i potenziatori attivi possono essere identificati e convalidati sperimentalmente.

Previsione e Validazione del gene regolatore elementi attivato durante retinoico Acid Induced embrionali cellule staminali Differenziazione

Qui, descriviamo l'assemblaggio di complessi di allungamento della polimerasi RNA II (Pol II) che richiedono solo brevi oligonucleotidi di DNA sintetico e RNA e Pol II purificati. Questi complessi sono utili per studiare i meccanismi alla base dell'elaborazione co-trascrizione delle trascrizioni associate al complesso di allungamento di Pol II.

Complessi di allungamento dell'RNA artificiale Polymerase II per eventi di elaborazione dell'RNA co-trascrizione

L'ibridazione in situ a fluorescenza di RNA a singola molecola (smFISH) è un metodo per quantificare con precisione i livelli e la localizzazione di specifici RNA a livello di singola cellula. Qui riportiamo i nostri protocolli di laboratorio convalidati per l'elaborazione a banco umido, l'imaging e l'analisi delle immagini per la quantificazione di RNA a singola cellula di specifici RNA.

Analisi a singola cellula di alleli trascrizionalmente attivi mediante FISH a singola molecola

Le DNA metiltransferasi sono potenziali bersagli di farmaci antitumorali. Qui, viene presentato un protocollo per valutare piccole molecole per l'inibizione della DNA metiltransferasi. Questo test utilizza un'endonucleasi per accoppiare la metilazione del DNA alla generazione di fluorescenza e consente di monitorare l'attività enzimatica in tempo reale.

Saggio di metilazione del DNA accoppiato a endonucleasi a fluorescenza continua per lo screening degli inibitori della DNA metiltransferasi

Questo studio presenta un saggio FRET raziometrico semplice e di facile utilizzo per il rilevamento e la valutazione quantitativa dell'attività della DNasi e dimostra la sua applicazione nell'analisi di una nucleasi debole.

Valutazione dell'attività della DNasi mediante trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza raziometrica

Questo protocollo misura quantitativamente la stabilità e l'emivita degli RNA potenziatori intergenici e intragenici nelle cellule staminali embrionali di topo utilizzando il trattamento con Actinomicina D, RT-qPCR e analisi di regressione non lineare. Strategie di normalizzazione specifiche per posizione sono incorporate per modellare accuratamente la dinamica del decadimento dell'eRNA in modo dipendente dal contesto.

Valutazione Quantitativa Ottimizzata della Stabilità dell'RNA Potenziatore nelle Cellule Staminali Embrionali di Topo

Scopri un metodo di primer extension fluorescente per mappare i punti di inizio trascrizionale e i siti di taglio dell'RNA in vivo nei batteri. Questa tecnica utilizza un sequenziatore automatico per un'analisi ad alta risoluzione.

Fluorescenza base tecnica Primer Extension determinare trascrizionali punti di partenza e siti di taglio di RNasi In Vivo

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