Fluorescenza base tecnica Primer Extension determinare trascrizionali punti di partenza e siti di taglio di RNasi In Vivo

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare i punti di partenza trascrizionali e i siti di scissione degli RNA in vivo dai batteri utilizzando una reazione di estensione del primer fluorescente. Ciò si ottiene coltivando prima batteri come l'e coli o la S aria e isolando le molecole di RNA. Successivamente, l'RNA viene trascritto inversamente utilizzando specifici primer fluorescenti e trascrittasi inversa ottenendo frammenti di CD NA.

Quindi il DNA o i plasmidi vengono isolati dalle cellule batteriche e viene creata una scala di sequenziamento Sanger fluorescente dal modello di DNA utilizzando un kit di sequenziamento. Infine, i frammenti di CDNA e le scale di sequenziamento vengono separati e rilevati simultaneamente su un gel di poliacrilammide utilizzando un sequenziatore di gel automatizzato e confrontati tra loro. In definitiva, l'estensione del primer fluorescente viene utilizzata per mappare le cinque estremità primarie delle molecole di RNA fino a una risoluzione di una base.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come la razza o l'estensione primaria basata sulla radioattività, è la rapida identificazione delle cinque estremità delle molecole di RNA, poiché la rilevazione avviene contemporaneamente durante l'elettroforesi. La sensibilità è simile alle estensioni primarie basate sull'attività rossa, ma consente al personale di laboratorio di utilizzare questo metodo senza la necessità di una formazione sulla sicurezza dalle radiazioni con attività di tasso. Abbiamo utilizzato con successo questa tecnica di estensione primaria fluorescente per studiare i componenti degli RNA dei sistemi di antitossine tossiche.

Gli stafilococchi che dimostreranno la procedura saranno Christopher Schuster, uno studente laureato del mio laboratorio. Dopo aver preparato un'alta resa di RNA e aver progettato i primer secondo il protocollo di testo, eseguire la reazione di estensione del primer preriscaldando prima il termociclatore a 95 gradi Celsius. Per ogni campione di RNA, mescolare i seguenti composti in una provetta per PCR, denaturare i campioni per un minuto a 95 gradi Celsius.

Quindi posizionare le provette sul ghiaccio per cinque minuti per ibridare i primer e l'RNA. Quindi, imposta la macchina PCR a 47 gradi Celsius. Quindi preparare il master mix di trascrizione inversa come descritto qui.

Aggiungere quattro microlitri, una miscela master di trascrizione inversa a ciascun campione di RNA ibridato e incubare le provette per un'ora a 47 gradi Celsius. Per fermare la reazione, riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per due minuti. Quindi aggiungere sei microlitri di colorante ammide e conservare per una notte o fino a due settimane al buio a meno 20 gradi Celsius.

Dopo aver preparato il DNA genomico o i plasmidi, secondo il protocollo di testo, assemblare la reazione di sequenziamento Sanger mescolando 12 microlitri di circa 10-15 microgrammi di DNA genomico o da 100 a 500 nanogrammi di DNA plasmidico con un microlitro di primer marcato in fluorescenza e un microlitro di pipetta DMSO. Un microlitro di ciascuna miscela di sequenziamento in provette PCR separate e pre-marcate. Quindi aggiungere tre microlitri della miscela di primer D-N-A-D-M-S-O in ogni tubo.

Impostare la macchina PCR sul seguente programma ed eseguirla dopo aver posizionato i campioni nella macchina. Dopo la corsa, aggiungere sei microlitri di colorante di caricamento ai campioni e poi sul ghiaccio. In caso di utilizzo immediato o a meno 20 gradi Celsius a lungo termine utilizzando piastre da 25 centimetri pulite e prive di polvere, posizionare distanziatori da 0,25 millimetri sulla lastra di vetro posteriore e abbassare la lastra di vetro dentata sulla parte superiore con l'estremità dentellata delle lastre di vetro e i piloti di ingresso della rotaia entrambi rivolti verso l'alto.

Fissare le guide in gel su entrambi i lati delle lastre di vetro e serrare leggermente le manopole per lanciare il gel. Combinare i composti qui elencati in un becher con una barra di agitazione e posizionarli su una piastra di agitazione magnetica. Subito dopo aver aggiunto un PS e in gruppo, utilizzare una siringa da 50 millilitri per prelevare la soluzione di acrilammide e posizionare un filtro da 0,45 nanometri sulla punta.

Posizionare le piastre a sandwich con un angolo compreso tra 10 e 20 gradi ed erogare lentamente la soluzione di gel tra le piastre di vetro, spostando continuamente la punta della siringa da un lato all'altro. Interrompere l'erogazione della soluzione in gel una volta che incontra l'estremità inferiore delle lastre di vetro. Usando un gancio per bolle, rimuovere eventuali bolle che potrebbero essersi formate.

Quindi far scorrere il distanziatore tascabile in gel tra le lastre di vetro all'estremità dentellata, immergendolo nella soluzione di gel e fissandolo fissando la piastra di fusione, fissare leggermente le viti della guida superiore e lasciare che il gel si solidifichi per una o due ore. Prima di rimuovere la piastra di colata e il distanziatore tascabile, utilizzare acqua distillata deionizzata per pulire la tasca dal sale e dai residui di gel per far scorrere il gel. Far scorrere il supporto del serbatoio tampone nelle guide in gel sulle piastre di vetro anteriori e serrare le manopole.

Posizionare il gel nel serbatoio inferiore del gel imager automatizzato contro la piastra riscaldante e fissarlo facendo scorrere il pilota di ingresso della guida nelle staffe dell'apparato. Utilizzare un tampone XTBE per riempire le camere tampone in gel superiore e inferiore. Quindi chiudere la camera tampone inferiore e utilizzare il cavo di alimentazione per collegare la camera tampone superiore all'alimentazione.

Se è presente del sale nella tasca del gel, utilizzare il tampone per pipettare ripetutamente nella tasca per pulirla. Quindi utilizzare il coperchio superiore del tampone per chiudere la camera superiore del serbatoio di accumulo. Dopo aver acceso l'imager e il computer e aver avviato il software di raccolta dati IR dell'immagine di base in base al protocollo di testo, utilizzare le impostazioni elencate qui per configurare il controllo dello scanner.

Quindi, pre-eseguire il gel vuoto per 20 minuti selezionando voltage on e premendo invio. Nel frattempo, utilizzando una macchina per PCR, riscaldare la scala di sequenziamento e i prodotti di estensione del primer a 90 gradi Celsius per due minuti Prima di raffreddare con ghiaccio, interrompere l'elettroforesi, aprire il sequenziatore di gel automatizzato e rimuovere il coperchio superiore del serbatoio tampone. Quindi inserire il pettine a denti di squalo tra le lastre di vetro e con i denti di squalo.

Forare leggermente la pipetta di gel da uno a due microlitri di prodotti di estensione del primer o reazioni di scala di sequenziamento in ciascuna tasca di gel. Per eventuali tasche vuote. Utilizzare il colorante di caricamento per riempirli per evitare un comportamento di funzionamento incoerente, chiudere il serbatoio tampone e lo sportello del sequenziatore di gel.

Quindi avviare l'elettroforesi selezionando la tensione attiva per il laser, selezionare lo stato di scansione attivato e premere invio. Una volta che la regione di interesse ha superato il laser, interrompere l'elettroforesi come mostrato qui. Una reazione di estensione del primer può essere utilizzata per determinare i punti di partenza trascrizionali o TSP dei trascritti di interesse e può aiutare a dedurre le regioni promotrici.

In questo esempio, il TSP dell'mRNA di MPE è stato identificato come G coerente con i dati pubblicati in precedenza. Si è dedotto che gli elementi del promotore meno 35 e meno 10 sono T-T-G-T-A-A e T-A-G-A-C-T, e questi motivi differiscono solo per le basi di ciascuna delle loro sequenze consenso utilizzando l'estensione del primer per identificare i prodotti di scissione dell'mRNA. La mappatura dell'RNA della scissione vicino al co START da parte dell'RNA Ybi SEC due è mostrata qui quando l'RNA non è presente o inattivo, nessun prodotto di estensione del primer si forma vicino al co on iniziale a causa dell'attività degli RNA.

Tuttavia, due bande forti appaiono appena a valle del rivestimento iniziale in questa figura mostra un esperimento di estensione del primer fallito a causa dell'eccesso di RNA nella reazione di trascrizione inversa che impedisce l'identificazione delle singole bande. Ciò dimostra che la quantità totale di RNA stampo deve essere adattata all'abbondanza dell'RNA di interesse. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come chiarire i punti di partenza trascrizionali e i siti di scissione degli RNA in vivo utilizzando primer fluorescenti e un sequenziatore di gel automatizzato con un po' di pratica.

Questo metodo è facile e veloce da eseguire. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.