1.11: Colture neuronali primarie

Il cervello è uno degli organi più complessi del corpo, quindi i neuroscienziati hanno spesso bisogno di un sistema più semplice per le manipolazioni sperimentali e le osservazioni. La coltura cellulare è uno di questi sistemi che consente un facile accesso ai neuroni viventi. In generale, la coltura delle cellule comporta la loro crescita in soluzioni speciali chiamate terreni di coltura all'interno di un ambiente sterile e controllabile ? Di solito un'incubatrice calda. Una coltura primaria è quella prodotta da tessuto sezionato da un organismo. Diversi tipi di colture neuronali primarie possono essere realizzate da una varietà di animali, stadi di sviluppo e tessuti del sistema nervoso.

Questo video fornirà un'introduzione al metodo di produzione di colture neuronali primarie e ad alcuni degli esperimenti che utilizzano comunemente queste cellule.

Molti dei modelli animali importanti per la ricerca neuroscientifica possono essere utilizzati per preparare colture neuronali primarie. Con topi e ratti ? due dei mammiferi più comunemente usati nella ricerca biomedica ? Il tessuto neuronale di embrioni, cuccioli appena nati e adulti può essere sezionato per la coltivazione. Gli embrioni e i cuccioli perinatali sono in genere preferiti poiché le cellule cerebrali sono immature e meno suscettibili ai danni.

Vari tessuti del sistema nervoso possono essere isolati e utilizzati per produrre diversi tipi di colture neuronali primarie. Ad esempio, è possibile sezionare parti specifiche del cervello, come il cervelletto, la corteccia e l'ippocampo. Il midollo spinale o i componenti del sistema nervoso periferico, come i gangli della radice dorsale, possono anche essere sezionati e coltivati per far crescere specifici tipi di neuroni.

Indipendentemente dalla fonte del tessuto, il metodo generale per la produzione di colture neuronali primarie può essere riassunto in alcune fasi principali: dissezione, dissociazione, piastratura e mantenimento.

Iniziamo una revisione approfondita di questi passaggi con il primo: dissezione. Nella preparazione per le fasi di dissezione e coltura, la sterilità è fondamentale per evitare che le colture vengano contaminate. Gli strumenti devono essere sterilizzati con alcol e spesso viene utilizzata una cappa a flusso laminare per rimuovere i contaminanti presenti nell'aria.

Per la coltura di neuroni di roditori, il tessuto deve essere rimosso dagli animali appena soppressi in una soluzione salina fredda e tamponata. Utilizzando un microscopio da dissezione, parti più piccole del tessuto ? come l'ippocampo ? Può essere accuratamente isolato per un'ulteriore elaborazione.

Successivamente, è necessario scomporre il campione nei suoi componenti cellulari in un processo noto come dissociazione. Il tessuto sezionato viene prima tritato utilizzando un bisturi o delle forbici. I pezzi di tessuto risultanti vengono quindi trasferiti in un nuovo contenitore. Un enzima proteolitico come la tripsina o la papaina viene quindi aggiunto per digerire le proteine della matrice extracellulare che legano insieme le cellule. Dopo una breve incubazione in un'incubatrice calda o in un bagno d'acqua, i pezzi di tessuto vengono lavati delicatamente con un tampone per rimuovere gli enzimi.

I pezzi di tessuto ammorbiditi possono ora essere dissociati mediante triturazione, che comporta il passaggio del tessuto attraverso una pipetta più volte in modo che le cellule vengano liberate in una singola sospensione cellulare. A questo punto, le cellule possono essere contate per la concentrazione e controllate per la vitalità utilizzando coloranti come il blu di tripano, che aiuta a determinare quanto la sospensione deve essere diluita per una crescita di successo.

Finalmente i neuroni sono pronti per la coltura! Esaminiamo alcune importanti misure che devono essere prese per mantenerli vivi e in salute. La composizione del terreno di coltura utilizzato per far crescere i neuroni è molto importante. Di solito vengono aggiunti ai terreni speciali integratori che supportano la sopravvivenza e la crescita neuronale. Altri additivi possono includere farmaci che inibiscono la divisione delle cellule non neuronali come le cellule gliali.

Dopo che la sospensione cellulare neuronale è stata miscelata con il terreno, le cellule sono pronte per essere piastrate nei contenitori desiderati. Questi possono includere piatti e piastre di coltura o vetrini coprioggetti posti all'interno di questi contenitori. Poiché i neuroni non possono crescere direttamente sul vetro, i vetrini coprioggetti vengono trattati in anticipo per creare superfici migliori per l'adesione e la crescita delle cellule. Questi trattamenti possono includere il rivestimento con proteine sintetiche della matrice extracellulare; ad esempio, polilisina e laminina; o incisione acida per irruvidire la superficie.

Una volta placcati, i neuroni vengono coltivati all'interno di un'incubatrice calda e umidificata. La crescita dei processi neuronali può essere osservata in poche ore o giorni. Per mantenere le colture, una parte dei terreni di coltura viene sostituita con nuovi terreni circa una volta alla settimana. In genere, le colture neuronali primarie vengono utilizzate per esperimenti da pochi giorni a poche settimane dopo la piastra.

Ora che ci sono neuroni che crescono nelle colture, cosa si può fare con queste cellule?

Un metodo di base comunemente applicato alle colture neuronali è la manipolazione genetica mediante trasfezione o trasduzione virale. Il materiale genetico che codifica, ad esempio, una proteina mutante, può essere introdotto nei neuroni in coltura per alterare la funzione neuronale. In alternativa, la trasfezione con RNA a doppio filamento è una tecnica efficace per bloccare l'espressione proteica. La disponibilità di molteplici metodi e reagenti per la manipolazione genetica lo rende un'applicazione particolarmente preziosa per un'ampia varietà di domande di ricerca.

Un esempio di domanda che può essere affrontata con le trasfezioni nelle colture neuronali è: come e dove certe proteine o complessi proteici vengono trasportati alle varie strutture morfologiche del neurone? Per arrivare alla risposta, i neuroni vengono trasfettati con DNA che codifica la proteina di interesse, che può essere fusa con una proteina fluorescente come la proteina fluorescente verde o GFP. I modelli di movimento e la localizzazione della proteina marcata in fluorescenza possono quindi essere monitorati con l'imaging dal vivo. Questo metodo può essere utilizzato per studiare, ad esempio, il traffico dei recettori dei neurotrasmettitori sulla superficie cellulare.

Le colture neuronali primarie sono anche molto utili per gli studi di elettrofisiologia, in cui l'attività elettrica delle singole cellule può essere misurata utilizzando microelettrodi. Il singolo strato di neuroni in una coltura significa che le singole cellule sono facili da bersagliare e che le manipolazioni come i trattamenti farmacologici vengono applicate in modo rapido e uniforme. Ad esempio, l'effetto di un composto in esame sull'attività di un singolo neurone può essere misurato con la tecnica del patch clamp nei neuroni in coltura.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE alle colture neuronali primarie. In questo video, abbiamo dimostrato come vengono preparate queste colture e i tipi di esperimenti per i quali vengono comunemente utilizzate. Le colture neuronali primarie possono essere realizzate da un'ampia varietà di fonti tissutali, in genere utilizzando un metodo che prevede la dissezione, la dissociazione in una sospensione cellulare e la crescita in terreni di coltura in incubatori.

Grazie per l'attenzione!