Analisi rapida e robusta di Cellulare e Molecolare polarizzazione indotta da chemochine Signaling

L'obiettivo della seguente procedura è quello di quantificare rapidamente e automaticamente i cambiamenti nella morfologia cellulare e la localizzazione subcellulare di specifiche proteine di interesse in un gran numero di cellule in risposta a un particolare stimolo. Ciò si ottiene stimolando prima le cellule T con i tipi di interesse della chemio. Nella seconda fase, le cellule vengono marcate in fluorescenza e quindi analizzate mediante citometria a flusso per imaging.

Nella fase finale, il numero di linfociti morfologicamente polarizzati e la quantità di segregazione dei marcatori fluorescenti possono essere valutati in base alla posizione e all'intensità dei pixel per ogni colorazione, a seconda della maschera scelta. In definitiva, questa tecnologia di citometria a flusso di imaging può essere utilizzata per quantificare in modo rapido e robusto i cambiamenti morfologici dei linfociti dopo la stimolazione con chemochine, nonché la posizione di specifiche proteine di interesse all'interno delle cellule polarizzate. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia è che un gran numero di cellule può essere ripetutamente elaborato e analizzato automaticamente, garantendo un'analisi statisticamente forte dei cambiamenti morfologici e della distribuzione proteica.

Nei linfociti T stimolati con chemochine, la stimolazione di tipo Boche delle cellule T inizia lavando cinque volte le cinque cellule per condizione sperimentale in HBSS caldo integrato con centrifughe HEPs da 10 millimolari per cinque minuti a 340 volte G.At temperatura ambiente, rimuovere il supinato e risospendere i pellet in 0,3 millilitri di HBSS caldo pezzo per tubo. Quindi trasferire le sospensioni cellulari in singole provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere da 10 a 500 nanogrammi per millilitro di chemochina a ciascun tubo, quindi capovolgere i tubi più volte per mescolare.

Incubare le cellule in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Dopo 8-10 minuti, interrompere la polarizzazione con 0,3 millilitri di paraldeide calda al 2% integrata con 10 millimolari. Lui piselli.

Quindi mescolare le provette con altro flipping e incubarle per altri cinque minuti a 37 gradi Celsius per colorare le cellule per l'analisi in immunofluorescenza. Quindi, trasferire le cellule T stimolate nelle corrispondenti provette per citometria a flusso. Riempire completamente le provette con il tampone colorante.

Quindi centrifugare le cellule e risospendere i pellet in 100 microlitri di siero fetale di vitello al 5% in PBS. Ora aggiungi cinque microlitri di ZI N-T-H-L-A-A-B-C a ciascun tubo. Vorticali e incuba le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente al buio alla fine dell'incubazione.

Lavare le cellule due volte e poi incubarle in 500 microlitri di para formaldeide all'1%. Dopo 10 minuti, lavare le cellule in altro tampone colorante, quindi riempire completamente le provette con il tampone di permeazione. Dopo aver lavato le cellule due volte nel tampone di permeazione, lasciare le provette per rimuovere il supinato e poi vorticarle per dissociare i pellet cellulari.

Ora colorare i campioni con punto zero 25 microgrammi per millilitro, trixi per lombo, vorticarli e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Quindi, al termine del periodo di incubazione, lavare le cellule nel tampone di permeazione. Ancora una volta, resus.

Sospendi i pellet in 200 microlitri di PBS e poi trasferisci le cellule in singole provette da microcentrifuga per determinare la percentuale di cellule T polarizzate dopo la stimolazione con chemochine. Per prima cosa accendere il citometro a flusso con imaging e lasciarlo calibrare secondo le istruzioni del produttore. Disegnate istogrammi che quantificano i valori della sfumatura RMS dalla popolazione a fuoco selezionata sulla sfumatura RMS.

Istogramma delineare la popolazione di singole cellule su un istogramma dell'area una volta che la provetta della microcentrifuga è stata inserita nella macchina, regolare l'andatura di potenza del laser sulle singole cellule e acquisire 5.000 linfociti T. Nel software di analisi delle idee. Apri i file acquisiti, quindi crea un istogramma che mostri il valore RMS del gradiente per le immagini in campo chiaro ottenute per ogni singola cella, disegnando un gate sulle celle, esibendo un valore di gradiente RMS superiore a 57.

Nel menu di analisi, creare una nuova maschera chiamata erode M1 due dalla maschera morfologica sulle immagini in campo chiaro M zero una erosa di due pixel. Quindi, nel menu delle funzioni di analisi, creare una nuova funzione dell'area calcolata sull'erosione M1 a due maschere dalle celle create nel gate precedente. Aprire un istogramma che mostra l'area delle celle Utilizzando questa maschera appena creata, disegnare un cancello sulle singole cellule T, escludendo le perle di calibrazione e i detriti nell'area piccola, così come i doppietti nell'area grande.

Quindi aprire un. bot costituito dal max grezzo sulla colorazione H-L-A-A-B-C in funzione del pixel max grezzo sulla colorazione Phin nel menu delle maschere di analisi posteriore alla nuova maschera chiamata erode M due due dalla maschera morfologica delle cellule di colorazione H-L-A-A-B-C erose di due pixel. Quindi, nel menu delle funzioni di analisi, crea una nuova funzionalità costituita dal parametro di circolarità calcolato sull'erode M, due, due.

Successivamente creare un altro istogramma per riportare i valori della funzione di circolarità dalle celle precedentemente controllate. Quindi osservando la forma dell'istogramma per le cellule non stimolate, agata RO per le cellule polarizzate, a partire dal valore di circolarità più basso fino al valore limite di circolarità in cui la maggior parte delle cellule non stimolate viene tracciata per valutare la polarizzazione della colorazione dell'actina all'interno delle cellule. Più un istogramma per la somiglianza dei dettagli luminosi, R tre valori per confrontare H-L-A-A-B-C e il foide in colorazione.

Quindi utilizzando la stessa strategia di gating appena dimostrata, più un GA sulle cellule non stimolate per la colorazione segregata non co-localizzata. Il pannello delle statistiche mostra qui la percentuale di cellule T con colorazione polarizzata dell'actina. Vengono mostrati esempi di linfociti T stimolati CCL 19 che cadono nel cancello delle cellule non polarizzate o polarizzate.

Le differenze nella morfologia tra le due sottopopolazioni possono essere chiaramente osservate. La strategia di gating appena dimostrata può essere utilizzata anche per tracciare la percentuale di cellule che cadono nel gate polarizzato in assenza di presenza di CCL 19. Come previsto, è chiaro che la stimolazione delle chemochine aumenta la percentuale di cellule T polarizzate.

È possibile tracciare anche l'indice di circolarità medio dell'intera popolazione cellulare ottenuto in entrambe le condizioni. Infatti, la stimolazione CCL 19 provoca un calo di questo indice. Tuttavia, poiché solo la metà delle cellule è polarizzata, la variazione dell'indice di circolarità medio osservata alla stimolazione con CCL 19 è piccola.

In questo esperimento, le cellule T sono state sezionate in culla con GFP insieme a plasmidi che codificano per i mutanti negativi dominanti del complesso di polarità par sei. PKC zeta. L'istogramma per le cellule non trasfettate ha permesso un gating specifico per le cellule T GFP positive pertinenti, indicando che è stata trasfettata una piccola frazione dell'intera popolazione cellulare.

Il grado di polarizzazione morfologica di queste cellule trasfettate è stato quindi quantificato misurando solo l'indice di circolarità delle cellule GFP positive e un'andatura aggiuntiva per le cellule T. Le esibizioni di bassi valori di circolarità sono state create per stimare la percentuale di cellule polarizzate in ogni condizione assunta. Insieme, questi dati dimostrano che l'interruzione della funzione della CZ farmacocinetica par sei alla via di segnalazione inibisce la polarizzazione delle cellule T indotta da entrambe le chemochine CCL 19 e c Xcl 12.

In linea con i risultati precedenti. Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante lavorare sempre a 37 gradi Celsius durante la fase di stimolazione parentale di insoluzione e la successiva fissazione per garantire una polarizzazione morfologica forte e affidabile dei linfociti.