Name: Analisi rapida e robusta di Cellulare e Molecolare polarizzazione indotta da chemochine Signaling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Scopri come analizzare rapidamente la morfologia cellulare e la localizzazione proteica nei linfociti T stimolati da chemochine utilizzando la citometria a flusso con imaging. Questo metodo consente un'analisi statistica robusta su grandi popolazioni cellulari.

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Gli autori riconoscono notevolmente Pierre Bourdoncle, Thomas Guilbert e Louise Rimbault dello strumento Cochin Imaging. Questo lavoro è stato sostenuto da Inserm, CNRS e Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe labellisée).

1. Preparazione di linfociti T <ol><li> Preparare principale del mouse o cellule T umane come descritto 10,11. </li><li> Coltivare cellule T umane in mezzo completo RPMI con 10% siero umano AB ad una densità di 2 - 3 x 10 6 cellule / ml. NOTA: L&#39;uso di siero fetale di vitello (FCS) invece di siero umano può suscitare polarizzazione spontanea di una grande frazione di cellule T umane in coltura. Conservare queste cellule in coltura per 4 - 5 giorni ed ulteriormente processo in qualsiasi momento durante questo periodo. </li><li> Mantenere cellule T del mouse in mezzo completo RPMI supplementato con 10% FCS ad una densità cellulare simile. Utilizzare subito o il giorno successivo, dopo una / cultura O N a 37 ° C, in presenza di 10 ng / ml IL7. </li><li> Coltivare la linea cellulare T CEM umano completo RPMI supplementato con 10% FCS. </li></ol> 2. chemochine Stimolazione <ol><li> Lavare 5 x 10 5 cellule per condizione sperimentale in caldo medio HBSS integrato con Hepe 10 mMs. Per alcuni esperimenti, co-trasfettare cellule T umane primarie il giorno prima con 2 ug pmaxGFP e 8 mg pcDNA3.1 + (vettore vuoto, controllo), PKCζ chinasi morti, o N-terminali plasmidi PAR6. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in warm medio HBSS-Hepes (utilizzare 0,3 ml x numero di condizioni sperimentali). </li><li> Distribuire le cellule in provette da 1,5 ml microcentrifuga. NOTA: Pertanto, un tubo corrispondente ad una singola condizione sperimentale conterrà 5 x 10 5 cellule in 0,3 ml di HBSS-Hepes medie. Per alcuni esperimenti, aggiungere 500 nM Latrunculin A o veicolo (DMSO) e incubare le cellule per 30 minuti prima della stimolazione chemochine. </li><li> Aggiungere da 10 a 500 ng / ml CCL19 o CXCL12 chemochine in ciascun tubo. NOTA: Usiamo solitamente 10-200 ng chemochine / ml per le cellule T umane. Cellule CEM non esprimono il recettore CCR7 che lega CCL19. Pertanto, le cellule CEM saranno in grado di rispondere a una stimolazione CXCL12. Inoltre, utilizzare concentrazioni più elevate chemochine (300-500 ng / ml) per polarizzare cellule T del mouse. </li><li> Capovolgere i tubi diverse volte e incubare in un bagno d&#39;acqua a 37 ° per 8 o 10 minuti per le cellule T primarie o CEM, rispettivamente. </li><li> Arrestare il processo di polarizzazione aggiungendo a ciascuna provetta 0,3 ml di una soluzione calda contenente 2% paraformaldeide (PFA) e 10 mM Hepes in PBS. Vibrazione le provette e incubare a 37 ° C per 5 min. </li></ol> 3. colorazioni <ol><li> Trasferire le cellule dai tubi microcentrifuga di citometria a flusso tubi. </li><li> Riempire i tubi completamente con una soluzione contenente RT 1% di albumina sierica bovina (BSA), EDTA 0,5 mM e 10 mM Hepes in PBS. </li><li> Centrifugare le provette a 460 g per 4 min. </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 100 microlitri di una soluzione RT contenente 5% FCS in PBS. </li><li> Aggiungere 5 ml di FITC-anti-HLA-ABC in ogni provetta, li vortice, e incubare per 30 min a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. </li><li> Lavare le cellule una volta con PBS contenente 5% FCS, unnd una volta con solo PBS. </li><li> A RT: aggiungere 500 microlitri 1% PFA, incubare per 10 min, poi lavare le cellule con una soluzione contenente 1% BSA, EDTA 0,5 mM e HEPES 10 mM in PBS. </li><li> Eliminare il surnatante, riempire completamente i tubi con una soluzione di PBS contenente 0,2% di BSA, 0,1% saponina, 0,5 mM EDTA e 10 mM Hepes (buffer permeabilizzazione). </li><li> Lavare le cellule due volte in questo mezzo. </li><li> Capovolgere i tubi per rimuovere il supporto e vortice li dissociare il pellet. </li><li> Aggiungere 0,25 mg / ml TRITC-falloidina e / o di una diluizione 1: 100 di anticorpi anti-P-ERM a ciascuna provetta, li vortex e incubare per 30 minuti a RT. </li><li> Lavare le cellule con il buffer permeabilizzazione. Incubare con un anticorpo secondario fluorescente se necessario. </li><li> Risospendere le cellule in 200 microlitri di PBS e trasferirli ai tubi microcentrifuga. NOTA: Le cellule sono pronte per l&#39;acquisizione. Alternativamente, pur mantenendo un volume massimo totale di 200 microlitri per provetta, aggiungere PFA concentrata ad una finale 1%concentrazione al fine di preservare le colorazioni se non devono essere utilizzate le cellule lo stesso giorno per ulteriore elaborazione. </li></ol> 4. Immagini Acquisizione e analisi <ol><li> Accendere l&#39;apparecchio (vedi tabella di reagenti specifici / Equipment) e lasciarlo calibrare stesso, in base alle istruzioni del produttore. NOTA: Il software INSPIRE è stato utilizzato con un obiettivo 40X (0,75 NA). Il software IDEAS 3.0 è stato utilizzato per tutte le quantificazioni segnalati. </li><li> Preparare una serie di finestre di acquisizione che possono essere salvate in un modello per futuri esperimenti. Disegnare istogrammi che quantificano i valori di gradiente RMS. Dalla popolazione &quot;In Focus&quot;, selezionati sulla RMS istogramma pendenza, delimitano la popolazione &quot;cella singola&quot; su un istogramma della zona. Una volta che la provetta è stata inserita nella macchina, regolare la potenza del laser, cancello a cellule singole e acquisire 5.000 T linfociti. </li><li> Nelle idee morbideware, aprire il file di acquisizione e creare un istogramma che mostra il valore del valore RMS gradiente per le immagini con sfondo chiaro (Canale 1) ottenuto per ogni singola cella. Disegnare un cancello sulla gradiente istogramma RMS che considera le cellule espositrici RMS valore gradiente sopra 57. NOTA: Il gradiente RMS permette di prendere in considerazione nell&#39;analisi solo i linfociti T che sono nel piano focale. Abbiamo determinato empiricamente che singole cellule che presentano un valore di gradiente RMS superiore a 57 sono nel piano focale, e possono essere considerati accuratamente. </li><li> Nel menu Analysis / Maschere, creare una nuova maschera, chiamato Erode (M01,2) dalla maschera morfologia sulle immagini brightfield M01, eroso di 2 pixel. Poi, nel Analisi / menu Impostazioni, creare una nuova caratteristica della zona, calcolato sulla maschera Erode (M01,2). Dalle celle selezionate nel cancello precedente, aprire un istogramma che mostra l&#39;area di celle che utilizzano questa maschera appena creato. La morfologia maschere che sono disponibili: NOTEpredefinito è molto più grande della dimensione reale della cella. Pertanto, è più preciso di erodere fino a 2 pixel. </li><li> Disegnare una porta sulle singole cellule T, escludendo sferette di calibrazione e detriti (piccola area) e le doppiette (Large Area). Regolare questa porta ad ogni acquisizione. NOTA: Variazioni nella dimensione della cella influenzerà la posizione del cancello. Come cellule T topo sono più piccoli delle cellule T umane che sono a loro volta inferiori cellule CEM, l&#39;area di ogni tipo di cellula sarà proporzionale alle sue dimensioni. </li><li> Considerando i singoli, in-fuoco cellule che sono state gated ai passi precedenti, aprire un diagramma a punti costituito dal grezzo Max Pixel sulla colorazione HLA-ABC (canale 2, asse x) in funzione del grezzo Max Pixel sul falloidina colorazione (Channel 4, l&#39;asse y). Creare una porta per escludere gli eventi fluorescenti senza macchia o saturi. Aperte due istogrammi che mostrano la Raw Max Pixel per HLA-ABC (Canale 2) e falloidina (Channel 4) colorazioni. </li><li> Nel Analysis / menù Maschere, createa nuova maschera, chiamato Erode (M02,2) dalla maschera morfologia delle cellule HLA-ABC macchiati (Canale 2), eroso di 2 pixel. Poi, nel Analisi / menu Impostazioni, creare una nuova funzione che consiste del parametro circolarità, calcolato sulla Erode (M02,2). NOTA: Questo parametro misura la deviazione della forma cellula da un cerchio. Pertanto, una cellula T perfettamente rotonda avrà un valore elevato circolarità che cellule polarizzate allungate esporrà un indice circolarità bassa. </li><li> Successivamente, creare un istogramma che riporterà i valori della funzione Circolarità dalle cellule gated precedenza. Utilizzare questo istogramma per tracciare direttamente la distribuzione di un individuo, popolazione cellulare a fuoco secondo il valore della circolarità per ogni singola cella. </li><li> Guardando la forma dell&#39;istogramma per cellule non stimolate, elaborare un cancello per cellule polarizzate, a partire dal valore circolarità basso fino al valore limite circolarità dove la maggior parte delle cellule non stimolatesono tracciate. Guardate il display statistiche per la percentuale di cellule polarizzate tra la popolazione gated (% Gated). NOTA: Abbiamo impostato questa porta per valori di indice circolarità sotto 13. </li><li> Per guardare la polarizzazione della colorazione actina nelle cellule, tracciare un istogramma del brillante dettaglio valore Similarity R3, confrontando la colorazione HLA-ABC (canale 2) e la colorazione falloidina (Channel 4). NOTA: Più grande è il valore di questa funzionalità, il più sovrapposto le due colorazioni sono. </li><li> Utilizzando la stessa strategia di gating come prima, tracciare una porta e sulle cellule non stimolate per la colorazione segregato che mostra la percentuale di cellule con colorazione polarizzata actina. </li><li> Al termine, la percentuale di cellule che mostrano un segregazione nella distribuzione del MHC di classe I e colorazioni falloidina, la percentuale di cellule polarizzate insieme con i valori medi degli indici di similarità e circolarità di tutte le celle ± SD sono mostrati in correspStatistiche onding pannelli. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Usando una tecnologia recente del flusso di imaging citometria, una strategia rapida ed informativo gating per analizzare gli eventi cellulari e molecolari indotti dalla stimolazione chemochine è presentato. Da un unico esperimento, si possono ottenere due tipi principali di informazioni: le variazioni di morfologia cellulare indotta da chemochine stimolazione e la distribuzione subcellulare di proteine ​​differenti durante il processo di polarizzazione. È interessante notare che la prova è prevista anche la possibilità...

Chemochine sono piccole proteine ​​solubili che attirano le cellule a posizioni specializzate 1. Pertanto, partecipano al corretto posizionamento delle cellule in tessuti, una funzione cruciale per lo sviluppo e la fisiologia. Il sistema immunitario non fa eccezione a questa regola in quanto si basa sull&#39;azione di molti diversi tipi di cellule che agiscono di concerto per montare una risposta immunitaria efficace. Controllando la posizione specifica di un tipo di cellula immunitaria in un dato stato, chemochine sono pre-preliminare antigeni estranei possono essere rilevati e neutralizzati. In linfociti T in particolare, chemochine si legano a specifici recettori di superficie che, dopo l&#39;impegno, suscitano molti segnali intracellulari (aumento di calcio, ERK fosforilazione, attivazione Rho GTPasi, aumento delle integrine affinità e citoscheletro alterazioni) che favoriscono la motilità cellulare T 2,3. A livello cellulare, si possono osservare alterazioni morfologiche indotte dopo stimolazione chemochine.Questi cambiamenti nella forma delle cellule sono particolarmente drammatica in cellule T: cellule T riposo hanno una morfologia rotonda tallone-come quando si viaggia nel flusso sanguigno. Tuttavia, il rilevamento della presenza di chemochine in siti infiammatori o in prossimità degli organi linfoidi sta per cambiare la forma delle cellule T che ora adottano una tipica morfologia &quot;hand-mirror&quot; costituito da un modulo bipolare: un bordo d&#39;attacco al fronte e un bordo di uscita, o uropod, sul retro 4. Inoltre, componenti intracellulari possono dividersi in queste due regioni opposte di una cellula T polarizzata per sostenere la migrazione. Ad esempio, i filamenti di actina polimerizzazione aumenta su chemochine stimolazione 5 e actina polimerizzata accumula nella parte anteriore di una T cellule polarizzate 2. D&#39;altra parte, diverse proteine, come le proteine ​​fosforilate della Ezrin-radixina-Moesin (ERM) famiglia che collegano la membrana plasmatica della corticale citoscheletro F-actina, ri-localizzano al uropod di polarizzataCellule T 6. È interessante notare che, noi e altri hanno dimostrato che questo processo di polarizzazione è necessario per la migrazione delle cellule T. Infatti, qualsiasi trattamento che interferisce con la polarizzazione inibisce la motilità cellulare. Per esempio, l&#39;inibizione dell&#39;attività dei membri della proteina atipica chinasi C (PKC) famiglia, polarizzazione cellulare PKCζ e PKCι blocchi T e il loro processo di scansione migratoria delle cellule dendritiche 7. Polarizzazione delle cellule T è anche regolato da Rho GTPasi. Abbiamo dimostrato che la modulazione dell&#39;attività RhoA dalla proteina Fam65b recentemente descritta interferisce con i cambiamenti nella morfologia delle cellule T e la loro capacità di migrare in un saggio Transwell 6. Come polarizzazione è un passo prerequisito per la motilità cellulare, è quindi essenziale essere in grado di quantificare come lettura principale di risposte chemochine. Alterazioni di forma delle cellule sono stati precedentemente misurati manualmente 8. Tuttavia, questo tipo di quantificazione è molto in termini di tempo, in modo che di solito solo pochidecine di cellule sono presi in considerazione. Qui, un nuovo metodo viene presentato per quantificare rapidamente il grado di alterazioni forma di T linfociti esposti a chemochine stimolazione. Un flusso di imaging citometria tecnologia (vedere Tabella di reagenti specifici / Equipment) viene utilizzato, che combina i vantaggi di un citofluorimetro e un microscopio 9 quantificare efficacemente la quantità di cellule polarizzate in diverse condizioni di stimolazione chemochine. Oltre alla quantificazione delle alterazioni morfologiche che si può misurare robusta con questa tecnologia, è anche possibile valutare le variazioni di localizzazione subcellulare di alcune proteine ​​su segnalazione chemochine.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Siero umano AB</td><td>PAA</td><td>C11-021</td><td>Preriscaldare per inattivare il complemento.</td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3300</td><td>Preriscaldare per inattivare il complemento.</td></tr><tr><td>Kit nucleofattore per cellule T umane</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Murine CCL19</td><td>Peprotech</td><td>250-27B</td><td>Le aliquote vengono scongelate con ghiaccio prima di aggiungere la chemochina alle cellule.</td></tr><tr>Le aliquote <td>umane CCL19</td><td>Peprotech</td><td>300-29B</td><td>vengono scongelate con ghiaccio prima di aggiungere la chemochina alle cellule.</td></tr><tr>Le aliquote <td>umane CXCL12</td><td>Peprotech</td><td>300-28A</td><td>vengono scongelate su ghiaccio prima di aggiungere la chemochina alle cellule. Questa chemochina può essere utilizzata anche sulle cellule T di topo.</td></tr><tr><td>Scienze della microscopia elettronica</td> <td>PFA</td><td>157-8-100</td><td>Questa è una soluzione di PFA all'8% in acqua. Miscelare volume a volume con 2x PBS per ottenere una soluzione di PFA al 4% in PBS.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Fluka</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 falloidina</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo FITC-anti-HLA-ABC</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1838</td><td>clone B9.12.1</td></tr><tr><td>Anti-P-ERM anticorpo</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>3149P</td><td></td></tr><tr><td>ImageStreamx Mark II</td><td>Amnis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analisi rapida e robusta di cellulare e molecolare polarizzazione indotta da chemochine signaling

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Le cellule rispondono alla stimolazione chemochine, perdendo la loro forma rotonda in una polarizzazione processo chiamato, e alterando la localizzazione subcellulare di molte proteine. Tecniche di imaging classici sono stati usati per studiare questi fenomeni. Tuttavia, hanno richiesto l&#39;acquisizione manuale di molte cellule seguite da tempo quantificazione della morfologia e la co-localizzazione della colorazione di decine di cellule. Qui, un metodo rapido e potente è descritto per studiare questi fenomeni su campioni costituiti da diverse migliaia di cellule usando un flusso di imaging citometria tecnologia che combina i vantaggi di un microscopio con quelle di un citometro. Utilizzando linfociti T stimolate con CCL19 e colorazione per le molecole MHC di classe I e actina filamentosa, una strategia di gating è presentato per misurare simultaneamente il grado di alterazioni di forma e la misura di co-localizzazione di marcatori che sono affetti da segnalazione CCL19. Inoltre, questa strategia ci ha permesso di gating Observe la segregazione di actina filamentosa (nella parte anteriore) e fosforilata proteine ​​Ezrin-radixina-Moesin (fosfo-ERM) (nella parte posteriore) in cellule T polarizzate dopo la stimolazione CXCL12. Questa tecnica è anche utile per osservare l&#39;effetto di blocco sulla polarizzazione di due elementi differenti: inibizione della polimerizzazione mediante un inibitore farmacologico ed espressione dei mutanti del Par6 / atipica PKC percorso di segnalazione. Così, la prova viene dimostrato che questa tecnica è utile per analizzare sia le alterazioni morfologiche e redistribuzioni di proteine.

Il primo esempio scelto qui riguarda l'uso di linfociti T primari umani stimolati con CCL19. Tuttavia, la stessa strategia può essere utilizzata con le cellule T di topo primaria, linee cellulari T o qualsiasi altro tipo di cellula sensibile alla stimolazione chemochine. La strategia di gating qui presentato comprende una serie di finestre che selezionano gli eventi focalizzato, poi le singole celle. Infine la gamma di intensità di fluorescenza è seguito come esempio su due marcatori: MHC classe I HLA-ABC e actina filam...

La segnalazione delle chemochine suscita marcate alterazioni della morfologia cellulare e alcune importanti ridistribuzioni delle proteine intracellulari. Qui, viene fornito un protocollo rapido e dettagliato per studiare questi eventi.

Analisi rapida e robusta di Cellulare e Molecolare polarizzazione indotta da chemochine Signaling

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

L'obiettivo della seguente procedura è quello di quantificare rapidamente e automaticamente i cambiamenti nella morfologia cellulare e la localizzazione subcellulare di specifiche proteine di interesse in un gran numero di cellule in risposta a un particolare stimolo. Ciò si ottiene stimolando prima le cellule T con i tipi di interesse della chemio. Nella seconda fase, le cellule vengono marcate in fluorescenza e quindi analizzate mediante citometria a flusso per imaging.Nella fase finale, il numero di linfociti morfologicamente polarizzati e la quantità di segregazione dei marcatori fluorescenti possono essere valutati in base alla posizione e all'intensità dei pixel per ogni colorazione, a seconda della maschera scelta. In definitiva, questa tecnologia di citometria a flusso di imaging può essere utilizzata per quantificare in modo rapido e robusto i cambiamenti morfologici dei linfociti dopo la stimolazione con chemochine, nonché la posizione di specifiche proteine di interesse all'interno delle cellule polarizzate. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia è che un gran numero di cellule può essere ripetutamente elaborato e analizzato automaticamente, garantendo un'analisi statisticamente forte dei cambiamenti morfologici e della distribuzione proteica.Nei linfociti T stimolati con chemochine, la stimolazione di tipo Boche delle cellule T inizia lavando cinque volte le cinque cellule per condizione sperimentale in HBSS caldo integrato con centrifughe HEPs da 10 millimolari per cinque minuti a 340 volte G.At temperatura ambiente, rimuovere il supinato e risospendere i pellet in 0,3 millilitri di HBSS caldo pezzo per tubo. Quindi trasferire le sospensioni cellulari in singole provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere da 10 a 500 nanogrammi per millilitro di chemochina a ciascun tubo, quindi capovolgere i tubi più volte per mescolare.Incubare le cellule in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Dopo 8-10 minuti, interrompere la polarizzazione con 0,3 millilitri di paraldeide calda al 2% integrata con 10 millimolari. Lui piselli.Quindi mescolare le provette con altro flipping e incubarle per altri cinque minuti a 37 gradi Celsius per colorare le cellule per l'analisi in immunofluorescenza. Quindi, trasferire le cellule T stimolate nelle corrispondenti provette per citometria a flusso. Riempire completamente le provette con il tampone colorante.Quindi centrifugare le cellule e risospendere i pellet in 100 microlitri di siero fetale di vitello al 5% in PBS. Ora aggiungi cinque microlitri di ZI N-T-H-L-A-A-B-C a ciascun tubo. Vorticali e incuba le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente al buio alla fine dell'incubazione.Lavare le cellule due volte e poi incubarle in 500 microlitri di para formaldeide all'1%. Dopo 10 minuti, lavare le cellule in altro tampone colorante, quindi riempire completamente le provette con il tampone di permeazione. Dopo aver lavato le cellule due volte nel tampone di permeazione, lasciare le provette per rimuovere il supinato e poi vorticarle per dissociare i pellet cellulari.Ora colorare i campioni con punto zero 25 microgrammi per millilitro, trixi per lombo, vorticarli e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Quindi, al termine del periodo di incubazione, lavare le cellule nel tampone di permeazione. Ancora una volta, resus.Sospendi i pellet in 200 microlitri di PBS e poi trasferisci le cellule in singole provette da microcentrifuga per determinare la percentuale di cellule T polarizzate dopo la stimolazione con chemochine. Per prima cosa accendere il citometro a flusso con imaging e lasciarlo calibrare secondo le istruzioni del produttore. Disegnate istogrammi che quantificano i valori della sfumatura RMS dalla popolazione a fuoco selezionata sulla sfumatura RMS.Istogramma delineare la popolazione di singole cellule su un istogramma dell'area una volta che la provetta della microcentrifuga è stata inserita nella macchina, regolare l'andatura di potenza del laser sulle singole cellule e acquisire 5.000 linfociti T. Nel software di analisi delle idee. Apri i file acquisiti, quindi crea un istogramma che mostri il valore RMS del gradiente per le immagini in campo chiaro ottenute per ogni singola cella, disegnando un gate sulle celle, esibendo un valore di gradiente RMS superiore a 57.Nel menu di analisi, creare una nuova maschera chiamata erode M1 due dalla maschera morfologica sulle immagini in campo chiaro M zero una erosa di due pixel. Quindi, nel menu delle funzioni di analisi, creare una nuova funzione dell'area calcolata sull'erosione M1 a due maschere dalle celle create nel gate precedente. Aprire un istogramma che mostra l'area delle celle Utilizzando questa maschera appena creata, disegnare un cancello sulle singole cellule T, escludendo le perle di calibrazione e i detriti nell'area piccola, così come i doppietti nell'area grande.Quindi aprire un. bot costituito dal max grezzo sulla colorazione H-L-A-A-B-C in funzione del pixel max grezzo sulla colorazione Phin nel menu delle maschere di analisi posteriore alla nuova maschera chiamata erode M due due dalla maschera morfologica delle cellule di colorazione H-L-A-A-B-C erose di due pixel. Quindi, nel menu delle funzioni di analisi, crea una nuova funzionalità costituita dal parametro di circolarità calcolato sull'erode M, due, due.Successivamente creare un altro istogramma per riportare i valori della funzione di circolarità dalle celle precedentemente controllate. Quindi osservando la forma dell'istogramma per le cellule non stimolate, agata RO per le cellule polarizzate, a partire dal valore di circolarità più basso fino al valore limite di circolarità in cui la maggior parte delle cellule non stimolate viene tracciata per valutare la polarizzazione della colorazione dell'actina all'interno delle cellule. Più un istogramma per la somiglianza dei dettagli luminosi, R tre valori per confrontare H-L-A-A-B-C e il foide in colorazione.Quindi utilizzando la stessa strategia di gating appena dimostrata, più un GA sulle cellule non stimolate per la colorazione segregata non co-localizzata. Il pannello delle statistiche mostra qui la percentuale di cellule T con colorazione polarizzata dell'actina. Vengono mostrati esempi di linfociti T stimolati CCL 19 che cadono nel cancello delle cellule non polarizzate o polarizzate.Le differenze nella morfologia tra le due sottopopolazioni possono essere chiaramente osservate. La strategia di gating appena dimostrata può essere utilizzata anche per tracciare la percentuale di cellule che cadono nel gate polarizzato in assenza di presenza di CCL 19. Come previsto, è chiaro che la stimolazione delle chemochine aumenta la percentuale di cellule T polarizzate.È possibile tracciare anche l'indice di circolarità medio dell'intera popolazione cellulare ottenuto in entrambe le condizioni. Infatti, la stimolazione CCL 19 provoca un calo di questo indice. Tuttavia, poiché solo la metà delle cellule è polarizzata, la variazione dell'indice di circolarità medio osservata alla stimolazione con CCL 19 è piccola.In questo esperimento, le cellule T sono state sezionate in culla con GFP insieme a plasmidi che codificano per i mutanti negativi dominanti del complesso di polarità par sei. PKC zeta. L'istogramma per le cellule non trasfettate ha permesso un gating specifico per le cellule T GFP positive pertinenti, indicando che è stata trasfettata una piccola frazione dell'intera popolazione cellulare.Il grado di polarizzazione morfologica di queste cellule trasfettate è stato quindi quantificato misurando solo l'indice di circolarità delle cellule GFP positive e un'andatura aggiuntiva per le cellule T. Le esibizioni di bassi valori di circolarità sono state create per stimare la percentuale di cellule polarizzate in ogni condizione assunta. Insieme, questi dati dimostrano che l'interruzione della funzione della CZ farmacocinetica par sei alla via di segnalazione inibisce la polarizzazione delle cellule T indotta da entrambe le chemochine CCL 19 e c Xcl 12.In linea con i risultati precedenti. Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante lavorare sempre a 37 gradi Celsius durante la fase di stimolazione parentale di insoluzione e la successiva fissazione per garantire una polarizzazione morfologica forte e affidabile dei linfociti.

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