Neural Stem Cell Transplantation in Sperimentale Contusivi Model of Spinal Cord Injury

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di descrivere in dettaglio un modello di contusione della lesione del midollo spinale nei topi, seguito da un trapianto di cellule staminali neurali. Ciò si ottiene marcando prima le cellule post-mortem, le cellule precursori neurali o le NPC PM con il tracciante vitale PKH 26. Successivamente, viene praticata un'incisione dorsale sul topo e il midollo spinale viene esposto.

Quindi viene utilizzato un dispositivo di impatto a orizzonte infinito o IH per creare una lesione sul midollo spinale. Infine, il PKH 26 marcato PM e PC vengono iniettati nella vena caudale del topo. In definitiva, viene seguito il destino della PKH 20 innestata alle 18:00 e dei PC nel sito della lesione.

Il modello della lesione replica l'uomo con lesione del midollo spinale. La lesione meccanica primaria è seguita da una progressiva degenerazione secondaria in cui vengono studiati il trattamento cellulare e farmacologico. Le applicazioni descritte possono fornire una base metodologica per ottenere ulteriori approfondimenti sulla fede.

Induzione di cellule staminali trapiantate in un midollo spinale mentre sono in corso degenerazioni ed eventi infiammatori. A dimostrare la lesione sarà il Dr.Tony Laja Longo, dottorando in laboratorio. Mentre l'iniezione della coda sarà eseguita dal Dr.Ache, che è un borsista post-dottorato in laboratorio, a partire da cellule staminali neurali che soddisfano i criteri descritti nel protocollo di testo.

Resus sospendere le cellule a una concentrazione di una volta per 10 per sei cellule per 150 microlitri. Preparare almeno 1,2 volte 10-6 cellule per topo per avere abbastanza cellule per caricare la pipetta. Con il terreno delle cellule staminali neurali, lavare le cellule tre volte in una fiala conica da 10 millilitri, girando a 500 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente per pellettare le cellule.

Dopo ogni lavaggio, prima del conteggio finale della centrifuga, le cellule dopo la centrifuga, aspirano il surnatante, lasciando circa 25 microlitri di liquido per evitare l'aspirazione di eventuali cellule. Successivamente, preparare una sospensione a due X aggiungendo un millilitro di diluente C al palato cellulare e utilizzare un pipettaggio delicato per risospenderla immediatamente. Prima della colorazione, preparare una soluzione di colorante due x nel diluente C aggiungendo quattro microlitri della soluzione di etanolo D PKH 26 a un millilitro di diluente C in un tubo e mescolare bene.

Per disperdere rapidamente, aggiungere un millilitro di due x sospensione cellulare a un millilitro di due XD soluzione e miscelare immediatamente il campione mediante pipettaggio. Dopo aver incubato la sospensione dello stampo cellulare per uno-cinque minuti, interrompere la colorazione aggiungendo un volume uguale di soluzione di BSA all'1% in HBSS e incubare per un minuto. Quindi centrifugare le cellule a 500 volte G per 10 minuti e rimuovere con cura il surnatante.

Utilizzare 10 millilitri di terreno completo per risospendere il pellet cellulare per valutare il recupero cellulare, la vitalità cellulare e l'intensità della fluorescenza. Centrifugare le cellule, scartare il surnatante e aggiungere 10 millilitri di HBSS al pellet cellulare. Lavare due volte con HBSS e risospendere le cellule in una soluzione fisiologica sterile.

Dopo aver preparato l'area chirurgica e un topo secondo il protocollo di testo, posizionare l'animale con il lato dorsale rivolto verso l'alto su uno scaldavetrini per evitare l'ipotermia durante l'intervento con un bisturi, praticare un'incisione verticale sulla regione di interesse da T sette a T 12 utilizzando una pinza. Tenere la pelle e il cuscinetto adiposo superficiale che si trovano tra lo spazio tra il quinto e il sesto processo toracico sotto uno stereomicroscopio. Conta il processo sotto il vaso sanguigno come T sei, quindi passa a T sette.

Quindi posizionare un piccolo cuscinetto sotto il lato ventrale del topo per aumentare la curvatura della colonna vertebrale e utilizzare una pinza grof per bloccare la colonna vertebrale per immobilizzarla. Quindi, usa un bisturi per tagliare bilateralmente il para dei muscoli vertebrali da T sette a T 10 a livello vertebrale fino a quando la superficie dorsale della lamina tocca la punta del bisturi. Quindi usa un bisturi per spuntare la giunzione da T sette a T 10 a livello vertebrale fino a quando la superficie dorsale della lamina tocca l'arresto della punta del bisturi nello spazio tra le minuscole sporgenze T otto e T nove.

Quindi usa le micro forbici per tagliare il tessuto tra T otto e T nove e T nove e T 10. Ora usa il rongeur per rimuovere il processo T nine. Esporre la giunzione usando le micro forbici per raschiare via con cura lo strato muscolare.

Continua fino a quando l'osso non è esposto. Usa una pinza per rimuovere i muscoli dalla lamina e apri un piccolo spazio tra le vertebre. Quindi inserire delicatamente le micro forbici sotto l'osso.

Tagliare la lamina su entrambi i lati e utilizzare la pinza per rimuoverla, esponendo il cordino. Usa il ron jour per rimuovere eventuali frammenti ossei liberi o frastagliati che sono rimasti. Quindi rimuovere la metà superiore del processo dorsale del nove T.

Dopo aver seguito il protocollo del dispositivo di impatto IH, secondo le linee guida nel testo, utilizzare quattro suture riassorbibili per chiudere l'incisione coprendo prima il midollo spinale esposto nel sito della lamina rimossa. Facendo attenzione a non pizzicare i muscoli sottostanti. Utilizzare due o tre clip reflex per chiudere la pelle.

Iniettare due millilitri di soluzione fisiologica nella parte bassa della schiena per via sottocutanea e posizionare il mouse in una gabbia di preriscaldamento su un termoforo per recuperare. Per effettuare un'iniezione di cellule nella vena caudale. Risospendere le cellule nella provetta e caricare 75 microlitri in una siringa da 0,3 millilitri, assicurandosi che non siano presenti bolle nella sospensione cellulare.

Per evitare la sedimentazione cellulare, mantenere la siringa in posizione orizzontale. Posiziona il mouse sotto la lampada riscaldante per dilatare le vene della coda. Quindi tirare delicatamente il mouse nel sistema di ritenuta per visualizzare la vena laterale della coda, che appare come una sottile linea blu.

Usa un tampone imbevuto di alcol per pulire la coda e, una volta visualizzata la vena, afferra la vena della coda tra il dito medio e il pollice della mano sinistra. La contusione T nove dimostrata in questo video ha causato la perdita transitoria della funzione degli arti posteriori tre volte da 10 alla quinta cellula o PBS sono state iniettate nella vena caudale in tre iniezioni effettuate 30 minuti, sei ore e 18 ore dopo l'infortunio. Come mostrato qui, entro due o tre settimane, la PBS trattata con lesioni, i topi sono migliorati e la funzione degli arti posteriori ha raggiunto tre punti della scala basale del topo o i topi BMS trattati con PM.NPC, tuttavia, hanno mostrato un recupero più elevato e hanno raggiunto 4,5 punti di BMS come si vede qui, la maggior parte delle NPC pm innestate marcate con PKH 26, accumulate ai bordi dei cluster che formano la lesione.

Subito dopo la somministrazione, le cellule trapiantate sono migrate lungo i bordi della lesione e in modo più diffuso dove si sono differenziate in neuroni. A 30 giorni dopo la lesione e il trapianto, il corpo cellulare delle NPC pm è aumentato di dimensioni e nella maggior parte delle cellule, i processi dendritici erano evidenti e completamente immuno colorati dagli anticorpi specifici a cui mappare Durante l'ottenimento di questa procedura professionale, è importante ricordare che forze più elevate possono aumentare la mortalità nell'animale a causa di lesioni più gravi. Pertanto, suggeriamo di utilizzare il nostro paradigma di lesione che è seguito da un processo di recupero più riproducibile.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere un modello sperimentale riproducibile di lesione traumatica del midollo spinale nel topo utilizzando l'impattatore dell'orizzonte infinito.