L'uso di stopped-flow fluorescenza ed etichettati nucleotidi di analizzare il ciclo Fatturato ATP di kinesine

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la cinetica del legame e della dissociazione nucleotidica durante il ciclo di turnover A TP di una chinesina. Ciò si ottiene preparando prima la proteina chinesina, priva di nucleotidi o caricata con nucleotidi marcati in fluorescenza. Successivamente, la chinesina preparata viene miscelata con il nucleotide utilizzando un fluorimetro a flusso arrestato e si osserva il cambiamento nella fluorescenza associato al legame o alla dissociazione del nucleotide marcato in fluorescenza.

Quindi la variazione della fluorescenza viene adattata a una funzione esponenziale per ottenere una costante di velocità. Infine, le costanti di velocità misurate sono devolute e le costanti di velocità sono attribuite a particolari transizioni del ciclo di turnover A TP. In definitiva, la combinazione di nucleotide marcato in fluorescenza fluorescente e fluorescenza a flusso interrotto viene utilizzata per misurare la cinetica del legame e della dissociazione dei nucleotidi.

CIN A dimostrare la procedura saranno Jennifer Patel, postdoc, e Hannah Belch, una studentessa laureata del mio laboratorio. Dopo aver determinato l'intensità di fluorescenza della chinesina al momento del legame del nucleotide marcato con l'uomo, come indicato nel protocollo di testo, a una soluzione di un massimo di 20 micromolari di chinesina in tampone privo di magnesio a un millimolare di EDTA e un millimolare di DTT, incubare la soluzione per 15 minuti a 25 gradi Celsius, impostare una colonna di filtrazione su gel G 25 SX a flusso di gravità ed equilibrare con almeno tre volumi di colonna di un buffer. Quindi caricare la soluzione di essina nella colonna per separare i nucleotidi liberi e l'EDTA dalla chinesina.

Riparare una provetta di raccolta aggiungendo un volume di soluzione di cloruro di magnesio da 100 millimolari alla provetta vuota, in modo tale che la concentrazione finale di cloruro di magnesio sia di un millimolare. Dopo la raccolta della soluzione di chinesina, utilizzando un tampone privo di magnesio appropriato, eluire rapidamente la chinesina. La presenza di cloruro di magnesio nella provetta di raccolta aiuta a stabilizzare la chinesina immediatamente dopo che Ian è uscito dalla colonna, ha conservato la chinesina su ghiaccio e l'ha utilizzata entro una o due ore.

Nel frattempo, prepara un uomo una serie di concentrazioni TP. Scegliere l'intervallo di concentrazioni in base alla concentrazione disponibile di chinesina. Per ogni concentrazione di mant a TP preparare un'adeguata concentrazione di chinesina tale che il nucleotide marcato dall'uomo sia in eccesso molare da cinque a dieci volte rispetto ai siti di legame del nucleotide chinesina.

Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione sul fluorimetro a flusso arrestato a 365 nanometri e la lunghezza d'onda di emissione superiore a 400 nanometri con un filtro a passaggio lungo. Successivamente, partendo dalla concentrazione più bassa di Manta TP, utilizzare il fluorimetro a flusso arrestato per mescolare il TP della manta e la chinesina libera da nucleotidi in un rapporto volume/volume di uno a uno. Utilizzando la seguente formula, adattare la variazione della misura dell'intensità della fluorescenza per insegnare la concentrazione di mant A TP a una funzione esponenziale, più una linea di pendenza negativa costante per tenere conto del fotobleaching del gruppo mant.

Da questi accoppiamenti determinare una costante di velocità ad ogni concentrazione di mant. Un TP quindi devolve i tassi di associazione e dissociazione usando il filo interdentale contro la concentrazione di mant. A TP Quindi adattare questi dati a una funzione lineare per ottenere il gradiente e l'intercetta dell'asse y.

Il gradiente rappresenta la costante di velocità per l'uomo, un'associazione TP con unità per molare al secondo. L'intercetta rappresenta la costante del tasso di dissociazione con le unità al secondo. Per misurare la costante del tasso di dissociazione, fermentare un DP in una soluzione di due chinesine micromolari in un tampone adatto a 50.

Micromolare significava un'incubatrice DP a 25 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo aver utilizzato una colonna G 25 Sedex per rimuovere fre mant, A DP dalla chinesina, caricata con mant A DP, e aver impostato il fluter di arresto del flusso come descritto in precedenza in questo video, utilizzare il flusso arrestato per miscelare il complesso chinine mant A DP con un eccesso molare di 50 volte o superiore di A TP non marcato in un adattamento volume/volume uno-uno. La diminuzione dell'intensità della fluorescenza osservata nel tempo a una singola funzione esponenziale, più una linea di pendenza negativa costante per consentire il fotosbiancamento del gruppo.

Il kops determinato da questo adattamento è la costante di velocità per la dissociazione di mant A DP con unità di al secondo. L'entità della variazione del segnale al legame o alla dissociazione del nucleotide del legno del mantello dipende dalla particolare chinesina. Pertanto, è utile eseguire prima le misure di equilibrio per confermare sia la presenza che l'entità di una variazione di intensità della fluorescenza.

Gli spettri fluorescenti fermentano un TP e un DP sia in soluzione che in complesso della chinesina M CAC sono mostrati qui. Questa figura raffigura la reazione che si verifica mescolando un TP con la chinesina libera da nucleotidi. L'aumento dell'intensità della fluorescenza che si verifica dopo il legame dell'uomo A TP con M CAC è mostrato qui, adattando la costante di velocità rispetto all'uomo.

Una concentrazione di TP in una funzione lineare, come si vede qui, consente la deconvoluzione della costante di velocità che contribuisce a kops e fornisce il fermento di posizione di tasso di associazione e dissociazione A TP. Questa figura mostra la diminuzione dell'intensità della fluorescenza osservata nel fermento A DP dopo la dissociazione da M CEC, come illustrato qui. La costante di velocità per la dissociazione di mant A DP dalla chinesina è determinata adattando questi dati a una funzione esponenziale. Una volta padroneggiati, questi protocolli possono essere completati in meno di tre ore.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla chinesina, può anche essere applicato ad altre proteine leganti i nucleotidi, come la miosina e le proteine G. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare i nucleotidi marcati in fluorescenza e un flussometro di arresto per misurare la cinetica del legame e della dissociazione dei nucleotidi per una chinesina.