Regioselettiva Biolistic Targeting in Organotipica Fette cervello Utilizzando un Gene Gun Modificato

L'obiettivo di questa procedura è quello di trasfettare o marcare in modo rapido ed efficiente regioni distinte di fette organotipiche utilizzando una pistola genetica. Ciò si ottiene preparando prima fette organotipiche vitali del cervello o di altri tessuti. Il secondo passo consiste nel produrre DNA o particelle d'oro decodificate per la consegna biotica.

Successivamente, la fetta organotipica viene posta sotto un supporto per pistola genica stabilizzata e le particelle rivestite vengono sparate nel tessuto o nella trasformazione o marcatura episomiale. Il passo finale consiste nell'osservare o analizzare l'effetto di geni eterologhi consegnati alle regioni isolate. In definitiva, questo approccio consente all'utente di trasfettare con precisione regioni distinte delle fette d'organo con vari geni eterologhi.

Il vantaggio principale di questo metodo rispetto ai metodi esistenti è che la biologistica consente di trasfettare le cellule differenziate terminalmente, oltre a limitare il raggio d'azione a un piccolo diametro. Questo metodo può aiutare a comprendere le principali questioni neurobiologiche, come la comprensione del contributo regionale di un singolo gene. Inizia questa procedura inserendo un cervello fresco in un piccolo stampo ricevente.

Coprirlo con la soluzione ARO, che è stata chiamata a temperatura leggermente superiore a quella ambiente. Quindi raffreddare rapidamente lo stampo a quattro gradi Celsius posizionandolo sul ghiaccio. Quando l'aros è tramontato.

Dopo 5-10 minuti, rimuovere il cervello incorporato dallo stampo. Successivamente, incollalo sulla piattaforma dell'affettatrice per fibro. Successivamente trasferire la piattaforma nella camera di affettatura Vibra contenente PBS sterile ghiacciato.

Dopo l'affettatura, posizionare delicatamente le fette sugli inserti di coltura cellulare in un vassoio a sei pozzetti multipli con terreno di coltura all'esterno dell'inserto. Incubarli in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. In questa procedura, preparare i nano proiettili utilizzando particelle d'oro di 40 nanometri di diametro aggiungendo prima 50 microlitri di aina spermatica molare da 0,05 e 10 microlitri di DNA a un milligrammo per millilitro a 10 milligrammi di particelle d'oro.

Quindi aggiungere cloruro di calcio nella miscela di soluzione per favorire il legame delle molecole di DNA alle nanoparticelle d'oro. Successivamente, aspirare la soluzione nel tubo con una siringa. Posizionare il tubo nella stazione di preparazione del tubo.

Lascia che le particelle d'oro si depositino. Quindi rimuovere il supinato per aspirazione con una siringa. Ruotare il tubo per distribuire uniformemente le particelle d'oro.

Successivamente asciugare le particelle sotto un flusso costante di azoto a cinque litri al minuto. Per creare proiettili di DNA, tagliare il tubo in pezzi di un centimetro usando un tagliatubi. Quindi inserirli immediatamente nella cartuccia cresciuta geneticamente o tenerli essiccati a quattro gradi Celsius fino all'uso in una cappa a lamina sterile, caricare la cartuccia contenente l'oro rivestito di DNA nel supporto della cartuccia.

Quindi caricare il supporto nella pistola genetica. Attacca la canna della pistola genetica modificata ad essa usando una pinza sterile. Posizionare un inserto filtrante contenente una fetta organotipica in una capsula di plastica sterile.

Rimuovere il terreno dalla fetta organotipica. Quindi, impostare la pressione del gas a 50 PSI utilizzando il supporto. Posizionare la pistola genetica a una distanza di 10 millimetri sopra la regione desiderata della fetta per la consegna genetica.

Quindi mirare con attenzione al centro della canna e sparare le particelle rivestite nel tessuto. Dopo la trasfezione biotica, lavare delicatamente la fetta due volte con PBS. Quindi fissare la fetta incubando in PFA ghiacciato al 4% in PBS per 20 minuti.

Dopodiché, lavate la fetta due volte in PBS. Anche in questo caso, tagliare delicatamente la membrana dall'inserto utilizzando un bisturi senza disturbare la fetta. Posizionare quindi il supporto della membrana su un vetrino da microscopio con pinza e lasciare che la fetta organotipica si posi su di esso.

Quindi, aggiungere una goccia di supporto di montaggio sulla fetta. Posizionare delicatamente un vetrino coprioggetto senza alcuna forza direttamente a contatto con il fazzoletto. Successivamente, fissare il vetrino coprioggetto con un sottile strato di smalto per unghie.

Questa figura mostra la somministrazione biotica di DNA codificato con proteina fluorescente nella fetta organotipica di un topo di sei settimane. Come si può vedere qui, un neurone bikini con un notevole porto dendritico che si trova all'interfaccia tra lo strato bikini e lo strato molecolare del cervelletto mostra un'etichettatura pronunciata a seguito di trasfezione biotica transitoria con P-E-G-F-P-N. Qui c'è un ingrandimento maggiore dei dendriti con le spine, e qui c'è una cellula parametallica che si trova nella regione ca uno dell'ippocampo.

Dopo la somministrazione biotica della nanoparticella d'oro rivestita PDS Red FP Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in poche ore nel periodo di tre o quattro giorni successivi a questa procedura. Altri metodi, come la microscopia confocale, possono essere utilizzati per rispondere a domande aggiuntive, come ad esempio il modo in cui alcuni neuroni sono collegati alle regioni vicine.