Metodi di trasfezione neuronale
La trasfezione - il trasferimento di materiale genetico nelle cellule di mammifero - è uno strumento prezioso che consente agli scienziati di manipolare geneticamente i neuroni e il tessuto neuronale. Le proprietà uniche delle cellule delicate rendono la trasfezione impegnativa e richiedono tecniche specializzate.
Questo video esaminerà i principi alla base della trasfezione dei neuroni e introdurrà strategie comunemente utilizzate su queste cellule, tra cui nucleofezione, trasfezione biolistica e trasduzione virale. Infine, discuteremo le applicazioni delle tecniche di trasfezione nella ricerca sulle neuroscienze cellulari e molecolari.
Iniziamo rivedendo come funziona la trasfezione. Mentre il materiale genetico può essere consegnato in prossimità di una cellula coltivata aggiungendolo al mezzo circostante, i nucleotidi non possono penetrare in modo efficiente nelle membrane cellulari.
Tutti i protocolli di trasfezione sono progettati per consentire al materiale genetico di aggirare questa barriera. I nucleotidi che bloccano la produzione di proteine, come il silenziamento dell'RNA, possono immediatamente svolgere la loro funzione una volta entrati nel citoplasma. Tuttavia, i costrutti basati sul DNA devono essere trasportati nel nucleo per la traduzione prima che la sintesi proteica possa iniziare.
Nella divisione delle cellule, la rottura dell'involucro nucleare durante la mitosi può comportare l'incorporazione del DNA trasfettato nei nuclei delle cellule figlie riformanti. Poiché la maggior parte dei neuroni in coltura sono cellule post-mitotiche o non in divisione, sono necessari protocolli di trasfezione specializzati per indurre con successo l'espressione genica.
Iniziamo la nostra panoramica di questi protocolli con nucleofezione. Questa tecnica utilizza una combinazione di un campo elettrico indotto e reagenti chimici, che agiscono insieme per creare strutture transitorie simili a pori sia nelle membrane cellulari che in quella nucleare. Poiché i nucleotidi sono carichi, il campo elettrico guida anche il movimento del DNA attraverso i pori.
Per eseguire questa procedura, i neuroni in sospensione vengono raccolti in un pellet mediante centrifugazione prima della risuspensione nel reagente nucleofezione commerciale. La miscela cellulare viene quindi combinata con dna purificato e trasferita in una cuvetta di elettroporazione, che presenta due piastre di alluminio che entrano in contatto elettrico con l'apparato nucleofettatore. Questo dispositivo eroga una serie di impulsi elettrici rapidi, il cui numero e durata sono personalizzati in base al tipo di cella. Dopo la nucleofezione, le cellule possono essere diluite in terreno di coltura e placcate per una crescita continua.
In alternativa, la tecnica della pistola genetica esplode attraverso le barriere di trasfezione, sparando proiettili che trasportano materiale genetico attraverso le membrane cellulari e nucleari.
Per produrre proiettili di pistola genetica, il DNA che codifica il tuo gene di interesse viene precipitato su perle su scala micron, di solito composte da oro. Dopo un'incubazione di 10 minuti, le perle vengono lavate e trasferite in tubi. Il tubo viene quindi ruotato mentre la soluzione si asciuga, risultando in un rivestimento uniforme di perle. Successivamente, il tubo viene tagliato in cartucce e caricato nella pistola. La consegna a gas del carico genetico può essere eseguita su cellule che crescono in piastre di coltura standard con una semplice pressione del grilletto.
Infine, la trasduzione virale sfrutta il ciclo di vita virale per fornire materiale genetico estraneo nel nucleo. L'RNA che codifica per il gene di interesse è confezionato in retrovirus modificati noti come vettori lentivirali, che ottengono l'ingresso nelle cellule bersaglio legandosi a specifiche proteine di membrana, innescando un evento di fusione della membrana. L'RNA virale viene quindi trascritto inversamente in un filamento di DNA complementare che viene trasportato nel nucleo.
Prima di iniziare questa procedura, si noti che i virus possono infettare le cellule del corpo e quelle del piatto, quindi seguire le linee guida sulla sicurezza è estremamente importante.
Il primo passo è generare le particelle lentivirali che trasportano il tuo gene di interesse. Ciò si ottiene esprimendo gli elementi costitutivi del virus in una linea cellulare umana ottimizzata per la produzione virale, come le cellule 293T. Per evitare l'inutile diffusione di virus ingegnerizzati, i geni necessari per il loro assemblaggio sono tenuti separati dal vettore di trasferimento, la cui sequenza sarà inclusa nella particella infettiva.
Ci vogliono circa 2 giorni perché i virus completamente assemblati vengano rilasciati nel terreno di coltura, dove possono essere raccolti e concentrati mediante ultracentrifugazione. Successivamente, la concentrazione appropriata, o titolo, del virus viene determinata valutando il successo della trasduzione in una linea cellulare di prova. Il vettore lentivirale viene quindi aggiunto alla coltura neuronale bersaglio e in genere incubato per 24-48 ore per garantire che si sia verificata l'infezione.
Ora che hai familiarità con le tecniche di trasfezione comuni, quella che usi dipenderà dagli obiettivi specifici dei tuoi esperimenti. Diamo un'occhiata ad alcuni esempi.
Per iniziare, l'osservazione della maturazione dei neuroni in coltura consente un'analisi dettagliata dei cambiamenti morfologici che sono importanti per la connettività neuronale, come la formazione di spine dendritiche. Per visualizzare la morfologia cellulare nel tempo, questi ricercatori hanno fatto uso della nucleofezione per fornire una proteina fluorescente nei neuroni in coltura. Qui, una proteina tubulinica marcata con fluorescenza è stata trasfetta in un sottoinsieme di cellule, consentendo analisi dettagliate dei processi cellulari tramite microscopia a fluorescenza. Poiché i livelli di espressione sono stati mantenuti per tutta la vita del neurone, l'analisi morfologica potrebbe essere eseguita per almeno un mese in coltura.
La trasfezione può anche essere utilizzata per testare l'impatto di specifiche mutazioni genetiche sulla funzione neuronale. Una pistola genetica può essere utilizzata per fornire DNA che codifica per versioni wild type o mutanti di una proteina e gli impatti a breve termine sulla biologia cellulare possono essere valutati, ad esempio mediante la registrazione del patch clamp del fuoco dei neuroni.
Infine, una strategia comune per testare la funzione di un gene è osservare cosa succede alle cellule quando la sua espressione è bloccata. Per questi esperimenti, i vettori lentivirali possono essere utilizzati per fornire costrutti di RNA silenziante, che impediscono la sintesi proteica. In questo esperimento, l'abbattimento dei geni associati al morbo di Parkinson porta ad una significativa diminuzione della vitalità cellulare.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla trasfezione dei neuroni. In questo video abbiamo introdotto i principi della trasfezione neuronale, nonché le procedure e le applicazioni per tre strategie di trasfezione comuni.
Grazie per l'attenzione!
La trasfezione - il processo di trasferimento di materiale genetico nelle cellule - è un potente strumento per la manipolazione rapida ed efficiente d…
La trasfezione - il trasferimento di materiale genetico nelle cellule di mammifero - è uno strumento prezioso che consente agli scienziati di manipolare geneticamente i neuroni e il tessuto neuronale. Le proprietà uniche delle cellule delicate rendono la trasfezione impegnativa e richiedono tecniche specializzate.
Questo video esaminerà i principi alla base della trasfezione dei neuroni e introdurrà strategie comunemente utilizzate su queste cellule, tra cui nucleofezione, trasfezione biolistica e trasduzione virale. Infine, discuteremo le applicazioni delle tecniche di trasfezione nella ricerca sulle neuroscienze cellulari e molecolari.
Iniziamo rivedendo come funziona la trasfezione. Mentre il materiale genetico può essere consegnato in prossimità di una cellula coltivata aggiungendolo al mezzo circostante, i nucleotidi non possono penetrare in modo efficiente nelle membrane cellulari.
Tutti i protocolli di trasfezione sono progettati per consentire al materiale genetico di aggirare questa barriera. I nucleotidi che bloccano la produzione di proteine, come il silenziamento dell'RNA, possono immediatamente svolgere la loro funzione una volta entrati nel citoplasma. Tuttavia, i costrutti basati sul DNA devono essere trasportati nel nucleo per la traduzione prima che la sintesi proteica possa iniziare.
Nella divisione delle cellule, la rottura dell'involucro nucleare durante la mitosi può comportare l'incorporazione del DNA trasfettato nei nuclei delle cellule figlie riformanti. Poiché la maggior parte dei neuroni in coltura sono cellule post-mitotiche o non in divisione, sono necessari protocolli di trasfezione specializzati per indurre con successo l'espressione genica.
Iniziamo la nostra panoramica di questi protocolli con nucleofezione. Questa tecnica utilizza una combinazione di un campo elettrico indotto e reagenti chimici, che agiscono insieme per creare strutture transitorie simili a pori sia nelle membrane cellulari che in quella nucleare. Poiché i nucleotidi sono carichi, il campo elettrico guida anche il movimento del DNA attraverso i pori.
Per eseguire questa procedura, i neuroni in sospensione vengono raccolti in un pellet mediante centrifugazione prima della risuspensione nel reagente nucleofezione commerciale. La miscela cellulare viene quindi combinata con dna purificato e trasferita in una cuvetta di elettroporazione, che presenta due piastre di alluminio che entrano in contatto elettrico con l'apparato nucleofettatore. Questo dispositivo eroga una serie di impulsi elettrici rapidi, il cui numero e durata sono personalizzati in base al tipo di cella. Dopo la nucleofezione, le cellule possono essere diluite in terreno di coltura e placcate per una crescita continua.
In alternativa, la tecnica della pistola genetica esplode attraverso le barriere di trasfezione, sparando proiettili che trasportano materiale genetico attraverso le membrane cellulari e nucleari.
Per produrre proiettili di pistola genetica, il DNA che codifica il tuo gene di interesse viene precipitato su perle su scala micron, di solito composte da oro. Dopo un'incubazione di 10 minuti, le perle vengono lavate e trasferite in tubi. Il tubo viene quindi ruotato mentre la soluzione si asciuga, risultando in un rivestimento uniforme di perle. Successivamente, il tubo viene tagliato in cartucce e caricato nella pistola. La consegna a gas del carico genetico può essere eseguita su cellule che crescono in piastre di coltura standard con una semplice pressione del grilletto.
Infine, la trasduzione virale sfrutta il ciclo di vita virale per fornire materiale genetico estraneo nel nucleo. L'RNA che codifica per il gene di interesse è confezionato in retrovirus modificati noti come vettori lentivirali, che ottengono l'ingresso nelle cellule bersaglio legandosi a specifiche proteine di membrana, innescando un evento di fusione della membrana. L'RNA virale viene quindi trascritto inversamente in un filamento di DNA complementare che viene trasportato nel nucleo.
Prima di iniziare questa procedura, si noti che i virus possono infettare le cellule del corpo e quelle del piatto, quindi seguire le linee guida sulla sicurezza è estremamente importante.
Il primo passo è generare le particelle lentivirali che trasportano il tuo gene di interesse. Ciò si ottiene esprimendo gli elementi costitutivi del virus in una linea cellulare umana ottimizzata per la produzione virale, come le cellule 293T. Per evitare l'inutile diffusione di virus ingegnerizzati, i geni necessari per il loro assemblaggio sono tenuti separati dal vettore di trasferimento, la cui sequenza sarà inclusa nella particella infettiva.
Ci vogliono circa 2 giorni perché i virus completamente assemblati vengano rilasciati nel terreno di coltura, dove possono essere raccolti e concentrati mediante ultracentrifugazione. Successivamente, la concentrazione appropriata, o titolo, del virus viene determinata valutando il successo della trasduzione in una linea cellulare di prova. Il vettore lentivirale viene quindi aggiunto alla coltura neuronale bersaglio e in genere incubato per 24-48 ore per garantire che si sia verificata l'infezione.
Ora che hai familiarità con le tecniche di trasfezione comuni, quella che usi dipenderà dagli obiettivi specifici dei tuoi esperimenti. Diamo un'occhiata ad alcuni esempi.
Per iniziare, l'osservazione della maturazione dei neuroni in coltura consente un'analisi dettagliata dei cambiamenti morfologici che sono importanti per la connettività neuronale, come la formazione di spine dendritiche. Per visualizzare la morfologia cellulare nel tempo, questi ricercatori hanno fatto uso della nucleofezione per fornire una proteina fluorescente nei neuroni in coltura. Qui, una proteina tubulinica marcata con fluorescenza è stata trasfetta in un sottoinsieme di cellule, consentendo analisi dettagliate dei processi cellulari tramite microscopia a fluorescenza. Poiché i livelli di espressione sono stati mantenuti per tutta la vita del neurone, l'analisi morfologica potrebbe essere eseguita per almeno un mese in coltura.
La trasfezione può anche essere utilizzata per testare l'impatto di specifiche mutazioni genetiche sulla funzione neuronale. Una pistola genetica può essere utilizzata per fornire DNA che codifica per versioni wild type o mutanti di una proteina e gli impatti a breve termine sulla biologia cellulare possono essere valutati, ad esempio mediante la registrazione del patch clamp del fuoco dei neuroni.
Infine, una strategia comune per testare la funzione di un gene è osservare cosa succede alle cellule quando la sua espressione è bloccata. Per questi esperimenti, i vettori lentivirali possono essere utilizzati per fornire costrutti di RNA silenziante, che impediscono la sintesi proteica. In questo esperimento, l'abbattimento dei geni associati al morbo di Parkinson porta ad una significativa diminuzione della vitalità cellulare.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla trasfezione dei neuroni. In questo video abbiamo introdotto i principi della trasfezione neuronale, nonché le procedure e le applicazioni per tre strategie di trasfezione comuni.
Grazie per l'attenzione!
La trasfezione - il trasferimento di materiale genetico nelle cellule di mammifero - è uno strumento prezioso che consente agli scienziati di manipolare geneticamente i neuroni e il tessuto neuronale. Le proprietà uniche delle cellule delicate rendono la trasfezione impegnativa e richiedono tecniche specializzate.
Questo video esaminerà i principi alla base della trasfezione dei neuroni e introdurrà strategie comunemente utilizzate su queste cellule, tra cui nucleofezione, trasfezione biolistica e trasduzione virale. Infine, discuteremo le applicazioni delle tecniche di trasfezione nella ricerca sulle neuroscienze cellulari e molecolari.
Iniziamo rivedendo come funziona la trasfezione. Mentre il materiale genetico può essere consegnato in prossimità di una cellula coltivata aggiungendolo al mezzo circostante, i nucleotidi non possono penetrare in modo efficiente nelle membrane cellulari.
Tutti i protocolli di trasfezione sono progettati per consentire al materiale genetico di aggirare questa barriera. I nucleotidi che bloccano la produzione di proteine, come il silenziamento dell'RNA, possono immediatamente svolgere la loro funzione una volta entrati nel citoplasma. Tuttavia, i costrutti basati sul DNA devono essere trasportati nel nucleo per la traduzione prima che la sintesi proteica possa iniziare.
Nella divisione delle cellule, la rottura dell'involucro nucleare durante la mitosi può comportare l'incorporazione del DNA trasfettato nei nuclei delle cellule figlie riformanti. Poiché la maggior parte dei neuroni in coltura sono cellule post-mitotiche o non in divisione, sono necessari protocolli di trasfezione specializzati per indurre con successo l'espressione genica.
Iniziamo la nostra panoramica di questi protocolli con nucleofezione. Questa tecnica utilizza una combinazione di un campo elettrico indotto e reagenti chimici, che agiscono insieme per creare strutture transitorie simili a pori sia nelle membrane cellulari che in quella nucleare. Poiché i nucleotidi sono carichi, il campo elettrico guida anche il movimento del DNA attraverso i pori.
Per eseguire questa procedura, i neuroni in sospensione vengono raccolti in un pellet mediante centrifugazione prima della risuspensione nel reagente nucleofezione commerciale. La miscela cellulare viene quindi combinata con dna purificato e trasferita in una cuvetta di elettroporazione, che presenta due piastre di alluminio che entrano in contatto elettrico con l'apparato nucleofettatore. Questo dispositivo eroga una serie di impulsi elettrici rapidi, il cui numero e durata sono personalizzati in base al tipo di cella. Dopo la nucleofezione, le cellule possono essere diluite in terreno di coltura e placcate per una crescita continua.
In alternativa, la tecnica della pistola genetica esplode attraverso le barriere di trasfezione, sparando proiettili che trasportano materiale genetico attraverso le membrane cellulari e nucleari.
Per produrre proiettili di pistola genetica, il DNA che codifica il tuo gene di interesse viene precipitato su perle su scala micron, di solito composte da oro. Dopo un'incubazione di 10 minuti, le perle vengono lavate e trasferite in tubi. Il tubo viene quindi ruotato mentre la soluzione si asciuga, risultando in un rivestimento uniforme di perle. Successivamente, il tubo viene tagliato in cartucce e caricato nella pistola. La consegna a gas del carico genetico può essere eseguita su cellule che crescono in piastre di coltura standard con una semplice pressione del grilletto.
Infine, la trasduzione virale sfrutta il ciclo di vita virale per fornire materiale genetico estraneo nel nucleo. L'RNA che codifica per il gene di interesse è confezionato in retrovirus modificati noti come vettori lentivirali, che ottengono l'ingresso nelle cellule bersaglio legandosi a specifiche proteine di membrana, innescando un evento di fusione della membrana. L'RNA virale viene quindi trascritto inversamente in un filamento di DNA complementare che viene trasportato nel nucleo.
Prima di iniziare questa procedura, si noti che i virus possono infettare le cellule del corpo e quelle del piatto, quindi seguire le linee guida sulla sicurezza è estremamente importante.
Il primo passo è generare le particelle lentivirali che trasportano il tuo gene di interesse. Ciò si ottiene esprimendo gli elementi costitutivi del virus in una linea cellulare umana ottimizzata per la produzione virale, come le cellule 293T. Per evitare l'inutile diffusione di virus ingegnerizzati, i geni necessari per il loro assemblaggio sono tenuti separati dal vettore di trasferimento, la cui sequenza sarà inclusa nella particella infettiva.
Ci vogliono circa 2 giorni perché i virus completamente assemblati vengano rilasciati nel terreno di coltura, dove possono essere raccolti e concentrati mediante ultracentrifugazione. Successivamente, la concentrazione appropriata, o titolo, del virus viene determinata valutando il successo della trasduzione in una linea cellulare di prova. Il vettore lentivirale viene quindi aggiunto alla coltura neuronale bersaglio e in genere incubato per 24-48 ore per garantire che si sia verificata l'infezione.
Ora che hai familiarità con le tecniche di trasfezione comuni, quella che usi dipenderà dagli obiettivi specifici dei tuoi esperimenti. Diamo un'occhiata ad alcuni esempi.
Per iniziare, l'osservazione della maturazione dei neuroni in coltura consente un'analisi dettagliata dei cambiamenti morfologici che sono importanti per la connettività neuronale, come la formazione di spine dendritiche. Per visualizzare la morfologia cellulare nel tempo, questi ricercatori hanno fatto uso della nucleofezione per fornire una proteina fluorescente nei neuroni in coltura. Qui, una proteina tubulinica marcata con fluorescenza è stata trasfetta in un sottoinsieme di cellule, consentendo analisi dettagliate dei processi cellulari tramite microscopia a fluorescenza. Poiché i livelli di espressione sono stati mantenuti per tutta la vita del neurone, l'analisi morfologica potrebbe essere eseguita per almeno un mese in coltura.
La trasfezione può anche essere utilizzata per testare l'impatto di specifiche mutazioni genetiche sulla funzione neuronale. Una pistola genetica può essere utilizzata per fornire DNA che codifica per versioni wild type o mutanti di una proteina e gli impatti a breve termine sulla biologia cellulare possono essere valutati, ad esempio mediante la registrazione del patch clamp del fuoco dei neuroni.
Infine, una strategia comune per testare la funzione di un gene è osservare cosa succede alle cellule quando la sua espressione è bloccata. Per questi esperimenti, i vettori lentivirali possono essere utilizzati per fornire costrutti di RNA silenziante, che impediscono la sintesi proteica. In questo esperimento, l'abbattimento dei geni associati al morbo di Parkinson porta ad una significativa diminuzione della vitalità cellulare.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla trasfezione dei neuroni. In questo video abbiamo introdotto i principi della trasfezione neuronale, nonché le procedure e le applicazioni per tre strategie di trasfezione comuni.
Grazie per l'attenzione!
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Q1: Why do neurons require specialized transfection techniques compared to other mammalian cells?
Most cultured neurons are post-mitotic, or non-dividing cells, unlike rapidly dividing cells where the nuclear envelope breaks down during mitosis to incorporate transfected DNA. This unique property of mature neurons necessitates specialized protocols that can directly deliver genetic material across both cell and nuclear membranes without relying on cell division to facilitate DNA entry into the nucleus.
Q2: How does nucleofection enable genetic material to cross neuronal cell membranes?
Nucleofection combines an induced electrical field with chemical reagents to create transient pore-like structures in both cell and nuclear membranes. Since nucleotides are charged, the electric field drives DNA movement through these pores. Neurons are collected in a pellet, resuspended in commercial nucleofection reagent, mixed with purified DNA, and transferred to an electroporation cuvette where rapid electrical pulses are delivered.
Q3: What is the process for preparing gene gun bullets for biolistic transfection?
DNA encoding the gene of interest is precipitated onto micron-scale gold beads and incubated for 10 minutes. The beads are then washed and transferred into tubing that is rotated as the solution dries, creating a uniform coating. The tubing is cut into cartridges and loaded into the gene gun for gas-powered delivery through cell and nuclear membranes.
Q4: How do lentiviral vectors deliver genetic material into neuronal nuclei?
Lentiviral vectors are modified retroviruses that gain entry into target cells by binding to specific membrane proteins, triggering membrane fusion. The viral RNA is reverse transcribed into complementary DNA and transported into the nucleus. Lentiviral particles are generated by expressing viral building blocks in optimized cell lines like 293T cells, then collected and concentrated by ultracentrifugation before adding to target neuronal cultures.
Q5: How can transfection be used to visualize neuronal morphology changes in culture?
Researchers use nucleofection to deliver fluorescent proteins, such as fluorescently-tagged tubulin, into cultured neurons. This allows detailed analysis of morphological changes important for neuronal connectivity, like dendritic spine formation. Because expression levels are maintained throughout the neuron's lifetime, morphological analysis via fluorescence microscopy can be performed for extended periods, such as at least one month in culture.
Q6: What are the advantages of using lentiviral vectors for gene silencing studies in neurons?
Lentiviral vectors can deliver silencing RNA constructs that prevent protein synthesis, allowing researchers to observe cellular effects when gene expression is blocked. This approach is particularly useful for functional studies, such as knockdown of genes associated with Parkinson's disease, which can reveal impacts on cell viability and other cellular processes relevant to an introduction to cellular and molecular neuroscience research.
Q7: How can gene gun transfection be used to assess the impact of genetic mutations on neuronal function?
A gene gun delivers DNA encoding wild-type or mutant versions of a protein into neurons, enabling short-term assessment of cellular effects. Researchers can evaluate impacts on neuronal function using techniques like patch clamp electrophysiology principle applications to measure changes in neuron firing patterns and other electrophysiological properties resulting from the mutation.
Capitoli in questo video
0:00
Overview
0:49
Principles of Transfection
1:57
Nucleofection
3:07
Gene Gun Transfection
4:03
Viral Transduction
5:53
Applications
7:40
Summary